腐殖酸键合硅胶的制备方法

摘要

本发明涉及一种腐殖酸键合硅胶的制备方法，通过内嵌酰胺基团的方法将腐殖酸键合到硅胶上。本发明具有合成简单、原料便宜的特点，制备的腐殖酸键合硅胶性能稳定。制备的腐殖酸键合硅胶用于固相萃取时，表现出穿透体积大，单位质量吸附量高，选择性高的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种腐殖酸键合硅胶的制备方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

随着生命科学、环境科学、食品安全及制药、合成化学等的快速发展，与其相匹配的高效、快速的分离分析技术日益引起人们的广泛关注，其中分离介质是现代分离分析技术的物质基础和基本保证。目前，烷基键合相(如C₂、C₈、C₁₈)是液相色谱和固相萃取中应用最常见的分离介质，然而在许多具体的实际应用中，需要使用含特殊官能团的分离载体。因此，开展以色谱固定相和固相萃取填料为主的高效分离介质的分子设计、合成方法、表征技术及在分离分析中的应用研究，对促进分离分析科学的发展和对我国分离介质产业的形成和发展都具有十分重要的意义。

化学键合相色谱，尤其是长链烷基键合相，由于具有优良的疏水特征和化学、热稳定性，已在分析化学、生物化学、药物化学等领域得到了广泛的应用。但是近年来，在环境与药物分析中，用高效液相色谱分离含π电子的药物、农药、环境污染物等已成为人们所关注的热点，而芳烃固定相由于可与这类溶质发生π-π或n-π作用，特别适用于解决此类物质的分离。一般来说，文献报道的芳烃固定相的分离机理主要是基于以下四种类型的分子间作用：(1)π-π作用；(2)偶极-偶极作用；(3)疏水作用；(4)其它作用，如静电作用，包结络合作用等等。Cheng[Y.F.Cheng，T.H.Walter，Z.L.Lu，P.Iraneta，B.A.Alden，C.Gendreau，U.D.Neue，J.M.Grassi，J.L.Carmody，J.E.O’Gara，R.P.Fisk，LC-GC.，2000，18(11)，1162，1164，1166，1168，1170，1172.]等人比较了15种不同键合固定相在反相色谱条件下对饱和、不饱和化合物、稠环芳烃以及含重原子化合物的选择性，发现芳烃键合相对含重原子(Cl、Br、I、S、P)和C₂H₂(-CH＝CH-)单元的化合物具有较高的分离选择性。因而，可预测芳烃固定相对含有π电子的药物、农药或其它有机污染物具有较高的分离选择性。

色谱填料除在HPLC中有广泛的应用而外，在固相萃取中亦有极大的应用价值。固相萃取(SPE)是一种广泛使用的样品预处理方法，可以通过离线、在线等方式与色谱等技术联用，实现对复杂样品中分析物的定量测定[M.C.Hennion，J.Chromatogr.A，1999，856，3-54]。一般而言，固相萃取的填料能对一系列的化合物表现出吸附性能，但如何获得具有选择性的萃取填料成为目前关注的焦点。现代分析的检测对象中，含有π电子的化合物占有很大的比例，如食品和环境中的多环芳烃(PAH)、二噁英类化合物(PCD)、炸药中的硝基苯类化合物，生物体液、血液中的药物等。对于此类化合物进行预富集时，利用传统的固相萃取填料如烷基键合硅胶型填料存在样品回收率低，穿透体积小等问题，而对含π电子的样品具有高选择性的电荷转移型填料有望解决这些问题。

腐殖酸是动植物残体通过生物、非生物降解、缩合等各种作用形成的天然有机质。它组成复杂，没有统一的结构，一般来说有个芳环的核心，周围由许多直链和支链的结构通过醚键、酯键等其它共价键作用联系在一起[S.C.B.Myneni，J.T.Brown，G.A.Martinez，W.Meyer-ilse，Science 286(1999)1335.]。腐殖酸这种独特的结构使得它与金属离子、氧化物、矿物质和包括有毒有害物质在内的有机物发生相互作用，严重影响了这些物质的环境化学行为。充分了解腐殖酸对其它物质尤其是有毒有害难降解物质在环境中的迁移、转化及归宿的影响，对环境污染问题有非常重要的理论和现实意义。为探讨腐殖酸与农药或稠环芳烃等各种环境污染物的作用，有人将腐殖酸应用于色谱领域，制得的各种腐殖酸改性硅胶固定相，在色谱领域已展现出一定的应用价值。

Nielsen和André等分别制备了腐殖酸改性硅胶固定相，Nielsen等[T.Nielsen，K.Siigur，C.Helweg，O.Jrgensen，P.E.Hansen，U.Kirso，Environ.Sci.Technol.31(1997)1102.]率先利用腐殖酸含有氨基的特点，以戊二醛为中间体，将腐殖酸固载到氨基键合硅胶上，并将其应用于稠环芳烃等物质的保留研究，但其制备步骤繁琐。后来André等[C.André，C.Guyon，Y.C.Guillaume，J.Chromatogr.B 813(2004)295-302.]将腐殖酸直接吸附到烷基键合硅胶上，考察了杀虫剂等环境污染物与腐殖酸的相互作用，但上述方法得到的腐殖酸改性硅胶固定相在极性溶剂中不稳定，表面覆盖度小，应用价值有限。

发明内容

本发明就是针对上述不足，提供一种制备简单、性能稳定的腐殖酸键合硅胶的制备方法。

本发明提供的技术方案是：一种腐殖酸键合硅胶的制备方法，通过内嵌酰胺基团的方法将腐殖酸键合到硅胶上。

按照本发明，可先将腐殖酸进行酰氯化，然后与氨基键合硅胶反应。

按照本发明，按1克腐殖酸：10～20毫升氯化亚砜的比例，将腐殖酸和氯化亚砜混合加热回流反应8～24小时，减压蒸出氯化亚砜，制得腐殖酸的酰氯化合物；然后将腐殖酸的酰氯化合物与氨基键合硅胶反应得到腐殖酸键合硅胶；其中腐殖酸与氨基键合硅胶的质量比为1∶4～5。

按照本发明，先将硅胶在无水甲苯中与偶联剂3-氨基丙基三甲氧基硅烷(硅胶与偶联剂的用量质量比为1～10∶0.1～1.0)于N₂氛中，100-120℃反应12～24小时，冷却，抽滤，洗涤，真空干燥制得氨基键合硅胶，然后将氨基键合硅胶与腐殖酸的酰氯化合物在无水N，N-二甲基甲酰亚胺(DMF)中，于N₂氛下、100-120℃反应12～24小时，冷却，抽滤，洗涤得到腐殖酸键合硅胶。

本发明方法简单，制备的腐殖酸键合硅胶性能稳定。

附图说明

附图为本发明制得的腐殖酸键合硅胶作为高效液相色谱固定相分离富勒烯的色谱分离图。

具体实施方式

腐殖酸键合硅胶(HAAS)的合成：

(1)氨基键合硅胶(APTS)反应：取1.0～10.0g经真空干燥过的硅胶(或层析硅胶)于反应容器中，加入10～100mL无水甲苯和0.1～1.0g 3-氨基丙基三甲氧基硅烷，搅拌，于N₂氛中在100-120℃油浴中加热回流，反应12～24小时后，冷却，抽滤，依次用甲苯、丙酮洗涤，真空干燥后待用。

(2)腐殖酸的酰氯化合物(HAC)的合成：取腐殖酸固体于反应容器中，按1克腐殖酸：10～20毫升氯化亚砜的比例加入氯化亚砜，油浴加热回流搅拌反应8～24小时，减压蒸馏，将氯化亚砜及其它低沸点反应产物全部蒸出，剩余的固体为腐殖酸的酰氯化合物，加入DMF溶解，待用。

(3)腐殖酸键合硅胶(HAAS)的制备：按腐殖酸与氨基键合硅胶的质量比为1∶4～5的比例，搅拌下将APTS加入溶有HAC的DMF溶液中，N₂保护下在100～120℃油浴中加热反应12～24小时，抽滤，依次用DMF、丙酮、甲醇洗涤。

采用本发明的技术方案所达到的有益效果：本发明采用简便的方法合成了腐殖酸键合硅胶分离介质(HAAS)，自制了以HAAS为填料的固定相和固相萃取柱，通过优化操作条件，建立了完整的操作体系。它可以用于富勒烯等含π电子物质的分离，也可用于油中的稠环芳烃的预富集，并表现出较大的穿透体积，样品承受量高，选择性好，可再生重复利用的特点。

实施例1：腐殖酸键合硅胶固定相的制备

(1)氨基键合硅胶(APTS)的制备：取2.5g经真空干燥过的硅胶于100ml三口烧瓶中，加入50mL无水甲苯和0.25g 3-氨基丙基三甲氧基硅烷，磁力搅拌，于N₂氛中在100℃油浴中加热回流，反应24h后，冷却，抽滤，依次用甲苯、丙酮洗涤，60℃下真空干燥5h后待用。

(2)腐殖酸的酰氯化合物(HAC)的合成：取腐殖酸(平均分子量为6000，中国医药集团，中国上海)固体0.5g于50mL圆底烧瓶中，加入氯化亚砜5mL，油浴加热回流搅拌反应24h，减压蒸馏，将氯化亚砜及其它低沸点反应产物全部蒸出，剩余的固体为腐殖酸的酰氯化合物，加入60mL DMF溶解，待用。

(3)腐殖酸键合硅胶(HAAS)的制备：将溶有HAC的DMF溶液转入100mL三口烧瓶中，搅拌下加入2.0gAPTS，N₂保护下在100℃油浴中加热反应24h，抽滤，依次用DMF、丙酮、甲醇洗涤。

实施例2：

(1)氨基键合硅胶(APTS)的制备：取10.0g经真空干燥过的层析硅胶于250mL三口烧瓶中，加入100mL无水甲苯和0.1g 3-氨基丙基三甲氧基硅烷，磁力搅拌，于N₂氛中在120℃油浴中加热回流，反应12h后，冷却，抽滤，依次用甲苯、丙酮洗涤，60℃下真空干燥5h后待用。

(2)腐殖酸的酰氯化合物(HAC)的合成：取腐殖酸(分子量为40000，Alfa Aesar公司，美国)固体2.0g于50mL圆底烧瓶中，加入氯化亚砜20mL，N₂氛中，油浴加热回流搅拌反应24h，减压蒸馏，将氯化亚砜及其它低沸点反应产物全部蒸出，剩余的固体为腐殖酸的酰氯化合物，加入100mLDMF溶解，待用。

(3)腐殖酸键合硅胶(HAAS)的制备：将溶有HAC的DMF溶液转入250mL三口烧瓶中，搅拌下加入10.0gAPTS，N₂保护下在120℃油浴中加热反应12h，抽滤，依次用DMF、丙酮、甲醇洗涤。

实施例3：

(1)键合硅胶(APTS)的制备：取2.0g经真空干燥过的硅胶于250mL三口烧瓶中，加入30mL经处理过的无水甲苯和1.0g 3-氨基丙基三甲氧基硅烷，磁力搅拌，于N₂氛中在100℃油浴中加热回流，反应24h后，冷却，抽滤，依次用甲苯、丙酮洗涤，120℃下真空干燥5h后待用。

(2)腐殖酸的提取：将50g腐殖酸钠(沈阳天济物资有限公司)加入到500mL 0.2mol/LHCl溶液中搅拌，再静置倾去上层清液。沉淀物洗至中性后加入到500mL 0.5mol/LNaOH溶液中，适当振荡24h，静置过夜，离心分离，分离得到酱油状的溶液即为腐殖酸钠溶液，然后在上述溶液中加入浓度为0.1mol/L(50-200ml)的盐酸进行酸析，水浴恒温后此时腐殖酸即成凝胶状态从溶液中沉淀析出。将混和物静置24h，让其自行沉降分离，沉淀物用去离子水洗至无Cl^-检出，然后将腐殖酸掏出晾干，最终得到黑色腐殖酸(HA)颗粒。

(3)腐殖酸的酰氯化合物(HAC)的合成：取经提取后的腐殖酸固体0.5g于50mL圆底烧瓶中，加入氯化亚砜10.0mL，油浴加热回流搅拌反应12h，减压蒸馏，将氯化亚砜及其它低沸点反应产物全部蒸出，剩余的固体为腐殖酸的酰氯化合物，加入60mL DMF溶解，待用。

(4)腐殖酸键合硅胶(HAAS)的制备：将溶有HAC的DMF溶液转入100mL三口烧瓶中，搅拌下加入2.0gAPTS，N₂保护下在100℃油浴中加热反应24h，抽滤，依次用DMF、丙酮、甲醇洗涤。

实施例4：

按实施例1的方法将腐殖酸键合到比表面积为252m²/g，平均粒径为5μm的球形硅胶上，得到固定相HAAS。

以异丙醇为匀浆剂，甲醇为顶替剂，将2g HAAS固定相匀浆法装入150mm×4.6mm(i.d.)的不锈钢色谱柱中。

常温下，以腐殖酸键合硅胶为固定相，甲苯一环己烷(50/50，V/V)为流动相，流速为0.25ml/min，检测波长为380nm，进样C₆₀和C₇₀，进样体积达到0.5mL(C₆₀和C₇₀的饱和溶液)，两者均可得到基线分离，如附图所示，说明该固定相可用于C₆₀和C₇₀的制备分离。

实施例5：腐殖酸键合硅胶吸附介质的制备

按实施例2的方法将腐殖酸键合到200-300目的无定形层析硅胶上，得到吸附介质HAAS。取0.15g HAAS(腐殖酸键合层析硅胶)装入一次性医用注射器中构成固相萃取柱，采用真空泵提供负压来驱动样品溶液。

在进行萃取之前，首先用5mL二氯甲烷、2mL正己烷活化HAAS，然后在真空泵负压驱动下使样品溶液流过柱子，采用适量体积清洗液洗去基体的杂质，使用合适的洗脱液把分析物洗脱收集到试管中，于60～70℃水浴中用氮气浓缩后，加入内标物后进行定量分析。

在线评价HAAS(穿透体积的测量)：采用匀浆法，将0.102g HAAS装入一4.4cm×2.0mm，I.D.的不锈钢柱中，苯并(a)芘溶于正己烷中，配成5mg/L的溶液作为流动相，测得穿透体积为16.09ml，即对应于苯并(a)芘的吸附量为788.73μg/lgHAAS。结果表明HAAS对苯并(a)芘有很强的保留能力。

取食用油5±0.01g于10ml的容量瓶中，用正己烷稀释到刻度。1mL上样到已活化的腐殖酸萃取柱上，加入3mL正己烷/二氯甲烷(80∶20，v/v)清洗后，用2mL乙醇/二氯甲烷(10∶90，v/v)洗脱。洗脱液用氮气吹干，加100μL异丙醇溶解，进HPLC分析。

分离条件：Thermo ODS色谱柱(200×4.6mm i.d.，5μm)；流动相为甲醇：水(90∶10，v/v)；荧光检测器的激发、发射波长分别为255，420nm；流速1mL/min；进样量10μL。

回收率：进行萃取，计算回收率为93.32-100.06％，RSD≤3.43％。

实施例6：

按实施例5的方法将腐殖酸HAS I(平均分子量为6000，中国医药集团，中国上海)、HAS II(分子量为40000，Alfa Aesar公司，美国)或HAS III(沈阳天济物资有限公司)分别键合到200-300目的无定形层析硅胶上。比较得到的三种腐殖酸键合硅胶固相萃取吸附介质的吸附量及元素分析结果(见表1)。结果表明，不同来源的腐殖酸差异性不大。

表1腐殖酸键合硅胶的吸附量及元素分析结果

HAAS固相萃取吸附剂  碳含量(％)  氮含量(％)  氢含量(％)  硫含量(％)  吸附量(μg/g)    HAAS I    HAAS II    HAAS III    9.459    10.960    9.047    2.055    2.744    2.483    2.022    2.543    1.538    1.379    1.655    0.693    550.44    788.73    591.62

实施例7：

以萘和蒽为溶质，考察了HAAS在极性溶剂条件下的稳定性。发现HAAS在5000mL甲醇-水(体积比为50/50)的混合溶剂冲洗下其对萘和蒽的保留基本不变，表明HAAS在极性溶剂条件下的稳定性很好。