柞蚕丝素蛋白生物医用材料及其制备方法

摘要

本发明公开一种生物医学工程材料及其制备方法，特别涉及一种细胞易黏附生长的三维组织修复材料及其制备方法，属生物医用材料技术领域。它以天然柞蚕丝为原料，柞蚕丝素蛋白溶解后，采用静电纺丝方法，得到柞蚕丝素蛋白纤维构成的三维无纺网状结构，纤维直径为50nm～20μm，纤维间孔隙为1～500μm，无纺网厚度为50nm～20mm；柞蚕丝素的分子量为10×104～20×105D。这种生物医学工程材料具有无毒无害，生物相容性良好，细胞黏附生长性能优良的特点，且原料丰富，成本低廉，可望代替高成本的胶原等生物医用材料，用作人工皮肤、肌腱、软骨、硬脑膜等修复材料，特别是组织细胞诱导材料。

说明书

                        技术领域

本发明涉及一种生物医学工程材料及其制备方法，特别涉及一种细胞易黏附生长的三维组织修复材料及其制备方法，属生物医用材料技术领域。

                        背景技术

柞蚕丝含有大量的Arg-Gly-Asp(精氨酸-乙氨酸-天门冬氨酸，RGD)三肽序列，并且经证明该序列对细胞的黏附有利[Minoura N，Aiba S，Gotoh Y，Tsukada M，Imai Y.Attachment and growth of fibroblast cells on silkfibroin.Biochem Biophys Res Commun，1995，208(2)：511-516；PierschbacherMD，Ruoslahti E，[J].Nature，1984，(309)：30-33；Pierschbacher MD，RuoslahtiE.Pro Natl Acad Sci USA，1984，(81)：5985-5988]。这一点在Sofia[Sofia S，McCarthy MB，Gronowic G，et.al.Biomed Mater Res，2001，(54)：139-148.]等的体外细胞培养实验中得以证明。上述公开的研究内容表明，将材料用RGD共价修饰时，细胞在材料上的活性增强，并且促进了类成骨细胞的矿质化，增强了体外骨骼形成的诱导。因此柞蚕丝素有望在作为细胞培养基质、伤口覆盖膜、人造皮肤及组织工程支架材料和生物医用材料改性等方面形成较大的应用研究成果。

柞蚕是我国的优势资源，柞蚕丝由约80％以上的丝素和不到20％的丝胶所组成，是相当纯的天然蛋白纤维，丝素的氨基酸组成与人体胶原蛋白有一定的相似性，无毒性、无刺激作用、具有良好的生物相容性。因此，柞蚕丝丝素是制备生物医用制品的较理想原料，但由于天然柞蚕丝直径为20μm以上，且较难塑型，所以，天然柞蚕丝素在生物医学领域的应用范围受到很大局限。

天然柞蚕丝素纤维大分子链间有很强的相互作用，含有二硫键，比桑蚕丝素更难溶解，一般溶解桑蚕丝素的溶剂很难溶解柞蚕丝素。在本发明作出之前，题为“柞蚕丝素肽生产技术研究”[辽宁丝绸2001，(3)：34-35]一文中，公开了一种将柞蚕丝溶解于磷酸溶液中制得柞蚕丝素肽的方法；公开号为CN1415626A的中国发明专利“柞蚕丝素肽制取方法”中，也公开了一种将柞蚕丝加入到磷酸中，在100～130℃的温度条件下溶解8～10h，制备柞蚕丝素肽的技术方案。采用上述技术方案的原理是丝素蛋白在部分强酸的作用下发生水解断链，使分子量大大降低，生成分子量约在200～5000D的丝素肽，适用于食品和化妆品领域。但由于分子量太小的原因，无法满足制备生物医用材料三维支架塑形和力学性能的要求。

                        发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种能满足三维支架塑形和力学性能要求、有利于细胞黏附生长的柞蚕丝素蛋白生物医用材料及其制备方法。

本发明采用的技术方案是：一种柞蚕丝素蛋白生物医用材料，它是柞蚕丝素蛋白纤维构成的三维无纺网状结构，纤维直径为50nm～20μm，纤维间孔隙为1～500μm，无纺网厚度为50nm～20mm；它含有10～100％重量的分子量为10×10⁴～20×10⁵D的柞蚕丝素蛋白。

上述技术方案中，余量为添加剂；所述的添加剂为纯桑蚕丝素蛋白、聚乳酸或聚乙烯醇、聚乙二醇、聚羟基乙酸、聚几内酯、纤维素、甲壳素、壳聚糖、胶原、明胶中的一种或它们的组合。

上述柞蚕丝素蛋白生物医用材料的制备方法，先将柞蚕丝脱胶，得到纯柞蚕丝素，再进行如下步骤的加工：

①按重量比，硫氰酸锂∶巯基乙醇∶尿素＝80～98∶1～10∶1～10制成三元溶液，将纯柞蚕丝素置于上述三元溶液中，在温度为40～100℃的条件下溶解5～70h，提纯后制得纯柞蚕丝素蛋白水溶液，再经干燥，得到分子量为10×10⁴～20×10⁵D的柞蚕丝素蛋白；

②将纺丝原液的溶质在溶剂中溶解，溶液终浓度为6～30％，制成纺丝原液；所述纺丝原液的溶质中，含有10～100％重量的步骤①获得的柞蚕丝素蛋白；所述的溶剂为甲酸、六氟异丙醇中的一种；

③将上述纺丝原液采用静电纺丝工艺，制得以柞蚕丝素蛋白纤维构成的三维无纺网状结构的生物医用材料。

上述技术方案中，所述纺丝原液的溶质中，余量为添加剂；所述的添加剂是纯桑蚕丝素蛋白、聚乳酸或聚乙烯醇、聚乙二醇、聚羟基乙酸、聚几内酯、纤维素、甲壳素、壳聚糖、胶原、明胶中的一种或它们的组合。

本发明技术方案所述的溶剂为甲酸时，甲酸溶液浓度为60～99％，溶解温度为20～80℃，溶解时间为0.5～5h。所述的溶剂为六氟异丙醇时，溶解温度为20～50℃，溶解时间为24～240h。

与现有技术相比，本发明的优点是：

(1)本发明以柞蚕丝素蛋白为主要原料，保留了天然柞蚕丝素蛋白质良好的生物相容性的优点；具有的三维无纺网状结构形式，可直接用于体内外组织细胞的培养和修复，是理想的组织细胞诱导生物医用材料。

(2)本发明所提供的三元溶液，较好地解决了柞蚕丝素纤维难溶解的难题，得到了分子量在10×10⁴～20×10⁵D的柞蚕丝素蛋白，能满足制备组织修复材料三维支架塑形和力学性能的要求，为生物医用材料提供了丰富的原料。

(3)本发明提供的柞蚕丝素蛋白能与其它生物材料共混，有利于充分发挥各材料的特性，构建适合各种人体的组织修复材料。

                        附图说明

图1是按本发明技术方案制备的柞蚕丝素蛋白溶液的凝胶电泳图谱，其中，Marker1、Marker2为标样，泳道1样品是浓度为0.75％的柞蚕丝素蛋白水溶液，泳道2样品是浓度为1.5％的柞蚕丝素蛋白水溶液，泳道3样品是浓度为2％的柞蚕丝素蛋白水溶液，泳道4样品是浓度为3％的柞蚕丝素蛋白水溶液。

图2是按本发明技术方案制备的柞蚕丝素蛋白纤维构成的三维无纺网状结构生物医用材料的扫描电镜图。

                    具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

1、将0.6公斤下脚柞蚕丝(缫丝厂副产品)放入10升浓度为0.05％的碳酸钠水溶液中，煮沸0.5小时，重复处理三次，脱尽丝素外围的丝胶，得到纯柞蚕丝丝素；

2、将自然晾干后的纯柞蚕丝丝素，放入到按重量比硫氰酸锂∶巯基乙醇∶尿素按重量比为80∶5∶5的三元溶液中、在60℃的温度条件下溶解20小时，经过滤、超滤提纯，超声波消泡1小时、干燥后制成纯柞蚕丝素蛋白；

3、将纯柞蚕丝素蛋白置于甲酸溶液中，在温度为30℃的条件下溶解4小时，溶液终浓度为10％，经过滤、提纯，消泡后制成纺丝原料；

4、采用静电纺丝方法，接收板到喷丝口距离为10cm，电压为10KV，对上述纺丝原液进行喷纺，获得纯柞蚕丝素蛋白纤维构成的三维无纺网状结构的生物医用材料。

参见附图1，它是按本实施例技术方案制备的柞蚕丝素蛋白溶液的凝胶电泳图谱，其中，Marker1、Marker2为标样，泳道1样品是浓度为0.75％的柞蚕丝素蛋白水溶液，泳道2样品是浓度为1.5％的柞蚕丝素蛋白水溶液，泳道3样品是浓度为2％的柞蚕丝素蛋白水溶液，泳道4样品是浓度为3％的柞蚕丝素蛋白水溶液。由图1可以看到，对照标样，柞蚕丝素蛋白溶液的分子量分布在100000～2000000D之间，还有部分大于2000000D，分子量较大的柞蚕丝素蛋白原材料可满足制备生物医用材料三维支架塑形和力学性能的要求。

实施例二：

1、将1公斤茧层放入20升浓度为0.5％的中性皂溶液中，煮沸2小时，脱尽丝素外围的丝胶，热水充分洗涤后得到纯柞蚕丝丝素；

2、将干燥后的纯柞蚕丝丝素置于按重量比硫氰酸锂∶巯基乙醇∶尿素＝85∶5∶10的三元溶液中，在温度为40℃的条件下经50小时处理，溶解成柞蚕丝素蛋白溶液，经过滤、透析提纯、干燥成纯柞蚕丝素蛋白；

3、将按质量比为90∶10的纯柞蚕丝素蛋白和聚乳酸，置于浓度为80％的甲酸溶液中，在温度为50℃的条件下溶解2小时，经过滤提纯，消泡后制成溶液终浓度为10％的纺丝原液；

4、采用静电纺丝法，按照常规条件对上述纺丝原液进行喷纺，获得柞蚕丝素含量为90％的三维无纺网。

参见附图2，按本实施例技术方案制备的柞蚕丝素蛋白纤维构成的三维无纺网结构生物医用材料，在16KV12cm放大5千倍的扫描电镜图，图中纤维经50次概算直径约为0.62μm，孔径在1.61～3.62μm之间。按本发明技术方案，通过控制纺丝原液的终浓度和静电纺丝工艺，可以得到纤维直径为50nm～20μm，纤维间孔隙为1～500μm，无纺网厚度为50nm～20mm的柞蚕丝素蛋白纤维构成的三维无纺网结构生物医用材料。

实施例三：

1、按实施例一中步骤1的方法制备纯柞蚕丝丝素；

2、将干燥后的纯柞蚕丝丝素在按重量比硫氰酸锂∶巯基乙醇∶尿素＝98∶1∶1的溶液中，在温度为80℃的条件下处理5小时，溶解后得到柞蚕丝素蛋白溶液，经过滤、提纯、干燥成纯柞蚕丝素蛋白；

3、将按质量比为80∶20的纯柞蚕丝素蛋白和明胶置于六氟异丙醇溶液中，在温度为20℃的条件下溶解150小时，经过滤、提纯，消泡后制成溶液终浓度为5％的纺丝原料；

4、用静电纺丝方法，在收板到喷丝口距离为15cm，电压15KV对上述纺丝原液进行喷纺，获得柞蚕丝素含量为80％、明胶含量为20％的纤维构成的三维无纺网结构的生物医用材料。

按本发明提供的技术方案制备的柞蚕丝素蛋白纤维结构的三维无纺网状生物医用材料，不仅保留了天然柞蚕丝素的蛋白质具有良好的生物相容性的特性，且原料丰富，成本低廉。特别是它的组织细胞诱导功能，可望用于代替高成本的胶原等生物医用材料，作为人工皮肤，肌腱、血管、软骨、韧带、食道、硬脑膜等修复用支架材料或外科修复材料。