构建狗脊药材HPLC标准指纹图谱和鉴别药材质量的方法

摘要

本发明涉及构建狗脊药材HPLC标准指纹图谱和鉴别药材质量的方法，用于狗脊药材质量鉴别，它公开了供试品中粉在20ml80％甲醇溶液中超声提取60min后，过滤得供试品溶液。高效液相色谱条件：色谱柱迪马C18柱(200×4.6mm，5μm)，柱温30℃；流动相乙腈－1％乙酸溶液，梯度洗脱，流速1ml/min；检测波长350nm。取10批广西产狗脊药材进行测定，找出共有峰，经软件似合建立标准指纹图谱，共有8个主要共有特征峰，为G1至G8，保留时间分别为7.4min，17.3min，21.3min，25.5min，29.8min，33.0min，39.3min，41.0min；再用待测药材测定的指纹图谱与标准指纹图谱比较，相似度大于0.950的药材应用于生产。

说明书

技术领域

本发明涉及狗脊药材HPLC标准指纹图谱的构建方法，以及用此标准指纹图谱鉴别药材质量的方法。

背景技术

狗脊药材在南方各省均有种植，由于品种、产地、采收期不同而造成的质量参差不齐，因而其制成品，质量药效及稳定性也难以保证。现行国家药典标准中狗脊的质量控制关键部分为断面显微鉴别，和原儿茶醛、原儿茶酸的薄层鉴别。这些对于此药材的真伪鉴别和质量评价是片面的。断面显微鉴别不能评价药材好坏，只能用来鉴别真伪，而且对于药粉无能为力。狗脊药材据报道含原儿茶醛、原儿茶酸、β-谷甾醇、胡萝卜苷、山奈素、硬脂酸、咖啡酸等多个成分，原儿茶醛、原儿茶酸只是其中的两个成分，现时还不知道这两个成分是否为狗脊的起效成分，而且原儿茶醛在其他药材中也含有，如丹参。所以通过用原儿茶醛、原儿茶酸两个成分来鉴别药材和评价质量好坏就显得片面。因此要控制狗脊药材的质量，就不能只针对其中一、二个化学成分，必须对它的物质群整体予以控制，通过科学的方法从由单个化学成分组成的物质群这个整体来全面的控制药材质量。

目前，对狗脊中化学成分的研究较多，但均是通过一种提取方法(溶剂萃取、SFE)得到某一类成分，再经重结晶或正相硅胶柱层析得到单一化学组分，或直接用GC-MS分离检测，这些都是化学研究，还不能直接应用于药材质量控制。

中药指纹图谱是指某种中药材(提取物、中成药)中所共有的、具有特征性的成分共同组成的光谱或色谱的图谱。它借用了法医学指纹鉴定的概念，运用现代分析技术得到中药材(提取物、中成药)的一系列特征信号，由这些特征信号组成的图谱具有个体的惟一性，代表了被测物的特征。中药指纹图谱技术从二维的“面”来鉴别中药材(提取物、中成药)的异同，强调的是图谱间整体的相似性。指纹图谱技术可以用在鉴别中药的真伪、生产质量监控、药材到成品某些成分的变化、同种产品之间的质量差异等多个方面，它提供了较常规质量标准更深层次的质量评价模式，增强了中药质量的可控性，是得到国外很多国家认可的植物药质量评价模式。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱技术对于有效控制中药材(提取物、中成药)的质量，具有重要的意义。

直至今天为止，用反相高效液相色谱一次性检测出狗脊多个成分并建立指纹图谱的方法未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建狗脊药材HPLC标准指纹图谱和鉴别药材质量的方法，可用作全面评价药材质量，保证药材质量在一定范围内稳定、一致、可控。

本发明的技术解决方案是：

第一步，构建标准指纹图谱，方法如下。

(a)、供试品溶液制备：狗脊药材磨成中粉，称取1.0g于具塞锥形瓶中，加入20ml 80％甲醇溶液，超声提取60min，放冷，滤过，取续滤液用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。

(b)、色谱条件：Agilent 1100型高效液相色谱仪，DAD检测器，检测波长350nm；迪马C18柱(200×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流速1ml/min；流动相为乙腈、1％乙酸溶液，梯度洗脱，洗脱比例为：

T(min)      CH3CN(％)      1％CH3COOH(％)

  0         5              95

  20        5              95

  80        45             55

  90        5              95

(c)、测定法：分别吸取供试品溶液20ul注入液相色谱仪测定，记录90min的色谱图。

通过对10批广西产狗脊药材进行测定，找出其主要共有特征峰，经软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》拟合建立HPLC标准指纹图谱。共选出8个主要共有特征峰，为G1-G8号峰，保留时间分别为：7.4min，17.3min，21.3min，25.5min，29.8min，33.0min，39.3min，41.0min。所述8个峰保留时间的相对标准偏差RSD％均小于1％。10批药材的指纹图谱与标准指纹图谱间的整体相似度经软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》计算均大于0.950。

第二步，以上述相同方法测定待测狗脊药材供试品的指纹图谱。

第三步，将待测狗脊药材的指纹图谱与标准指纹图谱比较，采用软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004B》计算整体相似度，筛选相似度大于0.950的狗脊药材应用于产品生产。

另外，需要说明的是：由于指纹图谱技术还未成为国家标准，所以本发明中试验和生产用狗脊药材均要达到药典中的相应国家标准要求。

本发明运用反相高效液相色谱一次性检测出狗脊多个成分，找出10批药材共有的色谱峰作为特征峰，建立了标准指纹图谱，也就是将色谱图中反映出来的成分色谱峰的顺序、比例和相互制约关系作为药材的特征。在相同色谱条件下其它批次药材指纹图谱与已建立的标准指纹图谱比较，通过计算整体相似度评价药材质量。

本发明具有以下优点：

1、标准指纹图谱中的8个主要特征峰为狗脊药材的主要成分，有效表征了狗脊药材的质量，从而实现对狗脊最大可能的化学成分检测，有利于对狗脊药材质量的全方面监控。

2、与现有方法相比，本发明为全面、准确评价狗脊药材的质量提供了新的对照标准。它即避免了只测定一、二个化学成分而判定狗脊整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。

3、通过本发明增强对药材真伪的辨识力，并从所含化学成分整体具有共性特征的角度更全面地评价药材质量，保证药材质量在一定范围内稳定、一致、可控。

4、本发明简便、快捷、稳定、精密度高、稳定性好、易于掌握。

附图说明

图1是本发明的HPLC标准指纹图谱。

具体实施方式

一、构建狗脊HPLC标准指纹图谱

1、仪器与试药

1.1、仪器

Agilent 1100液相色谱仪，DAD检测器；上海必能SB5200超声波清洗器。

1.2、试药

甲醇，分析纯；乙酸，分析纯；乙腈，色谱纯，迪马公司出品；超纯水，娃哈哈纯净水；10批广西产狗脊药材。

上述狗脊药材经检测达到药典中的相应国家标准要求。

2、色谱条件

检测波长350nm；迪马C18柱(200×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流速1ml/min；流动相为乙腈、1％乙酸溶液，梯度洗脱，洗脱比例为：

T(min)      CH3CN(％)       1％CH3COOH(％)

  0         5               95

  20        5               95

  80        45              55

  90        5               95

3、标准指纹图谱建立

3.1、供试品溶液制备：狗脊药材磨成中粉，称取1.0g于具塞锥形瓶中，加入20ml 80％甲醇溶液，超声提取60min，放冷，滤过，取续滤液用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。

3.2、测定法：分别吸取供试品溶液20ul注入液相色谱仪测定，记录90min的色谱图。

3.3、构建标准指纹图：按照所述方法，通过对10批广西产狗脊药材进行测定，找出其主要共有特征峰，经软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》拟合建立HPLC标准指纹图谱。共选出8个主要共有特征峰，为G1-G8号峰，保留时间分别为：7.4min，17.3min，21.3min，25.5min，29.8min，33.0min，39.3min，41.0min。所述8个峰保留时间的相对标准偏差RSD％均小于1％。10批药材的指纹图谱与标准指纹图谱间的整体相似度经软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》计算均大于0.950。

3.4、方法学考察

3.4.1、精密度考察

以同一供试液，连续进样6次，考察仪器的精密度。以特征峰保留时间和峰面积计算，结果8个主要共有特征峰保留时间的RSD％＜0.3％，峰面积的RSD％＜3％。结果表明此方法精密度良好。

3.4.2、稳定性考察

以同一供试液，在0，1.5h，3h，4.5h，6h，24h进样，考察样品的稳定性。考察指标同精密度。结果8个主要共有特征峰保留时间的RSD％＜0.3％，峰面积的RSD％＜3％。结果表明供试液在24h内稳定。

3.4.3、重复性考察

在同一批狗脊药材中，按照制备方法，分别重复提取5份，然后进行HPLC分析，以主要成分峰面积计算。结果8个主要共有特征峰峰面积的RSD％＜3％。结果表明此方法重复性良好。

二、按照所述检测方法和条件对2批待测市售狗脊药材(除已采用的10批以外)进行测定，采集90min色谱图。此待测市售狗脊药材经测定，结果符合药典中狗脊药材标准。

三、将采集到的待测狗脊药材的指纹图谱与标准指纹图谱比较，采用软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004B》计算整体相似度，结果相似度分别为0.982，0.989。两批药材与标准指纹图谱的相似度大于0.950，可以在生产中使用。