用酯酶活性来检测无乳链球菌的方法

摘要

本发明涉及使用含有至少一种酯酶酶促底物的反应培养基来特异性检测和鉴定无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的方法。

说明书

本发明涉及检测和鉴定无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)的领域。更具体地，本发明涉及使用酯酶底物，任选与至少一种α-葡糖苷酶底物、磷酸酶底物、β-纤维二糖糖苷酶底物或N-乙酰基-氨基葡糖苷酶底物相组合地，用于检测和鉴定无乳链球菌的用途。

链球菌属(Streptococcus)包括在自然界中、在人和动物的皮肤和粘膜上十分普遍的许多物种，并且是造成复性感染的原因。它们是普遍存在的细菌，其在外界环境(土壤、空气、水)中以游离状态存在，在人和动物中以腐生状态或共生状态存在。对于A、C、G和H群链球菌和唾液链球菌(Streptococcus salivarius)，它们位于鼻咽内，D群粪链球菌位于肠内，以及B群链球菌位于阴道腔内。它们的致病作用十分不同，并且取决于所牵涉的菌种和它们在生物体中的位置。

链球菌是革兰氏阳性球菌，直径0.5-1μm，表现为聚集成小链的形式，并且是静止的。它们为过氧化氢酶阴性，具有发酵代谢，它们任选为厌氧性的并且对温度(最佳生长温度为37℃)变化和pH(最佳pH为7)变化敏感。

无乳链球菌(或链球菌B)被认为在牛科动物中是引起乳腺炎的主要传染剂之一。在人中，它基本上是女性生殖道(阴道)的腐生物，但是其也存在于鼻咽中和肠中，特别是存在于直肠中。在成人中，菌株建群(colonisation)常常保持无症状，但是无乳链球菌可以是引起败血病、肺炎、脑膜炎、关节炎、尿路感染和深度化脓的原因。在孕妇或分娩后的妇女中，感染可以导致子宫内膜炎和不育。

在新生儿中，污染发生在子宫内或更普遍地是发生在分娩时，这是由于吸入羊水或阴道分泌物。早期感染常常在从分娩后就发生或在生活的最初几小时内发生。早产、膜破裂和母亲阴道内强的菌株建群促进早期感染。这种类型的感染的死亡率十分高(＞50％)。晚期感染通常表现为脑膜炎(婴儿脑膜炎)和关节炎。

特别是由于其患病率(在法国为10％，即至少75000位孕妇/年)以及由于其在足月分娩时引起的后果，这已成为公众健康问题，因而建议在妊娠期结束时进行关于携带无乳链球菌的系统筛选，理想地是在闭经的34和38周(妊娠的35-37周)之间进行。

选择性培养基和/或使得能够指导诊断的培养基可商业获得。然而，这些培养基具有缺点，即它们本身不足以用于诊断无乳链球菌并且必需进行补充的测试，例如证明存在兰斯菲尔德氏的B群抗原(主要存在鼠李糖的多糖)，和马尿酸的水解(马尿酸液体培养基)。

最常使用的选择性培养基是Todd-Hewitt液体培养基，其为用于在孕妇中搜寻B群链球菌的富集液体培养基。这种液体培养基含有抑制伴生菌丛中的大多数革兰氏阴性微生物的不同抗生素，例如萘啶酸(acide nalixidique)和庆大霉素，或萘啶酸、多粘菌素和结晶紫。

在富集步骤之后，必须将所述补充了抗生素的Todd-Hewitt液体培养基移种至用于搜寻链球菌的培养基上(参见CDC(Center forDisease Control)的建议，MMWR(Morbidity and Mortality WeeklyReport)，August 16，2002，Vol.51，No.RR-11)。

Lim培养基是Todd-Hewitt液体培养基的变体，它含有1％的酵母提取物、萘啶酸和粘菌素。

也可以使用含有5％血液的Columbia琼脂，其使得能够特别是证明无乳链球菌的β-溶血特性。然而，这种特性不总是明显的：菌落周围的溶血环可能是窄的，更确切地这是α-溶血，或甚至是γ-溶血的表象。相反地，如果在无乳链球菌菌落附近存在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌落，那么该特性就会变得清楚(Camp-Factor)。

这些选择性培养基的缺点是它们必须补充进行生物化学测试和/或免疫学测试。

目前，唯一可商业获得的、随时可用的、使得能够直接从直肠-阴道取样物分离和鉴定无乳链球菌的选择性培养基是Granada培养基(Biolys SA)。这种培养基具有促进由无乳链球菌菌株产生类胡萝卜素色素的特性，该色素的产生是由于在该培养基中存在可溶性淀粉、蛋白胨No.3、葡萄糖、丙酮酸钠、硫酸镁、甲氨蝶呤、粘菌素、结晶紫、琼脂、马血清、无水Na₂HPO₄、甲硝唑、MOPS(吗啉代丙烷磺酸)半-钠盐和蒸馏水并且在厌氧条件下孵育。因而，这种培养基具有这样的缺点，即直接检测无乳链球菌是在厌氧条件下进行的，这不易于实施。而且，不可获得含有一种或多种酶促底物的检测培养基。

完全出乎意料，本申请人现已证实，有可能利用酶促底物，特别是酯酶酶促底物，来特异性检测和鉴定无乳链球菌。

这是因为，令人惊奇地，本申请人已经证明，在以相关的方式最常遇到的最近的细菌物种中，仅无乳链球菌在早期(至少孵育后18小时)不能利用酯酶的酶促底物，这样它们是唯一不能在早期通过酯酶底物来揭示的，例如在早期在培养基中的菌落没有改变，例如当用生色性酯酶底物时培养基中菌落的着色没有改变，而在反应培养基中着色没有扩散因而保持集中在菌落处，但是这些分子对这些细菌的生长没有任何有害的影响。

因此，这种酶促底物具有额外的优点，即可以较早地以具有十分好的对照的方式读取结果，特别是在孵育大约18-20小时的时候。

因而，本发明的主题是用于特异性检测和鉴定无乳链球菌的方法，其特征在于，使用含有至少一种酯酶酶促底物的反应培养基。

适于本发明目的的酯酶酶促底物是使得能够证明这样的酶促活性的本领域技术人员已知的任何底物。这样的底物可以例如为生色的或产生荧光的，并例如描述于BIOSYNTH的目录，Substrates andReagents或www.biosynth.com中，或描述于GLYCOSYNTH的目录，enzyme substrates catalogue或www.glycosynth.co.uk中。

作为酯酶底物的实例，可提及的是吲哚酚辛酸酯、吲哚酚壬酸酯或吲哚酚癸酸酯的衍生物，优选吲哚酚辛酸酯衍生物，更优选它们的卤代衍生物，更优选氯代或溴代衍生物，例如可特别早地进行读取的5-溴-6-氯-3-吲哚酚辛酸酯和5-溴-4-氯-3-吲哚酚辛酸酯。

因为在24小时的孵育后观察到轻微的酯酶活性(在0-4的标度上，活性低于0.6)，无乳链球菌的检测可以通过加入至少一种其他酶促底物来改善。由于无乳链球菌不利用酯酶底物或很少利用酯酶底物的特殊性质，因而不能区分其他酶促底物是否被无乳链球菌和其他菌种利用。而且，由于无乳链球菌仅十分少地利用酯酶底物，从而这仅稍微改变获得的菌落的外观，我们将只在随后的内容中表明无乳链球菌不能利用酯酶底物。

因而，根据一个实施方案，本发明方法使用还含有不同于酯酶底物的其他酶促底物的反应培养基。

适于本发明目的的除了酯酶底物之外的酶促底物(非酯酶底物)是任意底物，即菌株对所述底物的利用使菌落产生与当使用所述酯酶底物时所获得的外观不同的外观。这种不同的外观例如是不同的着色。此外，这种非酯酶底物是这样的底物，即当菌株同时利用这种非酯酶底物和所述酯酶底物(不同于无乳链球菌的菌株)时，所获得的菌落的外观(例如它们的显着色)也不同于无乳链球菌菌落的外观。这是因为，当在反应培养基中同时组合酯酶底物和可由无乳链球菌菌株利用的非酯酶底物时，所述的无乳链球菌菌株则对所述酯酶是阴性的而对所述非酯酶底物是阳性的(它们可以标记为-/+，该式的第一部分相应于所述酯酶底物，而第二部分相应于所述非酯酶底物)，而其他菌株或者仅能利用所述酯酶底物(它们为+/-)，或者能同时利用所述酯酶底物和所述非酯酶底物(它们为+/+)。类似地，当在反应培养基中同时组合酯酶底物和不能被无乳链球菌菌株利用的非酯酶底物时，则无乳链球菌菌株对所述酯酶是阴性的并对所述非酯酶底物是阴性的(它们为-/-)，而其他菌株或者仅能利用所述酯酶底物(它们为+/-)，或者能同时利用所述酯酶底物和所述非酯酶底物(它们为+/+)。总而言之，无乳链球菌菌株总是-/+或-/-，而其他菌种总是+/-或+/+。

因而，例如，如果将生色的酯酶底物(当所考虑的菌落利用所述底物时，该酯酶底物引起所述菌落呈蓝色着色)与另一生色的酶促底物(当所考虑的菌落利用所述底物时，该酶促底物引起所述菌落呈粉红色着色)相组合，则可以获得四种类型的着色：或者粉红色，或者无色至轻微蓝色，或者蓝色，或者紫色(粉红色+蓝色)。粉红色着色和无色至轻微蓝色外观仅代表无乳链球菌：或者菌株能利用所述非酯酶底物从而菌落变成粉红色(-/+菌株)，或者其不能利用所述非酯酶底物从而菌落保持无色或变成轻微蓝色(-/-菌株)。蓝色和紫色着色代表其他菌种：或者所述菌株仅能利用所述酯酶底物从而其变成蓝色(+/-菌株)，或者所述菌株能同时利用所述酯酶底物和所述其他酶促底物从而其变成粉红色加蓝色，即紫色(+/+菌株)。

类似地，如果将吸收荧光的酯酶底物(当所考虑的菌落利用所述底物时，该酯酶底物导致荧光猝灭)与另一发荧光的酶促底物(当所考虑的菌落利用所述底物时，该酶促底物在所述菌落处引起荧光)相组合(后一种底物被无乳链球菌利用)，则可以获得两种类型的菌落：或者有荧光的菌落，或者有弱荧光至无荧光的菌落。有荧光的菌落仅代表无乳链球菌，因为这种菌种仅能利用除了酯酶底物之外的酶促底物。有弱荧光至无荧光的菌落代表其他菌种：或者所述菌株能利用所述酯酶底物从而其无荧光，或者所述菌株能同时利用所述酯酶底物和所述其他酶促底物从而其有弱荧光至无荧光。

适于本发明目的的除了酯酶底物之外的这样的底物的实例包括α-葡糖苷酶底物、磷酸酶底物、β-纤维二糖糖苷酶底物、N-乙酰基-氨基葡糖苷酶底物和β-葡糖苷酶底物。

因而，根据另一实施方案，本发明的方法使用这样的反应培养基作为反应培养基，即所述反应培养基除了酯酶底物外还含有至少一种选自α-葡糖苷酶底物、磷酸酶底物、β-纤维二糖糖苷酶底物、N-乙酰基-氨基葡糖苷酶底物和β-葡糖苷酶底物的酶促底物。

含有或由酯酶底物和至少一种选自α-葡糖苷酶底物、磷酸酶底物和β-纤维二糖糖苷酶底物的酶促底物组成的反应培养基是新的，并且构成了本发明的另一主题。

适于本发明目的的α-葡糖苷酶酶促底物是使得能够证明这样的酶促活性的本领域技术人员已知的任何底物。这样的底物可以例如为生色的或产生荧光的，并例如描述于BIOSYNTH的目录，Substrates andReagents或www.biosynth.com中，或描述于GLYCOSYNTH的目录，enzyme substrates catalogue或www.glycosynth.co.uk中。

作为α-葡糖苷酶底物的实例，可以提及基于吲哚酚衍生物的底物、基于伞形酮衍生物的底物和基于萘酚衍生物的底物。

优选地，适于本发明目的的α-葡糖苷酶酶促底物是基于吲哚酚衍生物的底物。

这样的吲哚酚衍生物的实例包括3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷的衍生物，优选这些化合物的卤代衍生物。作为3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷的卤代衍生物的实例，可提及6-溴-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-α-D-吡喃葡糖苷和6-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷，最后一个化合物是特别优选的。

适于本发明目的的磷酸酶酶促底物是使得能够证明这样的酶促活性的本领域技术人员已知的任何底物。这样的底物可以例如为生色的或产生荧光的，并例如描述于BIOSYNTH的目录，Substrates andReagents或www.biosynth.com中。

作为磷酸酶底物的实例，可以提及基于吲哚酚衍生物的底物、基于伞形酮衍生物的底物和基于硝基苯(nitrophényle)的底物。

优选地，适于本发明目的的磷酸酶酶促底物是基于吲哚酚衍生物的底物。

这样的吲哚酚衍生物的实例包括3-吲哚基-磷酸酯的衍生物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯和6-氯-3-吲哚基-磷酸酯，最后一个化合物是特别优选的。

适于本发明目的的β-纤维二糖糖苷酶酶促底物是使得能够证明这样的酶促活性的本领域技术人员已知的任何底物。这样的底物可以例如为生色的或产生荧光的，并例如描述于BIOSYNTH的目录，Substrates and Reagents或www.biosynth.com中，或描述于GLYCOSYNTH的目录，enzyme substrates catalogue或www.glycosynth.co.uk中。

作为β-纤维二糖糖苷酶底物的实例，可以提及基于吲哚酚衍生物的底物、基于伞形酮衍生物的底物和基于硝基苯的底物。

优选地，适于本发明目的的β-纤维二糖糖苷酶酶促底物是基于吲哚酚衍生物的底物。

这样的吲哚酚衍生物的实例包括3-吲哚基-β-D-纤维二糖糖苷的衍生物，例如6-氯-3-吲哚基-β-D-纤维二糖糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-纤维二糖糖苷，最后一个化合物是特别优选的。

适于本发明目的的N-乙酰基-氨基葡糖苷酶酶促底物是使得能够证明这样的酶促活性的本领域技术人员已知的任何底物。这样的底物可以例如为生色的或产生荧光的，并例如描述于BIOSYNTH的目录，Substrates and Reagents或www.biosynth.com中，或描述于GLYCOSYNTH的目录，enzyme substrates catalogue或www.glycosynth.co.uk中。

作为N-乙酰基-氨基葡糖苷酶底物的实例，可以提及基于吲哚酚衍生物的底物、基于伞形酮衍生物的底物和基于硝基苯的底物。

优选地，适于本发明目的的N-乙酰基-氨基葡糖苷酶酶促底物是基于吲哚酚衍生物的底物。

这样的吲哚酚衍生物的实例包括3-吲哚基-β-N-乙酰基-氨基葡糖苷的衍生物，例如5-溴-6-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷、6-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-N-乙酰基-氨基葡糖苷，最后一个化合物是特别优选的。

适于本发明目的的β-葡糖苷酶酶促底物是使得能够证明这样的酶促活性的本领域技术人员已知的任何底物。这样的底物可以例如为生色的或产生荧光的，并例如描述于BIOSYNTH的目录，Substrates andReagents或www.biosynth.com中，或描述于GLYCOSYNTH的目录，enzyme substrates catalogue或www.glycosynth.co.uk中。

作为β-葡糖苷酶底物的实例，可以提及基于吲哚酚衍生物的底物、基于伞形酮衍生物的底物和基于硝基苯的底物。

优选地，适于本发明目的的β-葡糖苷酶酶促底物是基于吲哚酚衍生物的底物。

这样的吲哚酚衍生物的实例包括3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷的衍生物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-β-D-吡喃葡糖苷。

根据一个实施方案，本发明的方法使用包含以下底物的反应培养基：i)酯酶底物，和ii)磷酸酶底物或α-葡糖苷酶底物，优选酯酶底物/磷酸酶底物的组合。

根据另一实施方案，除了酯酶底物和磷酸酶或α-葡糖苷酶底物之外，所述反应培养基还包含选自β-纤维二糖糖苷酶底物、N-乙酰基-氨基葡糖苷酶底物和β-葡糖苷酶底物的酶促底物，优选β-纤维二糖糖苷酶底物和N-乙酰基-氨基葡糖苷酶底物。

在本发明方法中使用的反应培养基由于存在所述的酶促底物因而是检测反应培养基。

这种反应培养基或者可以仅用作揭示培养基，或者可以用作培养和揭示培养基。在第一种情况下，微生物的培养在接种前进行，在第二种情况下，所述的反应培养基还构成了培养培养基。

所述的反应培养基可以是固体、半固体或液体。术语“固体或半固体培养基”意在表示，例如胶化的培养基。

琼脂是微生物学中用于培养微生物的常规固体培养基，但是也可以使用明胶或琼脂糖。有一些制剂可商业获得，例如Columbia琼脂、Trypcase-soja琼脂、Mac Conkey琼脂、Sabouraud琼脂，或更一般地，在Handbook of Microbiological Media(CRC出版社)中描述的那些。

反应培养基中琼脂的量是2-40g/l。对于固体培养基，琼脂的量优选为9-25g/l，更优选12-14g/l。对于半固体培养基，琼脂的量优选为2-6g/l。

本发明的酶促底物可在广的pH范围内使用，特别是在pH5.5至10。

在所述反应培养基中酶促底物的浓度为10至2000mg/l，优选为50至500mg/l，更优选为80至400mg/l，这构成了本发明的优选实施方案。

当然，根据选取的底物，本领域技术人员将在该范围内确定培养基中酶促底物的浓度。因而，在所使用的酯酶底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基辛酸酯的情况下，优选采用100至400mg/l的浓度。

可用于本发明目的的反应培养基还可以包含用于改善本发明方法的特异性和灵敏度的其他成分。

因而，根据本发明的一个实施方案，所述的反应培养基包含磷酸盐溶液，例如Na₂HPO₄和K₂HPO₄溶液。

这是因为，这样的磷酸盐溶液的使用使得能够明显地提高所述培养基的可读性，所述可读性或者反映为着色清晰度的增度，或者反映为在18小时时磷酸酶活性的表达和/或检测增加。

对于每种溶液，这样的磷酸盐溶液的浓度为0.3至1.5g/l，优选0.5g/l的浓度。

所述反应培养基还可以含有用于抑制或限制不希望的菌株(例如假阳性菌株，如假丝酵母(Candida)或腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus))生长的抑制剂的混合物，而不改变所述培养基的检测灵敏度。

在这方面，所述反应混合物可以含有抗生素的混合物。将抗生素加入至反应培养基中尤其使得能够赢得时间，因为无乳链球菌的鉴定是直接进行的。

适于本发明目的的抗生素的实例包括氨曲南和两性霉素B。这些抗生素可从ICN、Squibb或Sigma商业获得。

在所述反应培养基中的每种抗生素的量根据所涉及的抗生素而不同，并很容易由本领域技术人员确定。

所述反应培养基还可以包含组合的一种或多种要素，例如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、核苷酸、矿物质、维生素、表面活性剂、缓冲剂、磷酸盐、铵盐、钠盐、金属盐。培养基的实例描述于本申请人的专利申请EP 656421和WO99/09207中。

本发明方法的实施可以根据以下步骤来进行：

a)用全部或部分样品接种如上所定义的反应培养基，

b)孵育所述接种过的培养基，

c)揭示单独存在至少一种酯酶活性，或者与至少一种不同于酯酶活性的其他酶促活性相组合地存在至少一种酯酶活性，

这构成了本发明的另一主题。

所述的接种和孵育步骤是本领域技术人员所周知的。

例如，孵育温度可以是37℃。关于孵育气氛，优选为有氧环境。

所述的揭示过程是通过显现着色的变化并用肉眼观察来进行的，所述的着色在反应培养基中没有扩散并因而集中在菌落处。在揭示荧光的情况下，使用本领域技术人员已知的荧光读取设备。

待分析的生物样品是可能含有无乳链球菌的任何临床样品，例如阴道取样物、尿取样物或对其进行分析可以帮助临床医生作出诊断的任何其他样品。

借助于下述实施例可以更清楚地理解本发明，所述的实施例是以举例说明而非限制性的方式给出的。

实施例1：使用酯酶的酶促底物来检测无乳链球菌

1.1反应培养基的制备

反应培养基通过混合心-脑提取物(4.84g/l；Solabia)、肉浸液(1.96g/l；Solabia)、biothione(1g/l；Solabia)、biotrypcase(7.2g/l；Solabia)、碳酸钠(0.3g/l；VWR)、丙酮酸钠(2g/l；Fluka)、HEPES缓冲剂(0.4g/l；Sigma)、乳清蛋白蛋白胨(2g/l；DMV)、葡萄糖(1g/l；Merck)、美洲琼脂(2g/l；Sobigel)和欧洲琼脂(12g/l；Roko)而制备。

在121℃下高压灭菌15分钟后，以0.3g/l的比率加入如下所示的酯酶酶促底物；然后在50℃的水浴中冷却：

·5-溴-4-氯-3-吲哚基辛酸酯(X-C8；Inalco)，当使用它时产生青绿色着色，和

·5-溴-6-氯-3-吲哚基辛酸酯(Magenta-C8；Inalco)，当使用它时产生粉红色-红色着色。

然后将所述培养基倾入培养皿中以用于后面用细菌菌株进行接种。

1.2微生物菌株的接种

将悬浮于生理盐水中的三株无乳链球菌菌株和三株其他细菌菌株进行接种以便在每个培养基上产生分离的菌落，所有菌株均源自本申请人的保藏。然后将所述培养皿在37℃下孵育48小时。在孵育18、24和多于40小时后肉眼检查形成的菌落。记录这些菌落的着色、生长以及该着色的强度(代表了酯酶活性)。

1.3结果

结果在下表1中给出，并如此表示：

-生长(C)，用mm标明大小，

-颜色(Co)，T＝青绿色，R＝粉红色或红色，

-着色的强度(I)，基于0-4的任意标度，0相应于没有活性和4相应于存在十分强的着色，

-根据以小时表示的孵育时间(T)。

表1

  菌株  (登录号)  T  X-C8  Magenta-C8  C  Co  I  C  Co  I  无乳链球菌  (7611003)  18  24  ＞40  1.2  2  2.5  T  T  0.3  2.3  1.2  2  2.5  R  R  0.3  1.7  无乳链球菌  (0101060)  18  24  ＞40  0.4  0.7  1.3  T  T  0.3  3  0.4  0.7  1.3  R  R  0.3  2  无乳链球菌  (8904053)  18  24  ＞40  0.2  0.3  T  0.3  0.3  0.5  1  粪肠球菌  (Enteroccocus faecalis)  (0008192)  18  24  ＞40  0.8  2  2  T  T  T  1.7  3  3.5  0.8  1.8  2  R  R  R  1  1.7  3.5  屎肠球菌  (Enteroccocus faecium)  (7611005)  18  24  ＞40  0.5  1  1  T  T  T  2  3  3  0.7  1.7  1.7  R  R  R  1  2.7  3  表皮葡萄球菌  (Staphylococcus epidermidis)  (7509009)  18  24  ＞40  0.5  1.5  1.5  T  T  T  2  3  3  0.5  1  1.3  R  R  R  2  3  3.5

结果证明，可利用酯酶酶促底物来较早地检测链球菌B，因为在18-24小时它们表现出无活性至具有十分弱的活性。

实施例2：用酯酶底物和α-葡糖苷酶或磷酸酶底物检测无乳链球菌

重复上面在实施例1中描述的操作方案，除了在加入0.3g/l酯酶底物X-C8的同时，加入0.3g/l的6-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷(Rose-α-Glu)或0.3g/l的6-氯-3-吲哚基磷酸酯(Rose-P)，当使用它们时产生粉红色着色。

结果在下面表2中给出，该表中如同实施例1中一样，给出了生长、着色和强度，其中R＝粉红色/红色，RM＝粉红色-栗色，T＝青绿色，V＝绿色，Vi＝紫色，B＝蓝色，GVi＝灰色-紫色，以及GB＝灰色-蓝色。

表2

  菌株  (登录号)  T  X-C8+Rose-α-Glu  X-C8+Rose-P  C  Co  I  C  Co  I  无乳链球菌  (7611003)  18  24  ＞40  1.3  1.3  2  R  R  R  3  3  4  1  1.7  2  R  R  R  3  4  4  无乳链球菌  (8709013)  18  24  ＞40  0.2  0.3  1  R  R  R  2  2  4  0.5  0.5  1.7  R  R  R  3  3.5  4  无乳链球菌  (7702055)  18  24  ＞40  1  1.7  1.7  R  RM  R  2  2.7  4  0.8  1.3  1.7  R  R  R  3  4  4  屎肠球菌  (7611005)  18  24  ＞40  1.5  1.7  1.8  T  T  T  3  3  4  1.7  1.7  2  GB  B  GVi  3  3.5  4  表皮葡萄球菌  (7509009)  18  24  ＞40  0.7  1.3  1.3  V  GB  GB  3  3.5  3.5  0.6  1.3  1.5  GVi  GVi  GVi  3.5  3.5  4  金黄色葡萄球菌  (9202070)  18  24  ＞40  3  3  3  GVi  Vi  Vi  3  4  4  2  3  3  Vi  Vi  Vi  4  4  4

该表证明，当将生色性酯酶底物与可被无乳链球菌菌株利用的不同于酯酶底物的其他生色酶促底物组合使用时，改善了无乳链球菌菌株的检测。

实施例3：用酯酶底物、磷酸酶底物和β-纤维二糖糖苷酶底物检测无乳链球菌

重复在实施例2中描述的操作方案，使用0.3g/l的X-C8和0.2g/l的Rose-P，除了在高压灭菌前，在加入其他底物的同时还加入0.08g/l的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-纤维二糖糖苷(Cellobio)，以及加入0.5g/l Na₂HPO₄和0.5g/l K₂HPO₄之外。

作为对照培养基，使用了仅有X-C8和Rose-P的培养基。

结果在下面表3中给出，该表中如同实施例1中一样，给出了生长、着色和强度，其中R＝粉红色/红色，Ma＝淡紫色，Vi＝紫色，B＝蓝色，GB＝灰色-蓝色，以及V1＝紫红色。

表3

  菌株  (登录号)  T  对照  X-C8+Rose-P+Cellobio  C  Co  I  C  Co  I  无乳链球菌  (0101060)  18  24  ＞40  0.7  0.7  1.5  R  R  R  1.7  4  4  0.7  0.7  1.5  R  R  R  1.3  3  4  无乳链球菌  (7701031)  18  24  ＞40  1.3  1.5  1.5  R  R  R  4  4  4  1  1.5  1.5  R  R  R  4  4  4  无乳链球菌  (7702055)  18  24  ＞40  1  1.5  1.7  R  R  R  2  4  4  1  1.5  1.7  R  R  R  2  4  4  咽峡炎链球菌  (Streptococcus anginosus)  (8507046)  18  24  ＞40  0.3  0.5  1  R  R  0.1  2.3  0.3  0.4  1  B  B  B  0.5  1.3  2.7  屎肠球菌  (0002043)  18  24  ＞40  1.5  1.7  2  Ma  Ma  Vi  1.7  3  4  1.3  1.5  2  B  GB  V1  3  4  4

表3中的所获得的结果证明，当使用三种酶促底物(其中包括酯酶底物)时，改善了相对于其他菌株的无乳链球菌的检测特异性。

实施例4：用酯酶底物、磷酸酶底物和N-乙酰基-氨基葡糖苷酶底物检测无乳链球菌

重复在实施例3中描述的操作方案，除了用0.4g/l的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-N-乙酰基-氨基葡糖苷(X-NAGlu)代替Cellobio之外。

对照培养基与所述测试培养基相同，除了其不含有X-NAGlu外。

结果在下面表4中给出，该表中如同实施例1中一样，给出了生长、着色和强度，其中R＝粉红色/红色，B＝蓝色，GR＝灰色-粉红色，以及Mg＝品红色。

表4

  菌株  (登录号)  T  对照  X-C8+Rose-P+X-NAGlu  C  Co  I  C  Co  I  无乳链球菌  (7611003)  18  24  ＞40  0.5  1  1.2  R  R  R  3  4  4  0.5  1  1.2  R  R  R  2.3  3  4  无乳链球菌  (7701031)  18  24  ＞40  0.5  0.7  0.7  R  R  R  2.7  4  4  0.5  0.7  0.7  R  R  R  2.7  4  4  阴沟肠杆菌  (Enterobacter clocae)  (0010003)  18  24  ＞40  1.7  2  2.5  R  R  B  2.3  3  4  1.7  2  3  GR  B  B  2  3  4  屎肠球菌  (0002043)  18  24  ＞40  0.5  0.8  1  GR  GR  Mg  2  2.7  4  0.5  0.8  1  B  B  B  3  3.5  4

该表中的结果证明，当使用三种酶促底物(其中包括酯酶底物)时，改善了相对于其他菌株的无乳链球菌的检测特异性。

实施例5：用酯酶底物、磷酸酶底物和β-葡糖苷酶底物检测无乳链球菌

重复在实施例4中描述的操作方案，除了用0.08g/l的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷(X-β-Glu)和0.3g/l的5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(GreenA-β-Glu)代替X-NAGlu之外。

对照培养基与所述测试培养基相同，除了其既不含有X-β-Glu也不含有GreenA-β-Glu之外。

结果在下面表5中给出，该表中如同实施例1中一样，给出了生长、着色和强度，其中R＝粉红色/红色，Ma＝淡紫色，Vi＝紫色，B＝蓝色，以及GB＝灰色-蓝色。

表5

  菌株  (登录号)  T  对照  X-C8+Rose-P  +X-β-Glu  X-C8+Rose-P  +GreenA-β-Glu  C  Co  I  C  Co  I  C  Co  I  无乳链球菌  (9001001)  18  24  ＞40  0.4  0.5  1.7  R  R  0.5  4  0.3  0.5  1.3  R  R  0.3  4  0.2  0.4  1.5  R  R  0.3  4  无乳链球菌  (7701031)  18  24  ＞40  1.3  1.5  1.5  R  R  R  4  4  4  1.3  1.5  1.5  R  R  R  4  4  4  1  1.5  1.5  R  R  R  4  4  4  无乳链球菌  (7702055)  18  24  ＞40  1  1.5  1.7  R  R  R  2  4  4  1  1.5  1.7  R  R  R  2  4  4  1  1.3  1.5  R  R  R  2  4  4  咽峡炎链球菌  (8507046)  18  24  ＞40  0.3  0.5  1  R  R  0.1  2.3  0.3  0.4  1  B  B  B  3  4  4  0.3  0.4  1  B  B  B  0.5  2  3.5  屎肠球菌  (0002043)  18  24  ＞40  1.5  1.7  2  Ma  Ma  Vi  1.7  3  4  1.5  1.5  2  B  B  B  4  4  4  1.5  1.7  2  GB  GB  GB  4  4  4

表5中的所获得的结果证明，当使用三种酶促底物(其中包括酯酶底物)时，改善了相对于其他菌株的无乳链球菌的检测特异性。

实施例6：通过加入磷酸盐溶液来提高检测灵敏度

重复在实施例1中描述的操作方案，除了在加入0.3g/l的酯酶底物X-C8的同时加入0.3g/l的Rose-P，以及加入0.5g/l Na₂HPO₄和0.5g/l K₂HPO₄之外。

作为对照培养基，使用相同的培养基，但是没有磷酸盐溶液。

结果在下面表6中给出，该表中如同实施例1中一样，给出了生长、着色和强度，其中R＝粉红色，以及Mg＝品红色。

表6

  菌株  (登录号)  T  对照  有磷酸盐溶液  的培养基  C  Co  I  C  Co  I  无乳链球菌  (7611003)  18  24  ＞40  1.3  1.7  1.8  R  Mg  Mg  3  4  4  1.3  1.7  1.8  Mg  Mg  Mg  3.5  4  4  无乳链球菌  (0101060)  18  24  ＞40  0.4  0.5  1.5  R  Mg  Mg  0.5  4  4  0.5  0.7  1.5  Mg  Mg  Mg  3  3.5  4  无乳链球菌  (7702055)  18  24  ＞40  1  1.5  1.5  Mg  Mg  Mg  3  4  4  1  1.5  1.5  R  Mg  Mg  3.5  4  4

在该表6中的结果证明，或者改善了无乳链球菌菌株的自18小时起的着色清晰度，或者增加了无乳链球菌菌株的表达。

实施例7：用根据本发明的含有酯酶底物的培养基和商业可获得的培养基来进行无乳链球菌的检测灵敏度和特异性的比较

对于该关于灵敏度和特异性的研究，使用了如实施例1中所述制备的根据本发明的培养基，其含有0.3g/l的X-C8，以及0.2g/l的Rose-P、0.08g/l的Cellobio、0.5g/l的Na₂HPO₄、0.5g/l的K₂HPO₄、0.012g/l的氨曲南和0.004g/l的两性霉素B。

作为对比培养基，使用Granada培养基(ref 10077，BIOLYS，France)。

接种69株微生物，其中包括14株无乳链球菌，并且让其在37℃下孵育直至24小时并在超过这个时间后让其处于环境温度下。如上所述对菌落进行显色。根据供应商(bioMérieux，France)的建议使用Slidex Strepto Kit通过凝集试验对具有链球菌B的特征的可疑菌落(即显现出粉红色/红色的菌落)进行确认。非特征性的菌落(即不显现粉红色的菌落)或者具有特征性着色但是在凝集试验中产生阴性反应的菌落(假阳性菌株)通过Galeries ID 32 Strep(bioMérieux，France)进行鉴定。

对于灵敏度和特异性，结果表示为正确诊断相对于全部测试的％，并且在下面的表7中给出，灵敏度的％相应于在所述培养基上检测的真阳性的数目除以要检测的真阳性的总数目(*100)，特异性的％相应于在所述培养基上检测的真阴性的数目除以要检测的真阴性的总数目(*100)。

表7

  无乳链球菌的检测的  灵敏度和特异性(％)  Granada培养基  本发明的培养基  18小时  24小时  ＞40小时  18小时  24小时  ＞40小时  没有富集时的灵敏度  50  50  50  79  79  93  有经富集时的灵敏度  50  50  50  79  86  93  没有富集时的特异性  100  100  100  87  82  80  有经富集时的特异性  100  100  100  89  93  82

在该表中所示的结果证明，使用本发明的方法检测链球菌B(无乳链球菌)的灵敏度得到提高。而且，它们还显示，本发明的检测培养基还具有良好的特异性，所述特异性在接种所述琼脂前进行富集之后而得到提高，其中所述的富集是由于在有或无5％CO₂下于35-37℃在Todd-Hewitt液体培养基中传代18-24小时而获得的(参见CDC(Center for Disease Control)的建议，MMWR(Morbidity andMortality Weekly Report)，August 16，2002，vol.51，No.RR-11)。

实施例8：基于临床样品的所述培养基的使用

对于该研究，使用根据本发明的培养基，其如上面在实施例7中所描述的进行制备。

在本研究中使用了总共134个来源于阴道或子宫颈内取样的样品/拭子。

将每个拭子在1ml无菌生理盐水中乳化，并将100μl这种溶液一方面放置在含有5％的马血的Columbia琼脂上，另一方面放置于在本发明方法中使用的培养基上。此外，将100μl上述溶液用于接种Todd-Hewitt液体培养基。于37℃并在有氧条件下孵育20小时后，用所述的Todd-Hewitt液体培养基接种所述的含血琼脂和本发明的培养基，然后于37℃并在有氧条件下孵育20小时。

根据供应商(bioMérieux，France)的建议使用Slidex StreptoKit通过凝集试验对具有链球菌B的特征的可疑菌落(即显现出粉红色/红色的菌落)进行确认。

在134个样品中，112个接种在所述的琼脂培养基上，一方面直接使用在生理盐水中的悬浮液进行接种，另一方面于在Todd-Hewitt液体培养基中进行富集之后进行接种。其余的22个样品仅直接使用在生理盐水中的悬浮液而接种在所述的琼脂培养基上。

结果显示在下述表8中，所述的结果计算为灵敏度和特异性的平均百分数。

表8

  Columbia琼脂  本发明的琼脂  灵敏度  95  100  特异性  90  99.5

以上表8中的结果显示，用于临床样品的本发明培养基使得能够提高无乳链球菌检测的灵敏度和特异性。这是因为，在本发明培养基上于20份含有无乳链球菌的取样物中检测出20份，而在Columbia培养基上检测出19份，并且在所述酯酶培养基上仅有1个唯一的假阳性结果，而在Columbia琼脂上有24个。甚至可以说，这些结果比当用实验室菌株测试所述培养基时还要好。