杂交瘤细胞株及其产生的抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体

摘要

本发明公开了杂交瘤细胞株2E8Z CGMCC No.1942及其产生的抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体。杂交瘤细胞株产生的抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体2E8具有效价高、特异性强、抗原分布广泛的优点。柔性肽易于弯曲，因而可使本发明的融合蛋白正确折叠，且不影响融合蛋白各自的活性结合区域。实验证明，该融合蛋白能特异结合人红细胞表面的H抗原；此外，该融合蛋白还具有表达量高，易纯化，生产周期短，生产规模大，制备成本低的优点。基于上述优点，本发明为下一步用基因工程法制备双功能性分子，以及建立基于红细胞的治疗与检测平台打下了良好的基础，将在医学检测领域，具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株及其产生的抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体。

背景技术

人的红细胞表面有许多抗原分子，它们结构不同，功能多样。其中，组成血型系统的表面抗原分子(如：A、B、O血型抗原)，主要与输血安全密切相关。ABO血型抗原基因直接编码特异性糖基转移酶，进而由这些酶合成寡糖性质的ABO抗原。A型抗原表位是N-乙酰基半乳糖，B型是半乳糖，O型是H抗原表位，为岩藻糖。H抗原表位是AB血型抗原的前体。

除稀有的孟买(Bombay)型红细胞外，H抗原分布在所有的人红细胞表面，属于红细胞共同抗原。直接与H抗原相关的常见表型分为分泌型和非分泌型，H(FUT1)位点基因编码365个氨基酸的α-2-L岩藻糖转移酶，控制造血组织的α-岩藻糖转移酶活性，决定H抗原在红细胞膜上的表达。SE(FUT2)位点基因编码332个氨基酸的α-2-L岩藻糖转移酶，控制分泌组织的岩藻糖转移酶活性，决定H抗原在分泌液的表达。H血型抗原是多糖体，对干燥和高热有较强的抵抗力，甚至170℃不被破坏，并有高度耐久性，在法医鉴定方面用途广泛。红细胞膜上H抗原寡糖最主要的是2-型前体糖链，L-岩藻糖连接于前体糖链末端乳糖构成H抗原表位。

除了血型抗原外，红细胞还具有许多重要的表面分子。其中，CR1分子为I型补体受体，基因定位于人的1号染色体长臂32区。作为调理素受体，CR1可以增强吞噬细胞对补体包被颗粒以及微生物的吞噬作用。CR1结合免疫复合物(IC)，随红细胞将其运输到肝脏，免疫复合物与红细胞分离后，即被单核细胞所清除。

在红细胞表面抗原系统中，具有共同抗原性质的分子，不论是血型抗原(如H抗原等)还是表面分子(CR1、血型糖蛋白A等)，在医学检验与治疗研究中均日渐受到重视。

1989年，Kemp利用抗红细胞表面的共同抗原-血型蛋白A的单克隆抗体(该单抗为非凝集型单克隆抗体，在盐水介质中不能直接使红细胞发生凝集反应)，建立了自体红细胞凝集实验，该方法以病人自身的红细胞作为检测系统的指示细胞，以特异的非凝集型抗人红细胞抗体(或抗体片段)与相关的抗原或抗体形成的双功能性分子(特异性分别针对红细胞表面抗原和待检抗原/抗体)作为检测试剂(Kemp BE，Rylatt DB，Bundesen PG，Doherty RR，McPhee DA，Stapleton D，Cottis LE，Wilson K，JohnMA.Autologous red cell agglutination assay for HIV-1 antibodies：simplifiedtest with wholeblood.[J]Science.1988，241(4871)：1352-1354.)。当向待检者的全血中加入这种检测试剂之后，如果血液标本中存在相应的抗体或抗原，双功能性分子的一端(抗人红细胞抗体)可与血液中的红细胞结合，另一端与血液中游离的抗体或抗原结合，通过该分子的桥联作用将红细胞凝集在一起，呈现肉眼可见的血液凝集块。这一方法简便、快速、特异性强，敏感性高，国外已有使用该法对HIV抗体进行检测的报道。

1991年Tailor(Craig ML，Bankovich AJ，Taylor RP.Visualization of thetransfer reaction：tracking immune complexes from erythrocyte complementreceptor tomacrophages[J].Clin Immunol，2002，105：36-47)构建了以红细胞表面的共同抗原CR1为基础的单抗异聚体，这种单抗异聚体能够将红细胞与病变细胞连接到一起，病变细胞随红细胞的正常生理代谢过程，被巨噬细胞所吞噬。单抗异聚体的应用，开创了以红细胞为载体的药物治疗的新领域。

由此可以看出，无论是作为载体进行药物治疗，还是作为指示细胞进行病原体的检测，红细胞已经不单单是氧气和养分的携带者，已经并将会发挥更大的平台作用。但是，这种作用的发挥，需要一种基于抗红细胞表面共同抗原的单抗为基础的双功能性分子作为介导物，以桥联方式发挥作用。因此，获得性能良好的抗红细胞单克隆抗体(简称单抗)是试验研究的必要条件，而双功能分子的制备则是成功的关键。

目前，双功能性分子的制备方法主要包括化学交联法，杂交瘤融合法和基因工程法。化学交联法，即通过化学交联剂将抗红细胞单抗与另外一株单抗连接到一起。杂交瘤法是通过将抗红细胞单抗与另外一株单抗进行融合，筛选出能分泌双功能性分子的杂交瘤细胞。这两种方法主要针对单抗进行操作，但化学交联法中化学交联剂的使用易于破坏抗体活性，而杂交瘤融合法中筛选分泌双功能性分子的杂交瘤细胞株的难度较大。采用基因工程法制备双功能性分子，首先需要克隆抗体(抗红细胞单抗以及其它单抗)的可变区基因，然后在体外通过酶切、连接等手段构建双功能性分子基因，或者引入抗原肽基因，最后将重构的基因进行表达，获得的融合蛋白即为双功能分子。

抗体可变区的获得是基因工程法制备双功能性分子的关键步骤。克隆基因的引物设计包括两种方法：RT-PCR法与5’RACE法。RT-PCR法的引物设计主要根据抗体骨架区或前导肽序列设计简并引物。由于引物的简并性，可变区的N、C末端不能完全忠实于原序列，某些氨基酸残基的改变可影响基因工程抗体的结合活性，导致基因工程抗体的亲和力降低。5’RACE法是对RT-PCR法的一种改进，通过在5’端添加一段polyC，作为上游引物，下游引物则根据恒定区设计，这样可以保证克隆到与亲本抗体完全一致的可变区基因。

发明内容

本发明的目的是提供一株可产生抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明所提供的可产生抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为2E8Z，该细胞株已于2007年02月08日保藏于北京中关村的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1942。

由上述杂交瘤细胞株2E8Z CGMCC No.1942产生的抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体，名称为2E8，来源于小鼠属小鼠(Mus musculus)，其重链可变区具有序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗人红细胞表面H抗原中和活性的多肽；轻链可变区具有序列表中的SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗人红细胞表面H抗原中和活性的多肽。

序列表中的SEQ ID NO：1由117个氨基酸残基组成，序列表中的SEQ ID NO：2由112个氨基酸残基组成。

编码抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体2E8的基因(2E8)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列或编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；轻链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列或编码序列表中SEQID NO：2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：3由351个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至351位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的SEQ ID NO：4由336个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至336位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体2E8重链和/或轻链可变区编码基因的表达载体，转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体2E8重链和/或轻链可变区编码基因的中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种将抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体2E8的重链可变区和轻链可变区连接得到的融合蛋白。

所述融合蛋白中的抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体2E8的重链可变区和轻链可通过柔性肽连接，所述柔性肽可具有序列表中SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQID NO：7的氨基酸残基序列。

序列表中的SEQ ID NO：5为柔性肽(Gly4Ser)₃，由15个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO：6为柔性肽(Gly4Ser)₂，由10个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO：7为柔性肽(Gly4Ser)，由5个氨基酸残基组成。

具体来讲，所述融合蛋白是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：8；

2)序列表中的SEQ ID NO：9；

3)序列表中的SEQ ID NO：10；

4)将序列表中SEQ ID NO：8-10的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗人红细胞表面H抗原中和活性的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：8由244个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-117位为抗体2E8重链可变区的氨基酸残基序列，自氨基端第133-244位为抗体2E8轻链可变区的氨基酸残基序列，自氨基端第118-132位为连接肽(Gly4Ser)₃序列，将具有SEQ ID NO：8所述氨基酸残基序列的融合蛋白命名为2E8R3；序列表中的SEQ ID NO：9由239个氨基酸残基组成，自氨基端第1-117位为抗体2E8重链可变区的氨基酸残基序列，自氨基端第128-239位为抗体2E8轻链可变区的氨基酸残基序列，自氨基端第118-127位为连接肽(Gly4Ser)₂序列，将具有SEQ ID NO：9所述氨基酸残基序列的融合蛋白命名为2E8R2；序列表中的SEQ ID NO：10由234个氨基酸残基组成，自氨基端第1-117位为抗体2E8重链可变区的氨基酸残基序列，自氨基端第123-234位为抗体2E8轻链可变区的氨基酸残基序列，自氨基端第118-122位为连接肽(Gly4Ser)序列，将具有SEQ ID NO：10所述氨基酸残基序列的融合蛋白命名为2E8R1。

编码上述融合蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：11的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID NO：12的DNA序列；

3)序列表中SEQ ID NO：13的DNA序列；

4)编码序列表中SEQ ID NO：8-10的DNA序列；

5)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：11-13限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：11由732个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-732位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：8的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-351位碱基为抗体2E8重链可变区的编码序列，自5’端第397-732位碱基为抗体2E8轻链可变区的编码序列，自5’端第352-396位碱基为连接肽(Gly4Ser)₃的编码序列，将具有SEQ ID NO：11所述核苷酸序列的融合基因命名为2E8R3；序列表中的SEQ ID NO：12由717个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-717位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：9的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-351位碱基为抗体2E8重链可变区的编码序列，自5’端第382-717位碱基为抗体2E8轻链可变区的编码序列，自5’端第352-381位碱基为连接肽(Gly4Ser)₂的编码序列，将具有SEQID NO：12所述核苷酸序列的融合基因命名为2E8R2；序列表中的SEQ ID NO：13由702个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-702位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：10的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-351位碱基为抗体2E8重链可变区的编码序列，自5’端第367-702位碱基为抗体2E8轻链可变区的编码序列，自5’端第352-366位碱基为连接肽(Gly4Ser)的编码序列，将具有SEQ ID NO：13所述核苷酸序列的融合基因命名为2E8R1。

含有本发明融合基因2E8R3的表达载体，转基因细胞系及宿主菌也均属于本发明的保护范围。

扩增上述融合基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种构建上述融合基因2E8R3的方法。

本发明所提供的上述融合基因2E8R3的构建方法，可包括以下步骤：

1)以含有抗人红细胞H抗原单克隆抗体2E8的重链可变区编码基因的质粒为模板，在由序列表中SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15组成的引物对的引导下，PCR扩增抗人红细胞H抗原单克隆抗体2E8的重链可变区编码基因；

2)以含有抗人红细胞H抗原单克隆抗体2E8的轻链可变区编码基因的质粒为模板，在由序列表中SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17组成的引物对的引导下，PCR扩增抗人红细胞H抗原单克隆抗体2E8的轻链可变区编码基因；

3)以步骤1)扩增的抗人红细胞H抗原单克隆抗体2E8的重链可变区编码基因和步骤2)扩增的抗人红细胞H抗原单克隆抗体2E8的轻链可变区编码基因为模板，在由序列表中SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：17组成的引物对的引导下，进行重叠PCR扩增，得到融合基因。

在上述融合基因的构建方法中，步骤1)中的SEQ ID NO：14由37个碱基组成，SEQ ID NO：15由60个碱基组成，其中，SEQ ID NO：14中自5’端第1-6位碱基为限制性内切酶BamH I识别位点；含有抗人红细胞H抗原单克隆抗体2E8的重链可变区编码基因的质粒为pMD-18T-2E8Hchain。

步骤2)中的SEQ ID NO：16由60个碱基组成，SEQ ID NO：17由32个碱基组成，其中，SEQ ID NO：17中自5’端第1-8位碱基为限制性内切酶Nhe I识别位点；含有抗人红细胞H抗原单克隆抗体2E8的轻链可变区编码基因的质粒为pMD-18T-2E8Lchain。

本发明还提供了一种表达上述融合蛋白的方法。

本发明所提供的表达上述融合蛋白方法，是将含有上述融合基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到融合蛋白。

所述宿主可为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。

所述大肠杆菌可为E.coli JM109、E.coli HB101、E.coli Top10或E.coli TG1等。优选E.coli TG1。

用于构建所述重组大肠杆菌表达载体的出发载体为任意一种可在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体，如pET-his或pUC-118等。

以pHenIX为出发载体构建的重组大肠杆菌表达载体为pET-his-2E8ScFv3、pET-his-2E8ScFv2或pET-his-2E8ScFv1。

上述重组表达载体均可按照常规方法构建。

培养含有本发明的融合基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。

当所述宿主为大肠杆菌时，需用IPTG诱导表达，IPTG的终浓度可为0.8-1.2mmol/L。

本发明提供了一株杂交瘤细胞株CGMCC No.1942及其产生的抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体，以及通过柔性肽Gly4Ser、(Gly4Ser)₂或(Gly4Ser)₃作为linker，将抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区连接在一起得到的融合蛋白。实验证明，杂交瘤细胞株CGMCC No.1942产生的抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体2E8具有效价高、特异性强、抗原分布广泛的优点。柔性肽Gly4Ser、(Gly4Ser)₂和(Gly4Ser)₃易于弯曲，因而可使本发明的融合蛋白正确折叠，且不影响融合蛋白各自的活性结合区域。实验证明，该融合蛋白能特异结合人红细胞表面的H抗原；此外，该融合蛋白还具有表达量高，易纯化，生产周期短，生产规模大，制备成本低的优点。基于上述优点，本发明为下一步用基因工程法制备双功能性分子，以及建立基于红细胞的治疗与检测平台打下了良好的基础，将在医学检测领域，具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为5’RACE法扩增的2E8单抗轻、重链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为融合蛋白基因2E8R3的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图3为融合蛋白2E8R3的SDS-PAGE电泳检测结果

图4为融合蛋白2E8R3的Western Blot鉴定结果

图5为融合蛋白2E8R3的荧光检测结果

图6为融合蛋白2E8R3的竞争抑制检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所有引物合成和测序工作均由北京奥科生物公司完成。

实施例1、杂交瘤细胞株2E8Z的获得及其产生的抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体2E8的鉴定

本发明的发明人制备了可产生抗人红细胞H抗原的杂交瘤细胞株，名称为2E8Z，该细胞株已于2007年02月08日保藏于北京中关村的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1942，具体构建方法可参见文献(李卉，潘纪春，刘子，刘景汉，章金刚。抗人红细胞膜抗原非凝集型单克隆抗体的研制及特性鉴定[J]。细胞与分子免疫学杂志2005，21(4)：473-475)。将该细胞株产生的单克隆抗体命名为2E8，该单抗的凝集效价为1∶1024，腹水凝集效价达1∶64×10⁶，亚类为IgG1、κ链。抗球蛋白血凝实验证明，2E8单抗凝集时间为7s，3min内凝块大于1mm²。O型红细胞与2E8单抗不发生凝集反应。2E8单抗与11种(小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、家猪、小型猪、牛、羊、狗、猴、马)哺乳动物血球无种属交叉反应。与人的8个(Rhhr、Kidd、MNSs、Duffy、Diego、KellLewis以及P血型抗原)血型系统、21种抗原均不相关。该单抗能有效与单核、巨噬细胞结合，介导白细胞吞噬、溶解红细胞，与补体结合后，激活补体，溶解红细胞。上述实验结果表明杂交瘤细胞株2E8Z产生的抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体2E8具有效价高、特异性强、抗原分布广泛的特点。

实施例2、2E8单克隆抗体可变区基因的克隆

用下述方法克隆2E8单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区编码基因，具体过程包括以下步骤：

一、提取总RNA

用Iinvitrogen的TRIzol试剂盒并参照试剂盒说明书提取实施例1获得的可产生抗人红细胞表面H抗原的杂交瘤细胞株2E8Z CGMCC No.1942的总RNA。

二、合成cDNA

以步骤一获得的总RNA为模板，oligo(dT)₁₅为引物，用Invitrogen公司的SuperScript^TM-II反转录酶并按照说明书进行反转录，50μL反应体系及反应条件为：总RNA 10μL，oligo(dT)₁₅ 1μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，在65℃下孵育5min，然后冰浴5min，微离心，再加入5×反转录反应缓冲液(购自Promega)5μL，0.1mol/LDTT(购自Invitrogen)2μL，1μL 40U/μL RNasin(购自Invitrogen)，42℃ 2min，然后加入SuperScript^TM-II 1μL混匀，随之25℃ 10min，42℃ 50min，70℃ 15min，最后加入2U/μL RnaseH(购自Invitrogen)1μL，37℃ 20min。

三、反转录产物的纯化

连续两次用2倍体积的2.5mol/L乙酸铵和3倍体积的乙醇沉淀步骤二的反转录产物，以除去过剩的dNTPs和引物，纯化的产物可直接用于PCR扩增。

四、5’RACE法克隆可变区基因

用5’RACE法克隆2E8单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区编码基因，具体方法包括以下步骤：

1、在合成的cDNA末端添加PloyG尾及反应产物的纯化

在步骤三纯化的cDNA末端添加PloyG尾，反应体系及反应条件为：纯化的cDNA 5μL，5×TdT缓冲液(购自Promega)4μL，100mmol/L dGTP(购自Promega)2μL，TdT酶(Promega)2μL，用水补足反应体系至20μL，在37℃下反应60min。用乙醇-乙酸铵方法(参见《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》)纯化带PloyG尾的反应产物，定容至20μL。

2、5’RACE扩增

首先，根据抗体恒定区设计5’RACE法扩增2E8单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区编码基因的引物，引物序列如下：

PloyC(5’端共享引物)：5’-CCCCCCCCCCCCCC-3’；

V_H3’端引物(扩增重链可变区的3’端引物)V_RACEFOR：5’-ACTAGTACAATCCCCTGGGCACAAT-3’；

V_L3’端引物(扩增轻链可变区的3’端引物)V_RACEκFOR：5’-TCATGTCGACGGATCCAAGCTTCAAGAAGCACACACTGAGGCAC-3’。

然后，以步骤1纯化的带PloyG尾的cDNA为模板，在引物PloyC和V_RACEFOR的引导下PCR扩增2E8单克隆抗体的重链可变区编码基因，在引物PloyC和V_RACEκFOR的引导下PCR扩增2E8单克隆抗体的轻链可变区编码基因；反应条件均为：先95℃预变性2min；然后94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，共28个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示(泳道a为Marker，泳道b为重链可变区编码基因，泳道c为轻链可变区编码基因)，经扩增得到了约351bp和336bp的条带，回收这两条DNA片段，并用购自Promega的DNA纯化试剂盒纯化回收片段，再将回收片段分别连接入载体pGEM-T(Promega公司)中，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用蓝白斑法筛选阳性克隆，得到分别含有2E8单克隆抗体轻链可变区扩增片段和重链可变区扩增片段的重组载体，将含有2E8单克隆抗体重链可变区扩增片段的重组载体命名为pMD-18T-2E8Hchain，将含有2E8单克隆抗体轻链可变区扩增片段的重组载体命名为pMD-18T-2E8Lchain。对重组载体进行测序，测序结果表明，扩增的2E8单克隆抗体重链可变区编码序列具有序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列，由351个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至351位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质；扩增的2E8单克隆抗体轻链可变区编码序列具有序列表中SEQ ID NO：4的核苷酸序列，由336个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至336位碱基，编码具有序列表中SEQID NO：2的氨基酸残基序列的蛋白质。经Blast进行序列比对，结果最高同源性达96％和94％，表明成功克隆了2E8单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区编码基因，属于鼠抗体可变区重链基因家族I(B)亚群和轻链基因家族I亚群。

实施例3、融合蛋白基因2E8R3的克隆及含有该融合基因的大肠杆菌表达载体的构建

一、融合蛋白基因2E8R3的克隆

用下述方法克隆通过柔性肽(Gly4Ser)₃(序列表中SEQ ID NO：5)连接得到的实施例2获得的抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体2E8重链可变区和轻链可变区的融合蛋白(命名为2E8R3)基因2E8R3，具体过程包括以下步骤：

1、设计引物

根据实施例2克隆的单克隆抗体2E8的重链可变区和轻链可变区编码基因和柔性肽(Gly4Ser)₃编码序列设计引物，引物序列如下：

2E8H_BACKNEW(上游引物)：5’-ggatcccaggtgcagttgaaggagtcagga-3’(SEQ ID NO：14，带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)；

2E8H_FORNEW(下游引物)：5’-gccacccgacccaccaccgcccgagccaccgccacctgcagagacagtgaccagagtccc-3’(SEQ ID NO：15)；

2E8L_BACKNEW(上游引物)：5’-ggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgacattgtgatgacacagtctcca-3’(SEQ ID NO：16)；

2E8L_FORNEW(下游引物)：5’-gctagctatttccaactttgtccccgagcc-3’(SEQ ID NO：17，带下划线碱基为限制性内切酶Nhe I识别位点)。

2、PCR扩增

以实施例2构建的含有2E8单克隆抗体重链可变区扩增片段的重组质粒pMD-18T-2E8Hchain为模板，在引物2E8H_BACKNEW和2E8H_FORNEW的引导下PCR扩增2E8的重链可变区基因，同时，以实施例2构建的含有2E8单克隆抗体轻链可变区扩增片段的重组质粒pMD-18T-2E8Lchain为模板，在引物2E8L_BACKNEW和2E8L_FORNEW的引导下PCR扩增2E8的轻链可变区基因，反应条件均为：先95℃预变性2min；然后94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，共28个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果分别获得了大小约为387bp和372bp的条带，与预期结果相符。回收这两条DNA片段，并用购自Promega的DNA纯化试剂盒纯化回收片段，然后将两个片段的回收产物各取2μL，并以各自互为引物进行PCR扩增，反应条件为：先95℃预变性2min；然后94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，共7个循环；再向反应管中加入2μL引物2E8H_BACKNEW和2E8L_FORNEW，再在相同条件(94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min)下进行28个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示(泳道a为Marker，泳道b为PCR扩增产物)，经PCR扩增获得了大小约为732bp的DNA片段，与预期结果相符。回收该DNA片段，并用购自Promega的DNA纯化试剂盒纯化回收片段，将其连接入pGEM-T载体中，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用蓝白斑法筛选阳性克隆，提质粒，得到含有融合蛋白基因2E8R3的重组质粒，命名为pGEM-T-2E8R3。对该质粒进行测序，测序结果表明经上述方法扩增得到了序列正确的融合蛋白2E8R3的编码基因，该融合基因具有序列表中SEQ ID NO：11的核苷酸序列，由732个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-732位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：8的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-351位碱基为抗体2E8重链可变区的编码序列，自5’端第397-732位碱基为抗体2E8轻链可变区的编码序列，自5’端第352-396位碱基为连接肽(Gly4Ser)₃的编码序列。

二、融合蛋白基因2E8R3的大肠杆菌表达载体的构建

将步骤一获得的融合蛋白基因2E8R3用限制性内切酶BamH I和Nhe I进行双酶切后，与经相同酶双酶切的载体pET-his(晶美生物工程有限公司)进行连接，得到融合蛋白基因2E8R3的大肠杆菌表达载体，命名为pET-his-2E8ScFv3。

实施例4、融合蛋白基因2E8R2的克隆及含有该融合基因的大肠杆菌表达载体的构建

一、融合蛋白基因2E8R2的克隆

用下述方法克隆通过柔性肽(Gly4Ser)₂(序列表中SEQ ID NO：6)连接得到的实施例2获得的抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体2E8重链可变区和轻链可变区的融合蛋白(命名为2E8R2)基因2E8R2，具体过程包括以下步骤：

1、设计引物

根据实施例2克隆的单克隆抗体2E8的重链可变区和轻链可变区编码基因和柔性肽(Gly4Ser)₂编码序列设计引物，引物序列如下：

2E8H2_BACKNEW(上游引物)：5’-ggatcccaggtgcagttgaaggagtcagga-3’(SEQ ID NO：18，带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)；

2E8H2_FORNEW(下游引物)：5’-gccacccgacccaccaccgcctgcagagacagtgaccagagtccc-3’(SEQ ID NO：19)；

2E8L2_BACKNEW(上游引物)

5-ggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgacattgtgatgacacagtctcca-3’(SEQ ID NO：20)；

2E8L2_FORNEW(下游引物)：5’-gctagctatttccaactttgtccccgagcc-3’(SEQ ID NO：21，带下划线碱基为限制性内切酶Nhe I识别位点)。

2、PCR扩增

以实施例2构建的含有2E8单克隆抗体重链可变区扩增片段的重组质粒pMD-18T-2E8Hchain为模板，在引物2E8H2_BACKENW和2E8H2_FORNEW的引导下PCR扩增2E8的重链可变区基因，同时，以实施例2构建的含有2E8单克隆抗体轻链可变区扩增片段的重组质粒pMD-18T-2E8Lchain为模板，在引物2E8L2_BACKNEW和2E8L2_FORNEW的引导下PCR扩增2E8的轻链可变区基因，反应条件与实施例3相应步骤的相同。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果分别获得了大小约为372bp和366bp的条带，与预期结果相符。回收这两条DNA片段，并用购自Promega的DNA纯化试剂盒纯化回收片段，然后将两个片段的回收产物各取2μL，并以各自互为引物进行PCR扩增，反应条件与实施例3相应步骤的相同；再向反应管中加入2μL引物2E8H2_BACKNEW和2E8L2_FORNEW，再在相同的循环条件下进行28个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增获得了大小约为732bp的DNA片段，与预期结果相符。回收该DNA片段，并用购自Promega公司DNA纯化试剂盒纯化回收片段，将其连接入pGEM-T载体中，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用蓝白斑法筛选阳性克隆，提质粒，得到含有融合蛋白基因2E8R2的重组质粒，命名为pGEM-T-2E8R2。对该质粒进行测序，测序结果表明经上述方法扩增得到了序列正确的融合蛋白2E8R2的编码基因，该融合基因具有序列表中SEQ ID NO：12的核苷酸序列，由717个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-717位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：9的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-351位碱基为抗体2E8重链可变区的编码序列，自5’端第382-717位碱基为抗体2E8轻链可变区的编码序列，自5’端第352-381位碱基为连接肽(Gly4Ser)₂的编码序列。

二、融合蛋白基因2E8R2的大肠杆菌表达载体的构建

将步骤一获得的融合蛋白基因2E8R2用限制性内切酶BamH I和Nhe I进行双酶切后，与经相同酶双酶切的载体pET-his进行连接，得到融合蛋白基因2E8R2的大肠杆菌表达载体，命名为pET-his-2E8ScFv2。

实施例5、融合蛋白基因2E8R1的克隆及含有该融合基因的大肠杆菌表达载体的构建

一、融合蛋白基因2E8R1的克隆

用下述方法克隆通过柔性肽(Gly4Ser)(序列表中SEQ ID NO：7)连接得到的实施例2获得的抗人红细胞表面H抗原的单克隆抗体2E8重链可变区和轻链可变区的融合蛋白(命名为2E8R1)基因2E8R1，具体过程包括以下步骤：

1、设计引物

根据实施例2克隆的单克隆抗体2E8的重链可变区和轻链可变区编码基因和柔性肽(Gly4Ser)编码序列设计引物，引物序列如下：

2E8H1_BACKNEW(上游引物)：5’-ggatcccaggtgcagttgaaggagtcagga-3’(SEQ ID NO：22，带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)；

2E8H1_FORNEW(下游引物)：5’-gtcagatccgccgccacctgcagagacagtgaccagagtccc-3’(SEQID NO：23；

2E8L1_BACKNEW(上游引物)：5’-tctgcaggtggcggcggatctgacattgtgatgacacagtctcca-3’(SEQ ID NO：24)；

2E8L1_FORNEW(下游引物)：5’-gctagctatttccaactttgtccccgagcc-3’(SEQ ID NO：25，带下划线碱基为限制性内切酶Nhe I识别位点)。

2、PCR扩增

以实施例2构建的含有2E8单克隆抗体重链可变区扩增片段的重组质粒pMD-18T-2E8Hchain为模板，在引物2E8H1_BACKNEW和2E8H1_FORNEW的引导下PCR扩增2E8的重链可变区基因，同时，以实施例2构建的含有2E8单克隆抗体轻链可变区扩增片段的重组质粒pMD-18T-2E8Lchain为模板，在引物2E8L1_BACKNEW和2E8L1_FORNEW的引导下PCR扩增2E8的轻链可变区基因，反应条件与实施例3相应步骤的相同。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果分别获得了大小约为369bp和357bp的条带，与预期结果相符。回收这两条DNA片段，并用购自Promega生物公司的DNA纯化试剂盒纯化回收片段，然后将两个片段的回收产物各取2μL，并以各自互为引物进行PCR扩增，反应条件与实施例3相应步骤的相同；再向反应管中加入2μL引物2E8H1_BACKNEW和2E8L1_FORNEW，再在相同的循环条件下进行28个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增获得了大小约为732bp的DNA片段，与预期结果相符。回收该DNA片段，并用购自Promega生物公司的DNA纯化试剂盒纯化回收片段，将其连接入pGEM-T载体中，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用蓝白斑法筛选阳性克隆，提质粒，得到含有融合蛋白基因2E8R1的重组质粒，命名为pGEM-T-2E8R1。对该质粒进行测序，测序结果表明经上述方法扩增得到了序列正确的融合蛋白2E8R1的编码基因，该融合基因具有序列表中SEQ ID NO：13的核苷酸序列，由702个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-702位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：10的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-351位碱基为抗体2E8重链可变区的编码序列，自5’端第367-702位碱基为抗体2E8轻链可变区的编码序列，自5’端第352-366位碱基为连接肽(Gly4Ser)的编码序列。

二、融合蛋白基因2E8R1的大肠杆菌表达载体的构建

将步骤一获得的融合蛋白基因2E8R1用限制性内切酶BamH I和Nhe I进行双酶切后，与经相同酶双酶切的载体pET-his进行连接，得到融合蛋白基因2E8R1的大肠杆菌表达载体，命名为pET-his-2E8ScFv1。

实施例6、融合蛋白的表达及其活性鉴定

一、融合蛋白的表达

将实施例3构建的表达载体pET-his-2E8ScFv3转化大肠杆菌TG1感受态细胞，以pET-his为对照，筛选阳性单克隆，再将阳性单菌落接种于5mL 2YT培养基(peptone20g+yeast extract10g+NaCl 10g+100μg/mL ampicillin+1％ glucose)中，在37℃下培养过夜(12-24小时)，然后，取2mL菌液，再接种到200mL新鲜2YT培养基中，在37℃、250rpm下培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG(1mol/L)200μL，在30℃、250rpm下诱导培养16小时(分别于诱导至第8、16、20小时时取样)。培养结束后，离心收集菌体，加入5mL缓冲液(50mmol/L pH7.4 PBS)，超声破碎(0.5后，离心收集上清，过0.45μm滤膜(购自上海市新化净化器件厂)，分批加入到用5mL缓冲液预处理的镍琼脂糖凝胶纯化柱(北京卓冠生物技术公司)，在4℃下参照说明书进行纯化。将纯化后的蛋白用PBS液进行透析，过0.22μm滤膜(购自上海市新化净化器件厂)，分装，冻存。

然后用与上述相同的方法将实施例4、5构建的表达载体pET-his-2E8ScFv2和pET-his-2E8ScFv1分别转化大肠杆菌TG1感受态细胞，再用相同方法诱导表达及纯化，并对经纯化的表达蛋白分装，冻存。

二、表达蛋白的SDS-PAGE及Western Blot鉴定

1、SDS-PAGE

将步骤一表达及纯化的蛋白进行12％ SDS-PAGE电泳检测，其中转化pET-his-2E8ScFv3的工程菌的表达产物的检测结果如图3所示(泳道a为转化有pET-his空载体的重组菌的表达产物，泳道b为转化有pET-his-2E8ScFv3的工程菌的表达产物，泳道c为Marker，泳道d为经纯化的蛋白)，经表达获得了分子量约为32KD的蛋白，与预期结果相符，且经诱导表达16小时蛋白表达量最高。转化pET-his-2E8ScFv2的工程菌经诱导表达获得了32KD的蛋白，转化pET-his-2E8ScFv1的工程菌经诱导表达获得了32KD的蛋白，均与预期结果相符。

2、Western Blot鉴定

将步骤一表达及纯化的蛋白进行12％ SDS-PAGE电泳后转膜进行Western Blot鉴定，所用一抗为抗His单抗(购自普利莱生物公司)，二抗为羊抗鼠抗体(购自华美生物公司)。其中转化pET-his-2E8ScFv3的工程菌的表达产物的Western Blot检测结果如图4所示(泳道a为转化有pET-his空载体的重组菌的表达产物，泳道b为转化有pET-his-2E8ScFv3的工程菌的表达产物)，表明表达蛋白可与抗His单抗特异结合，证明融合蛋白基因2E8R3获得正确表达，得到了通过柔性肽(Gly4Ser)₃连接的2E8单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的融合蛋白2E8R3。

转化pET-his-2E8ScFv2和pET-his-2E8ScFv1的工程菌的表达产物也可与抗His单抗特异结合，证明融合蛋白基因2E8R2和2E8R1也均获得正确表达，得到了分别通过柔性肽(Gly4Ser)₂和(Gly4Ser)连接的2E8单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的融合蛋白2E8R2和2E8R1。

三、融合蛋白的荧光检测

取4个EP管，标记上检测管(3个)与阳性对照管，分别加入4％的红细胞300μL，然后向3个检测管中分别加入步骤一表达及纯化的具有不同连接肽的三种融合蛋白各100μL(0.85mg/mL)，阳性对照管中加入2E8单克隆抗体(3.84mg/mL)，将4个管在37℃下孵育1小时，用0.9％的生理盐水洗涤3次，再用300μL生理盐水重悬沉淀，向检测管中加入一抗(抗His单抗，购自普利莱生物公司)，混匀后37℃孵育1小时，用0.9％的生理盐水洗涤3次，再用300μL生理盐水重悬沉淀，向两管中加入二抗(FITC标记羊抗鼠抗体，购自华美生物公司)，混匀后37℃孵育1小时，用0.9％的生理盐水洗涤3次，最后在荧光电镜下观察。与阳性对照组相同，检测组也可见绿色荧光，其中，融合蛋白2E8R3的检测结果如图5所示，上述实验结果表明本发明的三种具有不同连接肽的融合蛋白均可与红细胞表明的H抗原表位特异结合，具有与2E8单克隆抗体相同的生物活性。

四、融合蛋白的竞争抑制试验

取4个10mL的试管，分别标记上检测管(3个)和对照管，分别加入5％的红细胞100μL，然后向3个检测管中分别加入步骤一表达及纯化的具有不同连接肽的三种融合蛋白(0.85mg/mL)，37℃孵育1小时，再向4个管中分别加入2E8单克隆抗体(3.84mg/mL)，37℃孵育1小时；取出试管，分别加入低离子液(LIM，东耀生物科技有限公司)700μL，混匀；再向4个管中分别加入2滴聚凝胺(购自东耀生物科技有限公司)，混匀，3400rpm离心30s，再向每管中加入500μL解离液(Resuspending，东耀生物科技有限公司)，振荡15s，各取10μL铺于玻片上，光学显微镜下观察。结果加入了本发明表达及纯化的三种融合蛋白的检测组的红细胞在聚凝胺的作用下，不再出现凝集现象，其中，融合蛋白2E8R3的检测结果如图6所示(右图为对照)，而对照组的红细胞出现凝集现象，表明本发明的三种具有不同连接肽的融合蛋白均可与红细胞表明的H抗原表位特异结合，具有与2E8单克隆抗体相同的生物活性。

                         序列表

<160>25

<210>1

<211>117

<212>PRT

<213>小鼠属小鼠(Mus musculus)

<400>1

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Tyr

            20                  25                  30

Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

        35                  40                  45

Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Lys Ser Ala Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Leu Leu

65                  70                  75                  80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Asn Tyr Gly Tyr Ser Pro Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr Leu

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ala

        115

<210>2

<211>112

<212>PRT

<213>小鼠属小鼠(Mus musculus)

<400>2

 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly

 1               5                   10                  15

 Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

             20                  25                  30

Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

        35                  40                  45

Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val

    50                  55                  60

Ser Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65                  70                  75                  80

Ile Gly Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Tyr Tyr Phe Cys Gln Gln

                85                  90                  95

Leu Tyr Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

            100                 105                 110

<210>3

<211>351

<212>DNA

<213>小鼠属小鼠(Mus musculus)

<400>3

caggtgcagt tgaaggagtc aggacctggc ctggtggctc cctcacagag cctgtccatc     60

acatgcactg tctctggatt ctcattatca ggatatagtg tacactgggt tcgccagcct    120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaaacac agactataaa    180

tcagctctca aatccagact gaccattagt aaggacaact ccaggagcca agttctctta    240

aaaatgaaca gtctgcaaat tgatgacaca gccatttact actgtgccag aaattacgga    300

tatagtccgt ttgttcactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a             351

<210>4

<211>336

<212>DNA

<213>小鼠属小鼠(Mus musculus)

<400>4

gacattgtga tgacacagtc tccatcctct ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact     60

atgagctgca agtccagtca gagcctttta aatagtgaca atcaaaagaa ctatttggcc    120

tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaacttctgg tgtactttgc atccagtagg    180

gaatcggggg tgtctgatcg gttcataggc agtggctctg ggacagattt cactcttacc    240

atcggcagtg tgcagtctga agacctggca tattacttct gtcagcaact ttatagaact    300

ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaata                              336

<210>5

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1               5                   10                  15

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

 1               5                   10

<210>7

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

Gly Gly Gly Gly Ser

1               5

<210>8

<211>244

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Tyr

            20                  25                  30

Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

        35                  40                  45

Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Lys Ser Ala Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Leu Leu

65                  70                  75                  80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Asn Tyr Gly Tyr Ser Pro Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr Leu

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

        115                 120                 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala

    130                 135                 140

Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

145                 150                 155                 160

Leu Leu Asn Ser Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

                165                 170                 175

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Ser Arg

            180                 185                 190

Glu Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

        195                 200                 205

Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Tyr Tyr

    210                 215                 220

Phe Cys Gln Gln Leu Tyr Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr

225                 230                 235                 240

Lys Leu Glu Ile

<210>9

<211>239

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Tyr

            20                  25                  30

Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

        35                  40                  45

Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Lys Ser Ala Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Leu Leu

65                  70                  75                  80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Asn Tyr Gly Tyr Ser Pro Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr Leu

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

        115                 120                 125

Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly Gln

    130                 135                 140

Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp

145                 150                 155                 160

Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser

                165                 170                 175

Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val Ser

            180                 185                 190

Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

        195                 200                 205

Gly Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Tyr Tyr Phe Cys Gln Gln Leu

    210                 215                 220

Tyr Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

225                 230                 235

<210>10

<211>234

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Tyr

            20                  25                  30

Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

        35                  40                  45

Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Lys Ser Ala Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Leu Leu

65                  70                  75                  80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Asn Tyr Gly Tyr Ser Pro Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr Leu

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln

        115                 120                 125

Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ser

    130                 135                 140

Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp Asn Gln Lys Asn Tyr

145                 150                 155                 160

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Val

                165                 170                 175

Tyr Phe Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ile Gly

            180                 185                 190

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Val Gln Ser

        195                 200                 205

Glu Asp Leu Ala Tyr Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Tyr Arg Thr Pro Phe

    210                 215                 220

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

225                 230

<210>11

<211>732

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

caggtgcagt tgaaggagtc aggacctggc ctggtggctc cctcacagag cctgtccatc     60

acatgcactg tctctggatt ctcattatca ggatatagtg tacactgggt tcgccagcct    120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaaacac agactataaa    180

tcagctctca aatccagact gaccattagt aaggacaact ccaggagcca agttctctta    240

aaaatgaaca gtctgcaaat tgatgacaca gccatttact actgtgccag aaattacgga    300

tatagtccgt ttgttcactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc aggtggcggt    360

ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatctgaca ttgtgatgac acagtctcca    420

tcctctctgg ctatgtcagt aggacagaag gtcactatga gctgcaagtc cagtcagagc    480

cttttaaata gtgacaatca aaagaactat ttggcctggt accagcagaa accaggacag    540

tctcctaaac ttctggtgta ctttgcatcc agtagggaat cgggggtgtc tgatcggttc    600

ataggcagtg gctctgggac agatttcact cttaccatcg gcagtgtgca gtctgaagac    660

ctggcatatt acttctgtca gcaactttat agaactccat tcacgttcgg ctcggggaca    720

aagttggaaa ta                                                        732

<210>12

<211>717

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

caggtgcagt tgaaggagtc aggacctggc ctggtggctc cctcacagag cctgtccatc     60

acatgcactg tctctggatt ctcattatca ggatatagtg tacactgggt tcgccagcct    120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaaacac agactataaa    180

tcagctctca aatccagact gaccattagt aaggacaact ccaggagcca agttctctta    240

aaaatgaaca gtctgcaaat tgatgacaca gccatttact actgtgccag aaattacgga    300

tatagtccgt ttgttcactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc aggcggtggt    360

gggtcgggtg gcggcggatc tgacattgtg atgacacagt ctccatcctc tctggctatg    420

tcagtaggac agaaggtcac tatgagctgc aagtccagtc agagcctttt aaatagtgac    480

aatcaaaaga actatttggc ctggtaccag cagaaaccag gacagtctcc taaacttctg    540

gtgtactttg catccagtag ggaatcgggg gtgtctgatc ggttcatagg cagtggctct    600

gggacagatt tcactcttac catcggcagt gtgcagtctg aagacctggc atattacttc    660

tgtcagcaac tttatagaac tccattcacg ttcggctcgg ggacaaagtt ggaaata       717

<210>13

<211>702

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

caggtgcagt tgaaggagtc aggacctggc ctggtggctc cctcacagag cctgtccatc     60

acatgcactg tctctggatt ctcattatca ggatatagtg tacactgggt tcgccagcct    120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaaacac agactataaa    180

tcagctctca aatccagact gaccattagt aaggacaact ccaggagcca agttctctta    240

aaaatgaaca gtctgcaaat tgatgacaca gccatttact actgtgccag aaattacgga    300

tatagtccgt ttgttcactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc aggtggcggc    360

ggatctgaca ttgtgatgac acagtctcca tcctctctgg ctatgtcagt aggacagaag    420

gtcactatga gctgcaagtc cagtcagagc cttttaaata gtgacaatca aaagaactat    480

ttggcctggt accagcagaa accaggacag tctcctaaac ttctggtgta ctttgcatcc    540

agtagggaat cgggggtgtc tgatcggttc ataggcagtg gctctgggac agatttcact    600

cttaccatcg gcagtgtgca gtctgaagac ctggcatatt acttctgtca gcaactttat    660

agaactccat tcacgttcgg ctcggggaca aagttggaaa ta                       702

<210>14

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>14

ggatcccagg tgcagttgaa ggagtcagga                                     30

<210>15

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>15

gccacccgac ccaccaccgc ccgagccacc gccacctgca gagacagtga ccagagtccc     60

<210>16

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>16

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<210>17

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>17

gctagcta tttccaactt tgtccccgag cc                                     30

<210>18

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>18

ggatcccagg tgcagttgaa ggagtcagga                                      30

<210>19

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>19

gccacccgac ccaccaccgc ctgcagagac agtgaccaga gtccc                     45

<210>20

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>20

ggcggtggtg ggtcgggtgg cggcggatct gacattgtga tgacacagtc tcca           54

<210>21

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>21

gctagcta tttccaactt tgtccccgag cc                                     30

<210>22

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>22

ggatccgccc aggtgcagtt gaaggagtca gga                                  33

<210>23

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>23

gtcagatccg ccgccacctg cagagacagt gaccagagtc cc                        42

<210>24

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>24

tctgcaggtg gcggcggatc tgacattgtg atgacacagt ctcca                     45

<210>25

<211>32

<212>DNA

<213>工序列

<220>

<223>

<400>25

gctagcta tttccaactt tgtccccgag cc                                     32