蒙古马耳缘组织成纤维细胞系及其培养方法

摘要

本发明利用蒙古马耳缘组织进行细胞初代培养、传代培养最终获得高活率、高纯度蒙古马成纤维细胞系，其保藏编号为CGMCC No.1876属于细胞生物学领域。本发明培养出的成纤维细胞无上皮细胞等，细胞纯度高；冻存细胞质量稳定，且细胞冻存后的细胞活率可达到93.2％～98.7％，传代生长稳定，适合大规模培养。本发明涉及的蒙古马耳缘组织成纤维细胞系可以为医学、细胞和分子生物学等生命科学研究提供大量高品质材料；可以作为疫苗生产的主要原材料及肝细胞培养的饲养层；同时可用于细胞凋亡、核移植及体细胞克隆等研究；在农业上可以丰富、改良地方马品种，是地方优良马品种的有效保种手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞系及其培养方法，具体地说是利用蒙古马耳缘组进行初代培养、传代培养获得蒙古马耳缘组织成纤维细胞系，属于细胞生物学领域。

背景技术

20多年来，由于国外优良畜禽品种的大量引进、集约化选育和生产等诸多因素，导致我国很多地方畜禽品种处于灭绝或濒临灭绝状态，如不及时采取有效措施进行抢救性保护，后果不堪设想。畜禽遗传资源是生物多样性的重要组成部分，是人类社会赖以生存、可持续发展和科技创新的重要物质基础。一个品种的灭绝意味着细胞生物学和分子生物学对它或它们进行研究的基本研究材料的永远丧失，如果这些品种在灭绝前未曾以任何方式将它们的种质资源保存下来，不仅永远丧失了其基因资源，而且使科学家们对于它们诸多未知的细胞生物学和分子生物学的机理的探索及通过体细胞克隆技术使之再现的愿望将永远成为谜和梦，同时也将是世界遗传资源遗产和生命科学理论宝库的巨大损失。因此，在全球性的抢夺生物资源和保护生物多样性的严峻形势下，根据我国资源保存的实际出发，通过构建重要畜禽品种的遗传资源细胞库和生物学特性研究，不仅在细胞水平上长久的保存重要畜禽品种的遗传资源，为畜禽品种基因组和后基因组及体细胞克隆等研究提供宝贵试验材料，同时更重要的是为我国畜禽遗传资源细胞库构建和生物学特性研究搭建了技术平台，为全国畜禽遗传资源细胞水平的保存和研究提供技术与理论的支撑和保障。

2000年联合国粮农组织(FAO)与联合国环境规划署的报道，目前全球畜禽品种以每周减少2个品种的速度在丧失，在被FAO所记录的2576个畜禽品种中，几乎半数被认为是濒危畜禽资源，约有1350个品种面临灭绝，使世界畜禽种质资源出现越来越狭窄的格局，因此挽救和保护濒危畜禽品种已成为当务之急。

我国畜禽生产力类型丰富，其遗传资源具有物种和品种繁多，起源和分布广泛，生态类型多样等特点，且我国地方品种所占的比例远远高于其他国家。我国畜禽具有抗病力强和优良经济性状的基因。

我国的畜禽遗传资源多样性状况不容乐观，而且有不断恶化的趋势。我国动物遗传资源20年来发生了很大的变化，41.9％的地方品种群体数量有不同程度的下降。70年代后期，以责任承包制为主体的农户经济，使马、驴、牛、骆驼等大牲畜数量锐减。80年代中后期猪和鸡的配套系又取代了本地猪鸡品种和新培养品种，致使我国家养动物种质资源受到严重破坏。据1983年的资料，项城猪等10个地方畜禽品种灭绝，北京油鸡等8个濒临灭绝，三江牛等20个品种数量正在减少。据1992年末的资料，在受调查的432个主要畜禽品种中，至少32个地方品种不能作为品种加以挽回或者已经灭绝；158个品种丧失原有的育种潜力，其中包括地方品种129个和近代育成品种29个。据1995～1999年对全国24个主要畜禽分布省区的391个地方品种的动态信息调查结果显示，灭绝品种由1983年的10个增至17个，新灭绝的品种为：豪杆嘴型内江猪、大普吉猪、草海鹅、文山鹅、思茅鹅、萧山鸡和舟山鸡。148个品种受到不同程度威胁，其中41个品种受到严重威胁；34个受到较大威胁；15个受到一般威胁；58个受潜在威胁，仅有243个相对安全。目前，71％的猪、44％的马驴、34％的牛、20％的家禽、15％的绵山羊种质受到不同程度的威胁。畜禽种质资源的危机，意味着畜禽种质所携带基因危机及畜禽遗传资源多样性的衰退，甚至是基因的永远消失和畜禽遗传资源多样性的丧失。

蒙古马是世界上较古老的马的品种。中国古代北方少数民族如匈奴、鲜卑、柔然、突厥、回鹘、契丹等，都有过发达的养马业。蒙古马是自古以游牧狩猎为生的蒙古民族在长年的生产生活中，积累了丰富的饲养和驯化的经验，一代一代不断培育出的优良马种。其特点是：体形较小、性格温顺、体质健壮、胸廓身长、被毛浓厚、不怕寒冷、不择食、极耐劳苦。《黑鞑事略》中记载：“因其马养之得法，骑数百里，自然尤汗，故可以耐远而出战。寻常正行路时，并不许其吃水草，盖辛苦中吃水草，不成膘而生病”，“战时参战后，就放回牧场，叫它饱食青草”。蒙古马一般自二岁起即可骑乘；四岁即可劳役；五六岁发育完全：成吉思汗在垂训中曾说：“马喂肥时能疾驰，肥瘦适中或瘦时也能疾驰，才可称为良马。不能在这三种状态下疾驰的马。不能成为良马”。2000年8月23日，蒙古马被列入农业部公告的78个国家级畜禽品种资源保护品种，2006年6月2日蒙古马又被列入农业部公告的138个国家级畜禽遗传资源保护品种。

目前，对于细胞生物学的研究已经从细胞整体和亚细胞结构的层面深入到了分子水平，并以动态的观点来研究细胞和细胞器的结构和功能，探索不同生物细胞的生长、发育、分化、代谢、免疫、繁殖、运动、衰老、死亡、遗传、变异和进化等基本生命活动的规律。因此，从本质上讲细胞生物学是生命科学研究的基础，如果离开了细胞生物学作为支撑，生命科学的研究将寸步难行。因此，在全球性的抢夺生物资源和保护生物多样性的浪潮中，根据我国资源保存的实际出发，通过构建濒危畜禽品种群体细胞系的方式来保存其基因资源，任务艰巨，责任重大，时间紧迫，意义深远。近年来，由于体外培养细胞在遗传资源保存和生命科学研究等诸多方面具有巨大的科学价值和应用价值，已引起各国政府高度重视。除美国外，日本大阪发酵所(IFO)、德国培养物保藏所(DSM)等都在逐渐扩大保藏范围，将细胞培养物列入保藏对象。

目前，低温冷冻保存技术的发展和完善使得任何体外培养物都可以在保持其活力的基础上无限期地得以保存，低温冷冻保存被公认为是细胞、组织与器官长期保存的最有效方法之一。畜类品种体外细胞的大量培养常采用EB病毒转化法、贴壁培养法和酶消化法进行，但对比试验结果表明：EB病毒转化法对于畜类品种的体外细胞培养并不适用，其培养的细胞活率及纯度均不能达到所需标准，EB病毒转化法对于人类和灵长类动物的细胞培养效果要优于畜类细胞培养；酶消化法和贴壁培养法获得的原代细胞分别经传代后接种，细胞群体倍增时间(PDT)分别为35.9h和48h。但前者操作步骤繁杂，不适合于体外大规模化细胞的培养，并且传代后易发生空泡化现象，后者简单易行，适合于体外大规模化细胞的培养。因此建立细胞系以采用后者为佳。对于哺乳动物细胞保藏而言，细胞纯度及活性均有较高的要求，目前，贴壁培养方法存在诸多弊端，如方法单一、成本过高、细胞活性及纯度偏低、细胞冻存复苏后死亡率过高等。因此，现在急需对其方法改进使蒙古马耳缘组织成纤维达到高活率、高纯度的标准，使其得到很好的保藏并延续下去。

发明内容

本发明的目的是提供蒙古马耳缘组织成纤维细胞系，其保藏号为：CGMCC No.1876。

本发明的另一目的在于提供上述细胞系的培养方法。    

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

高活性、高纯度的蒙古马耳缘组织成纤维细胞系，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC(地址：北京市海淀区中关村北一条13号；邮编：100080；电话：010-62542758)，保藏日：2006年12月1日，保藏号：CGMCC No.1876，建议的分类命名为蒙古马耳缘组织成纤维细胞系。该蒙古马耳缘组织成纤维细胞系具有以下特征：

蒙古马的耳缘组织块接种6h后即有细胞长出，1～2d即可贴满瓶壁。相差显微镜下可见细胞透明，胞质突起丰满，呈长梭形，胞核椭圆形、居中，核仁清晰。当细胞生长成片后，细胞呈长梭形，火焰状，细胞形态趋于一致，为单核成纤维样。同时，细胞性质稳定，增殖较快。

本细胞系生长速度快、成活率高、外源基因表达率高、细胞融合率和凋亡率低，应用范围广。

一种蒙古马耳缘组织成纤维细胞系的培养方法，该方法包括下述步骤：

(1)初代培养：将除去体表绒毛的蒙古马耳缘组织用PBS漂洗3～4次后剪切成0.5～1.0mm³的组织块；将组织块移入培养瓶，倒置培养瓶，并在37℃，5％CO₂的CO₂培养箱中培养3.5～4.5h；组织块完全贴壁后加入培养液7～10ml，培养液成分：DMEM+10％特级胎牛血清，继续培养10～12h；

(2)传代培养：弃除步骤(1)培养瓶内的培养液，用PBS洗涤培养瓶内残留物2次后，用胰蛋白酶消化后加入培养液6～10ml终止消化；消化后的细胞平均分装入2个培养瓶中，放入37℃，5％CO₂的CO₂培养箱中继续培养至冻存前24h；

(3)细胞冻存：

A、冻存前24h弃除培养瓶内培养液并更换新鲜培养液6～10ml，继续培养24h；

B、用胰蛋白酶消化培养细胞，然后加入培养液6～10ml终止反应；

C、用红细胞计数板计算冻存前细胞总数；

D、收集：1000rpm离心6～10min，去上清液，加入4℃预冷的冻存液1ml，吹打使细胞重悬；冻存液成分：10％DMSO 50％胎牛血清40％DMEM；

E、将细胞分装入灭菌的冻存管中封口；

F、预冻：将冻存管放于4℃冰箱20～30min，然后转入程序降温盒中，6～12h以上；

G、冻存：-70℃预冻的冻存管迅速投入液氮柜中，即完成细胞冻存。

上述蒙古马耳缘组织成纤维细胞系的培养方法，其中，步骤(2)及步骤(3)中所述的胰酶消化具体步骤是：向培养瓶内加入0.25％胰蛋白酶1.5～2.5ml，倒置培养瓶于温箱中预热至37℃后翻转消化30～60s。

上述蒙古马耳缘组织成纤维细胞系的培养方法，其中，根据实际需要可以将步骤(3)冻存的细胞进行细胞复苏，具体步骤为：将冻存管从液氮中取出置入42℃水浴中，连续晃动1min后，将细胞移入加有培养液(DMEM+10％胎牛血清)的培养瓶中吹打均匀，放置含37℃ 5％CO₂的培养箱中继续培养10～12h后即可继续传代培养。

本发明的优点与效益：本发明对于贴壁培养方法及培养基培养液成分的改进调整，可以使培养出的成纤维细胞无上皮细胞等杂质细胞，细胞纯度于现有技术相比有大幅提高；冻存条件的改进使复苏的细胞与冻存前相比，细胞类型仍为成纤维细胞，细胞形态和生长速度没有发生变化，冻存细胞质量稳定，且细胞冻存后的细胞活率可达到93.2％～98.7％，且细胞传代生长稳定，与现有细胞培养技术培养的细胞相比有显著提高，适合大规模培养。对于培养基的调整及培养方法的改进，还可以使培养成本大幅降低。本发明在方法等各方面弥补了现有畜体细胞保存状况不理想的情况，蒙古马耳缘组织成纤维细胞系活率及纯度的提升也使重要、濒危蒙古马品种的基因资源以体外培养细胞的形式得以长期保存。

由于蒙古马种质资源的匮乏，使得对于蒙古马在各领域内的研究成为空白。而本发明所述的高细胞活率及高纯度的蒙古马耳缘组织成纤维细胞系可以为医学、细胞和分子生物学等生命科学研究提供大量的高品质材料；并在农业上可以丰富、保护和改良地方禽畜品种；还可以作为是疫苗生产的主要原材料及肝细胞培养的饲养层；并可以作为核移植、畜体细胞克隆育种的供体细胞及细胞凋亡研究。

下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。

附图说明

图1为蒙古马耳缘组织成纤维原代细胞显微镜下图；

图2为蒙古马耳缘组织成纤维细胞I细胞显微镜下图；

图3为蒙古马耳缘组织成纤维继代II细胞显微镜下图；

图4为被支原体污染的成纤维细胞对照图；

图5为蒙古马耳缘组织成纤维细胞支原体检测阴性结果图示；

图6为蒙古马耳缘组织成纤维细胞生长曲线图；

图7为蒙古马耳缘组织成纤维细胞核型图示；

图8为蒙古马耳缘组织成纤维细胞乳酸脱氢同功酶电泳图示；

图9为蒙古马耳缘组织成纤维细胞苹果酸脱氢酶电泳图示；

图10为pEGFP-N3荧光蛋白质粒转染蒙古马耳缘组织成纤维细胞中表达48h 100倍图示；

图11为pEGFP-N3荧光蛋白质粒转染蒙古马耳缘组织成纤维细胞中表达72h 100倍图示；

图12为pEGFP-N3荧光蛋白质粒转染细胞株400倍图示；

具体实施方式

实施例中所用的主要仪器及试剂来源：

蒙古马耳缘组织来源：内蒙古呼伦贝尔市新巴尔虎左旗。

(一)主要仪器设备

1、激光扫描共聚焦显微镜：尼康TE-2000-E；

2、浮雕相差显微镜，Olympus IX-71；

3、生物显微镜，Olympus CX31；

4、倒置相差荧光显微镜：Olympus IX-71；

5、-70℃超低温冰箱：美国kelvinator；

6、电动移液器：德国Accu-jet；

7、颇尔超纯水器：Pall-pruelab_plus；

8、CO₂培养箱：Heraeus BB16UV；

9、液氮贮存器：四川东亚YES-50B-125F；

10、电泳仪：北京六一厂DYY-6C；

11、电泳槽：北京六一厂DYC-24A：    

12、高性能无菌实验台：哈尔滨DL-CJ-2N；

13、低速离心机：CENTERIGUGETDL-40B；

(二)主要试剂

1、DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)；

2、Plasmid Midi Kit质粒提取盒，Trizol试剂，cDNA合成试剂盒，cDNA PCR文库试剂盒，G418，pEGEP-N3质粒载体：Clontech；

3、胰蛋白酶(Trypsin 1∶250)，吉姆萨(Giemsa)：Amresco；

4、特级胎牛血清(Defined FBS)：Hyclone；

5、台盼蓝(Trypan Blue)，DMSO，秋水仙素(Colchicine)，EDTA，Triton(曲拉通)X-100＞99％，TEMED，Bis(甲叉双丙烯酰胺)98％，过硫酸铵(Ammonium Persulfate)，PMS，NAD，噻唑蓝(Thiazolyl Blue)，细胞松弛素B，Hoechst33342，离子霉素，6-DMAP：Sigma；

6、甘油分析纯华绿渊；

7、Tris：Promega；

8、丙烯酰胺＞99％(Acr)，甘氨酸＞99％(Clycine)：NOVON；

9、脂质体Lipofectin：Gibco公司；

成纤维细胞培养所用液体配制：

10、DMEM培养液：DMEM 9.6g，溶于超纯水中，用NaHCO₃约3.2g调节pH至7.2～7.4，加水定容至1L，用磁力搅拌器搅拌混匀，0.22μm滤膜过滤除菌，500ml/瓶分装，贮存于4℃。

11、培养液：DMEM培养液中加入终浓度为10％(体积比)的FBS，0.22μm滤膜过滤500ml/瓶分装，4℃贮存。

12、双抗贮存液：100万IU的链霉素4支，80万IU的青霉素5支溶于400ml灭菌去离子水中。

13、1×PBS缓冲液：NaCl 4.00g，KCl 0.10g，Na₂HPO₄·12H₂O 1.45g，KH₂PO₄0.10g，加超纯水定容至500ml，pH为7.2，高压灭菌密封后4℃贮存。

14、0.25％(质量体积比)胰蛋白酶溶液：1.25g胰蛋白酶干粉溶于PBS中，定容至500ml，pH为7.2～7.4，0.22μm滤膜过滤分装，-20℃贮存。

15、0.9％(质量比)生理盐水：0.45g NaCl溶于500ml超纯水，高压灭菌30min。

16、细胞冻存液：将50ml DMSO加入450ml全培养液(含体积比15％FBS的全培养液)中，用0.22μm滤膜过滤100ml/瓶分装，贮存于-20℃冰箱。

微生物检测所用试剂：

17、大豆胰蛋白胨：3g大豆胰蛋白胨，加100ml超纯水，调pH至7.3，高压灭菌15～20min，分装到15×150mm的玻璃管中。

18、麦芽汁：2g麦芽汁加100ml超纯水，调pH至3～4，高压灭菌15～20min，分装到15×150mm的玻璃管中。

19、DAPI染液：超纯水配制1mg/ml DAPI储存液，PBS稀释为0.5～1mg/ml。

20、封片液：22.2ml 0.1M的柠檬酸，27.8ml 0.2M的Na₂HPO₄溶于50ml甘油中，NaOH调节pH至5.5，贮存于4℃。

21、固定液：冰醋酸与甲醇以体积比1∶3的比例(现用现配)。

染色体标本制备所用试剂：

22、秋水仙素贮存液：10mg秋水仙素溶于l0ml超纯水中。

23、稀释液：超纯水将贮存液稀释10倍至终浓度为100μg/ml。

24、低渗KCl溶液：0.5g的KCl溶于100ml超纯水。

25、固定液：冰醋酸与甲醇按体积比1∶3的比例配制。

26、Giemsa染色液

原液：将1g Giemsa染粉倒入研钵，加几滴甘油，在研钵内研磨至无颗粒为止，然后加甘油至33ml，放在56℃保温箱2h后，加入45ml甲醇搅拌均匀，棕色瓶中贮存备用。

工作液：磷酸缓冲液将Giemsa原液稀释10倍至终浓度为10ml。

27、磷酸缓冲液的配制：KH₂PO₄ 0.34g加入100ml去离子水(用NaOH调pH6.8)脂质体转染细胞所用试剂：

28、质粒DNA(EGFP-N3)，脂质体Lipofectamine，不含血清的DMEM培养液，含血清的DMEM培养液，pH7.4的PBS。

同工酶分析所用试剂：

29、0.9％(质量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液：分别称取0.9g NaCl和0.0223gEDTA溶于100ml超纯水中即可。

30、蛋白提取液：将5ml TritonX-100加入75ml 0.9％(质量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液中即得蛋白提取液，将其贮于4℃冰箱保存。TritonX-100：0.9％(质量比)NaCl-0.0Gmmol EDTA溶液＝1∶15。

31、40％(质量体积比)蔗糖溶液：将40g蔗糖溶于100ml水中。

32、胶溶液的配制

A液：1mol/L HCl 48.0ml，Tris 36.6g，TEMED 0.23ml，用浓盐酸调至pH8.9

B液：Acr 40.0g，Bis 2g

C液：过硫酸铵0.14g(现配现用)

D液：1mol/L HCl 48.0ml，Tris 5.98g，TEMED 0.46ml，用浓盐酸调至pH6.7

E液：Acr 10.0g，Bis 2.5g

F液：核黄素4.0mg

G液：蔗糖40.0g

33、聚丙稀酰胺凝胶溶液浓度，见表1

表1

  酶种类              分离胶            浓缩胶  电极缓冲液    浓度    交联度    pH    浓度    交联度    pH  pH  LDH    7.5    2.6    8.9    3    2.1    6.7  8.3  MDH    8    2.5    8.9    3    2.1    6.7  8.3

34、电极缓冲液的配置：6g Tris，28.8g甘氨酸溶于1000ml蒸馏水，pH调至8.7

35、电泳指示剂：分别秤称取0.25g溴酚蓝和40g蔗糖溶于100ml水中。

36、LDH染色液配制(染色前1h配制)

乳酸钙100mg+0.05M Tris-HCl(pH8.0)20ml

噻唑蓝5mg+超纯水1.0ml

PMS 2.5mg+超纯水1.0ml

辅酶I(NAD)10mg

染色前，将以上保温试剂混合后，倒入20ml 2％(体积比)琼脂溶液中，混匀。

37、MDH染色液配制(染色前1h配制)

DL-苹果酸350mg溶于25ml 0.1M Tris-HCl(pH8.0)中

噻唑蓝15mg+超纯水1.5ml

PMS 5mg+超纯水1.0ml

辅酶I(NAD)10mg

将以上混合后，倒入25ml 2％(体积比)琼脂溶液中。

38、固定液的配制：乙醇10ml，乙酸40ml，甘油20ml，加水至80ml。

39、溴酚蓝溶液得配制：分别称取0.25g溴酚蓝和40g蔗糖溶于100ml水中。

40、固定液

冰醋酸与无水甲醇以体积比1∶3的比例混合，4℃贮存备用(现用现配)。

41、DAPI染液：超纯水配制1mg/ml DAPI储存液，PBS稀释为0.5～1mg/ml。

42、封片液的配制：将22.2ml 0.1mol/L柠檬酸与27.8ml 0.2mol/L Na₂HPO₄加入到50ml甘油中，用NaOH调pH至5.5，4℃贮存备用。

实施例1蒙古马耳缘组织成纤维细胞系的构建

(1)初代培养：无菌条件下，用眼科镊小心取出耳缘组织，置于小培养皿内，刮去组织表面采样时未剪净的毛，放入装有PBS的培养皿中漂洗3～4次，以去除表面血污；将组织剪切成0.5～1mm³的组织块；用移样匙将组织块分别移入培养瓶中分散均匀，倒置培养瓶，并在37℃，5％CO₂的CO₂培养箱中培养3.5～4.5h；组织块完全贴壁后加入培养基6ml～10ml，培养基成分：DMEM+10％特级胎牛血清，继续培养10～12h；

(2)传代培养：弃除步骤(1)培养瓶内的培养液，用PBS洗涤培养瓶内残留物2次后，以除去残余的血清和脱落的组织块及死细胞，向培养瓶内加入0.25％胰蛋白酶1.5～2.5ml，倒置培养瓶于温箱中预热至37℃后翻转消化30～60s后，在倒置显微镜下观察细胞质回缩，细胞间隙增大时，加入全培养液(10％FBS的DMEM)6ml～10ml终止消化；消化后的细胞平均分装入2个培养瓶中，放入37℃，5％CO₂的CO₂培养箱中继续培养至冻存前24h；

(3)细胞冻存：

A、弃除培养瓶内培养液并更换新鲜培养液6～10ml，培养液成分：DMEM+10％特级胎牛血清，继续培养24h；

B、向培养瓶内加入0.25％胰蛋白酶1.5～2.5ml，倒置培养瓶于温箱中预热至37℃后后翻转消化30～60s后，加入全培养液6～10ml终止反应；

C、用红细胞计数板计算冻存前细胞总数；

D、收集：1000rpm离心6～10min，去上清液，加入4℃预冷的冻存液1ml，混匀后用吸管轻轻吹打使细胞重悬；冻存液成分：10％DMSO 50％胎牛血清40％DMEM；

E、将培养物分装入灭菌的冻存管中严密封口，标明日期、品种、细胞名称、培养代数；

F、预冻：将冻存管放于冰箱4℃20～30min，然后装入降温盒中在-70℃冰箱中预冻10～12h；

G、冻存：提出冻存管放入液氮柜中，即完成细胞冻存。

(4)细胞复苏：将冻存管从液氮中取出，迅速置入42℃水浴中，连续晃动1min后，见余有小冰团成黄豆粒大小时放入超净工作台内；将细胞移入加有培养液(DMEM+10％特级胎牛血清)的培养瓶中轻轻吹打均匀，放置含37℃ 5％CO₂的CO₂培养箱中继续培养10～12h后即可继续传代培养。

实施例2蒙古马耳缘组织成纤维细胞系生物学特性的检测

对实施例1培养的蒙古马耳缘组织成纤维细胞系进行生物学特性检查，方法及结论如下。

一、细胞形态学观察

方法：细胞在体外培养过程中，对细胞进行常规检查，观察细胞生长状态、培养液颜色变化情况以及细胞是否发生污染。

结论：如图1(蒙古马原代细胞)、图2(蒙古马传代前细胞)、图3(蒙古马继代1细胞)、图4(蒙古马胚继代II细胞)所示，当细胞生长状态良好时，其形态为典型的成纤维状，呈现梭形或不规则三角形。对细胞群体的全貌观察，所培养的细胞均呈放射状、火焰状或漩涡状走势，证明细胞生长健康旺盛。

二、微生物检测

1、细菌、真菌检测

方法：

(1)取冻存细胞量0.5％的冻存细胞，于8ml无抗培养液中混匀，细胞悬液以1000rpm离心20min，并重复两次，以消除抗生素的影响。再重悬于2ml无抗生素的培养液中。

(2)将细胞以0.5ml接种到胰蛋白豆胨和麦芽汁培养基中，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。

(3)设对照为：

A.阳性对照：枯草芽孢杆菌和白假丝酵母菌分别接种到胰蛋白豆胨和麦芽汁培养基中培养，置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。

B.阴性对照：胰蛋白豆胨培养基和麦芽汁培养基，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。

结论：肉眼观察接种有蒙古马成纤维细胞的大豆胰蛋白胨培养液和麦芽汁培养液，均呈现清亮透明状，将试管置于显微镜下观察，除动物细胞呈圆形的透明状亮点漂浮在培养液中，无其它异物。证明在细胞培养冻存及细胞复苏的整个过程中，细胞未被细菌、真菌污染。

2、病毒检测

方法：

(1)接种待检测细胞培养物，用无抗生素的培养液培养至致密单层。

(2)采集新鲜的肝素抗凝全血(鸡血、豚鼠血)，1000rpm离心10min，弃上清。沉积的红细胞用PBS洗涤3次，用0.9％NaCl溶液悬浮，制成0.5％(V/V)的红细胞悬液。

(3)待检细胞弃除培养液，用0.9％NaCl溶液冲洗单层细胞2～3次。

(4)分别加0.5ml新鲜配制的鸡、豚鼠红细胞悬液于待检细胞瓶中，于4℃放置20min。

(5)观察红细胞凝集和吸附现象，不呈现红细胞吸附的细胞，需重复进行(2)～(4)的操作。

结论：

由于病毒表面有血凝素，能结合某些物种的红细胞，出现红细胞凝集现象。被这些病毒感染的细胞能够将鸡、豚鼠的红细胞吸附在其表面上。检测结果：在无抗生素的条件下常规培养蒙古马成纤维细胞，在相差显微镜观察，鸡的红细胞呈椭圆状悬浮在成纤维细胞上方，未出现凝集现象；豚鼠的红细胞呈圆形悬浮在上方，也未出现凝集现象。检测结果为阴性，证明该培养方法培养的细胞在培养过程中没有因为病毒而造成细胞损伤。

3、支原体检测

方法：

(1)标本：将成纤维细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml。

(2)培养：被检细胞在不含抗生素的培养液中传代培养3次以上(不低于3次)，在最后一次传代培养增殖期中换新鲜培养液，继续培养2～3d。

(3)接种：阴性对照皿加细胞培养液2ml；待检皿内加入待检样品2ml，在盖片上培养的细胞汇合之前，从瓶中取出(如细胞完全汇合，影响对支原体的观察)。

(4)漂洗：将细胞盖片置于碟皿中，用PBS漂洗，冷风吹干。

(5)固定：用固定液浸泡盖玻片，固定细胞10min后，重复步骤(4)。

(6)染色：将配制好Hoechst33258染液滴加到固定好的细胞上，室温下染色30min。

(7)漂洗：用PBS浸洗染色后的盖玻片3次，每次3～5min，冷风吹干。

(8)制片：将一滴含1％甘油的PBS加到染色后的细胞表面，将有细胞的盖玻片面朝下覆盖在载玻片上。

(9)观察：以100×～400×荧光显微镜观察，打开光源10min后，以330～380nm紫色荧光激发，观察细胞核外是否有蓝色荧光小点或丝状点的荧光物产生。

结论：

Hoechst 33258荧光染料能透过完整的细胞膜，嵌入DNA中，使之发出明亮的蓝色荧光。支原体内也含有DNA，亦能着色，在荧光显微电镜下观察可看到蓝色荧光。因此，在阳性对照中，除细胞核部位有蓝色荧光外，在细胞表面及周围也能看到蓝色点状或丝状荧光。而且在细胞表面同时有支原体DNA荧光染色颗粒和丝状小点，如图5所示。检测结果显示：体外培养蒙古马成纤维细胞制片后，在倒置荧光显微镜下，用380nm的紫色荧光激发，可以发现整个视野内可见的细胞表面均为光滑样，细胞核呈圆状或椭圆状，细胞核中的DNA发出蓝色荧光，且细胞周围无丝状或颗粒状小点。证明本细胞没有支原体污染，如图6所示。

三、细胞生长曲线绘制

方法：

(1)悬液制备

取待测生长状态良好的细胞，增至接近汇合时，用常规方法消化细胞制成细胞悬液，并计数。

(2)接种

向24孔培养板内分别接种相同数量的细胞，一般1～2×10⁴个/ml，于37℃CO₂培养箱中继续培养。

(3)计数检测

从接种时间算起，每隔24h计数3孔内的细胞密度，用血球计数板计算细胞总数，算出平均值，取3孔的平均值，如此至第8组结束。

(4)绘图

以培养时间(d)为横坐标、细胞密度为纵坐标，将结果在坐标纸上绘图，即得培养细胞的生长曲线。

结论：

通过对所培养的蒙古马体外培养细胞用常规方法制备细胞悬液，计数，接种24孔培养板，每孔1ml细胞悬液，对接种于24孔培养板的细胞进行连续7d定时记数，记录各次细胞密度，绘制而成培养细胞生长曲线如图7所示，接种后第2d细胞数开始增加，第3d进入对数生长期，第6d细胞生长缓慢，细胞生长期总体趋势均呈S型，细胞接种后均有24h的潜伏期，此期为细胞的适应阶段，是细胞由于接种时胰酶消化而致的损伤后的修复时期，此后细胞呈指数增殖，即指数生长期，最后进入停滞期，细胞生长缓慢，几乎停止，可见有细胞漂浮。而细胞分裂指数(MI)最高值(培养第2d)在进入对数生长期前出现，并在培养第2～4d时维持于一个较高的水平，随后下降到初始水平。本发明方法培养的蒙古马耳缘组织成纤维细胞系的纯度98.9％与现有技术培养细胞平均纯度91％相比有显著提高；且细胞群体倍增时间(PDT)为24h，与现有技术胶原酶消化技术和现有贴壁培养法获得的PDT35.9h和48h相比具有显著的提高，证明细胞纯度高、生命力旺盛。

四、细胞活率测定

方法：

检测冻存细胞的存活率可采用台盼蓝拒染试验，将待检细胞复苏后制成细胞悬液，取10μl细胞悬液加入10μl 1％台盼蓝染液，混匀。血球计数板计数，健康活细胞胞体完整，细胞透明，不着色，凡着色呈蓝色者为死细胞。计数1000个细胞，计算细胞存活率。统计二种细胞总数，以活细胞占细胞总数的百分比反映细胞活力。

结论：

细胞冻存前后对蒙古马耳缘组织细胞进行细胞活率测定。结果表明：冻存前细胞活率在95.8～98.7％之间，冻存后细胞活率为93.2％～96.7％，与现有细胞培养技术冻存后细胞活78.6％相比有显著的提高。且复苏的细胞与冻存前相比，细胞类型仍为成纤维细胞，细胞形态和生长速度没有发生变化，冻存细胞质量稳定。

五、核型的制备

方法：

1、加秋水仙素：取对数生长期的细胞培养物，加秋水仙素到培养液内，终浓度为0.1～0.4μg/ml。

2、在37℃培养箱中继续培养1～4h，使大部分细胞处于分裂中期。

3、采集分裂相细胞：加0.25％胰蛋白酶溶液用常规方法消化，然后加培养液，终止胰蛋白酶对细胞的作用。转入15ml离心管，以1000rpm离心8min，收集细胞。

4、低渗：将沉淀细胞用预热至37℃、0.075M KCl溶液2ml，重悬，吹打均匀后，继续加KCl溶液至10ml，放入37℃温箱中温育15min。

5、预固定：悬液中加入新鲜固定液(醋酸∶甲醇＝1∶3)1ml，轻轻打匀。

6、固定：将悬液以1000rpm离心8min，去掉上清夜，加入新鲜固定液5ml，打匀，室温静置20min。

7、重固定：重复2次，离心后去掉部分上清夜，剩余1～1.5ml，混匀。

8、滴片：滴2～3滴细胞悬液于45°倾斜载玻片，使细胞分散均匀，室温下干燥。

9、染色：用磷酸盐缓冲液(pH6.8)稀释10倍的Giemsa液染色10min，自来水冲洗，空气干燥。

10、镜检：油镜观察可见中期分裂相细胞和铺展的染色体，细胞质被染成蓝色，细胞核被染成淡紫色。

11、染色体照片及数据处理：每个品种统计100个分裂相以确定染色体数目，按Denver(1960)会议和Leven标准(1964)测量并计算染色体的三个参数即：相对长度、臂比值和着丝点指数，并确定染色体着丝点类型。三个参数的计算公式如下：

12、封片：过二甲苯两次后，用中性树胶盖玻片封片。

结论：

细胞系质量的国际标准之一是二倍体细胞的出现率达到85％以上，在本试验中，对100个蒙古马耳缘组织成纤维细胞的染色体数目计数，只对其是否为整二倍体进行计算，分别以第1～3代的细胞为研究对象。统计结果为：二倍体细胞占主体，为95％以上，说明所建蒙古马耳缘组织成纤维细胞系达到优质细胞的标准，细胞遗传性能稳定。

马的染色体数目为2n＝64，有13对中部/亚中部着丝粒、18对端着丝粒常染色体，X染色体为第二长的亚中部着丝粒染色体，Y染色体为其中最短的端着丝粒染色体之一。我们的实验结果符合这一结论。实验中分别计数100个第1代及第2代矮马成纤维细胞染色体，众数2n＝64的细胞数占检测细胞的93.1％及92.8％，说明该细胞系为稳定二倍体细胞系。蒙古马成纤维细胞核型见图7。

六、同工酶分离

方法：采用不连续梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法。

1、收集细胞，用PBS重新悬浮，记数；

2、清洗。用PBS洗细胞3次，离心弃上清夜；

3、用蛋白提取液重新悬浮细胞，密度达5×10⁷个/ml，吹打均匀；

4、将细胞悬液移到1.5ml离心管中，4℃下以1×10⁴rpm离心2min收取上清液，分装后置-70℃贮存备用；

5、上清液加入等量40％蔗糖溶液，混匀即为样品液；

6、用微量加液器向每个样品槽加样20～50μl，再用稀释10倍的电极缓冲液把每个样品槽补充满，然后向上下槽缓缓加入电极缓冲液。在上槽中加入1～2滴溴酚蓝，放入4℃冰箱；

7、接通电源，上槽为负极，下槽为正极，调节电压为120V维持1h，再调至220V，待溴酚蓝迁移至下端0.5～1cm处停止电泳，约5h；

8、电泳完毕，切去浓缩胶，用蒸馏水漂洗两次后，浸入染色液中置37℃温箱中保温染色30～60min，胶条染色后用凝胶固定液固定后照相；

9、用相对迁移率(Rf)表示，即区带泳动距离(d)与指示染料泳动距离(D)之比，计算公式为Rf＝d/D×100％。区带泳动距离一律按区带后缘的距离测量。

结论：

如图8所示，蒙古马耳缘组织成纤维细胞的乳酸脱氢同工酶酶谱从“阳极”到“阴极”分别为LDH1，LDH2，LDH3，LDH4，LDH5酶活性强弱依次为LDH5＞LDH4＞LDH3＞LDH2＞LDH1。利用蒙古马耳缘组织体外培养成纤维细胞进行乳酸脱氢同工酶(LDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)谱系分析可以得到清晰的特征谱系，LDH同工酶的相对迁移率见表3所培养的体细胞遗传性能稳定，纯度高，细胞之间未发生交叉污染。

表3

    品种  LDH1(％)  LDH2(％)  LDH3(％)  LDH4(％)  LDH5(％)    蒙古马  50  57.5  67  45  11.71

如图9所示，蒙古马的苹果酸脱氢酶谱各呈现2条区带，即sMDH(细胞质型)区带组和mMDH(线粒体型)区带组，且后者比前者泳动速度慢。LDH基因的表达受遗传基因和代谢物的双重控制，电泳速度快的区带本身分子量小。苹果酸脱氢酶的相对迁移率见表4，若细胞被污染，则会因为每个品种的迁移率不一样，结果就可能出现比现在更多数目的区带，所以图9结果证明所培养的细胞纯度高，没有与其他品种的细胞污染。

表4

  品种    sMDH(％)    mMDH(％)  蒙古马    52.17    67.8

七、pEGFP-N3在培养细胞中的表达及阳性细胞株的建立

方法：

1、荧光蛋白报告质粒(pEGFP-N3)的制备及鉴定：按照说明书，提取、纯化pEGFP-N3荧光蛋白基因质粒。将所得质粒溶于TE(PH8.0)低盐溶解液中，用紫外分光光度计测定其质粒浓度(质粒浓度[μg/ml]＝OD260×50μg/ml×稀释倍数)，得到的pEGFP-N3荧光蛋白质粒浓度为0.31μg/ml质粒DNA，OD260/OD280值在1.80～1.86之间，实验结果表明所提取质粒较纯，无RNA、无水乙醇和蛋白质等杂质。再用Nhe I和Xba I双酶切后，用1％琼脂糖电泳鉴定酶切结果，可以得到约750bp和4kb两条谱带。根据荧光蛋白质粒酶切图谱分析所获质粒确为所需pEGFP-N3荧光蛋白质粒。

2、脂质体介导法转染成纤维细胞

(1)、于转染前一天，用胰蛋白酶溶液消化细胞培养物，将细胞接种到6孔(或35mm)的培养板内，每孔1～2×10⁵细胞，加2ml含血清培养液；

(2)、置37℃的CO₂培养箱中培养细胞达到70～80％的汇合程度；

(3)、转染前，在倒置显微镜下观察，挑取生长旺盛、形态好的细胞用于转染；

(4)、将待转染的细胞不含血清的培养液漂洗细胞两次；

(5)、合并溶液A和B，轻轻混合后于室温下静置45min，然后加入0.8ml不含血清的培养液；

(6)、将DNA、脂质体和不含血清的培养液的混合物滴加在培养版中待转染的细胞表面，于CO₂培养箱中继续培养5～24h；

(7)、倒掉转染夜，加入含血清的培养液，于培养箱中继续培养细胞；

(8)、在488nm激发光激发下观察GFP荧光蛋白的表达结果，计算转染效率。

3、阳性细胞凋亡的检测

用Hoechst 33258染色液对各试验细胞组进行染色，在高倍镜下用激光共聚焦显微镜对阳性或阴性细胞进行观察，计算凋亡率，分析转基因过程对所有细胞的影响。

4、表达效率的统计

转染后，分别在24、48和72h用激光共聚焦显微镜观察各试验组细胞，每孔挑10个视野拍照，统计每个视野中总细胞数和阳性细胞数，计算转染效率。

5、转染抗性细胞的筛选

(1)、将蒙古马耳缘组织成纤维细胞转至25mL培养瓶中，每瓶加5mL细胞全培养液，待细胞长满，按下列浓度加G418：0、100、200、300、400、500、600、700、800g/mL，继续培养，观察细胞生长及死亡情况，每3天换液1次，仍以上述浓度加G418，两周内使细胞全部死亡的最小浓度即为最小致死量。确定浓度为800g/mL。

(2)、转染48h后，将细胞按1∶4密度传代，继续培养至细胞密度达70％-80％融合，弃培养液，更换浓度800g/mL的G418全培养液进行筛选，每3天换一次培养液，约10d后，对照细胞大部死亡，观察每孔中细胞克隆的形成数及荧光表达强度。G418培养液浓度换为300g/mL继续筛选培养，基本得到G418抗性细胞的稳定克隆。挑选荧光表达最强的单个细胞克隆转至50mL培养瓶进一步培养、传代扩增。

(3)、单克隆阳性细胞株荧光蛋白基因整合、表达的检测及鉴定

从挑选扩大培养的pEGFP-N3荧光蛋白阳性表达的蒙古马耳缘组织成纤维细胞培养物中提取基因组DNA，提取DNA的方法参考分子克隆实验指南(第三版)方法进行；pEGFP-N3荧光蛋白阳性RNA采用Trizol试剂提取，mRNA的反转录根据cDNA合成试剂盒，cDNA PCR文库试剂盒说明书的方法进行。设计了特异引物P1(5’-TTCTCGCCACCATGGTGAGCAA-3’)，P2(5’-TTC TCGCGGCGGCCGCTTTACTTG T-3’)扩增6种荧光蛋白阳性细胞基因组DNA，用同一对引物对6种荧光蛋白阳性细胞RNA进行RT-PCR，引物18S51(5’-GGCAGCGTCCGGGAAACCAAATTC-3’)和18S31(5-CCACCCACAGAATCGAGAAAGAGC-3’)扩增18sRNA作为RT-PCR内参照。PCR反应总体积为25μl，PCR程序：95℃热变性5min，然后以94℃，30s，57℃，30s，72℃，30s 进行35个循环后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测荧光蛋白基因的整合及表达情况。

结论：

如图10、11所示，蒙古马耳缘组织成纤维细胞的转染峰出现在转染后48h，转染率为65.5％；转染72h后阳性细胞和部分阳性细胞荧光强度均逐渐减少、减弱。将细胞以1∶4的比例传代，传代3～4h待细胞贴壁后，开始用G418筛选，筛选2周后，获得的多个克隆中，有些仍能看到荧光表达，有些看不到，挑选表达强烈的克隆进行了扩大培养，目前传了7～10代，这些细胞仍然表达荧光，而且荧光强度仍然强烈。利用设计荧光蛋白基因特异引物，对提取的pEGFP-N3荧光蛋白阳性细胞基因组DNA进行PCR扩增，获得了一条750bp左右的片段，与设计的引物预期扩增的片段大小正好相符，说明荧光蛋白基因都已经整合到细胞的基因组染色体上。用同一对引物，对提取的pEGFP-N3荧光蛋白阳性细胞RNA反转录获得的cDNA进行扩增，也获得了750bp左右的片段，从RNA水平上证实了荧光蛋白基因在蒙古马耳缘组织成纤维细胞中能够正常的转录、表达。成功获得了已经整合到细胞核染色体上的pEGFP-N3荧光蛋白基因阳性细胞株。如图12。

实验证明pEGFP-N3报告基因在本蒙古马耳缘组织成纤维细胞系细胞表达率远高于其它细胞系的30～40％，表达率均在60％以上。本研究结果对于标记基因、核移植及转基因动物克隆等研究具有重要的参考价值。

使用DNA的特异性荧光染料Hoechst 33258，对各试验组细胞进行染色后，用激光扫描共聚焦显微镜观察可发现绝大多数细胞均呈规则的圆形或椭圆形，其细胞核呈弥散均匀的蓝色荧光，几乎没有不规则的荧光小碎片，即凋亡小体；而仅有极少数细胞的细胞核或细胞质内可见浓染致密的蓝色颗粒块状荧光，凋亡率仅为0.6％，该情况与未转染的对照组0.5％的细胞凋亡率相比，属正常凋亡现象。实验证明本细胞系具有很强的接受外源基因能力。整合外源基因后的细胞其凋亡率与正常细胞凋亡率无明显差异。