法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-08-06
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C07K17/10 授权公告日:20120718 终止日期:20130614 申请日:20050614
专利权的终止
2012-07-18
授权
授权
2007-09-05
实质审查的生效
实质审查的生效
2007-07-11
公开
公开
发明领域
本发明特别涉及通过固定化硬金属离子亲和层析法分离和纯化肽特别是多肽如重组蛋白的领域。
发明背景
产生重组(遗传工程)的用于在人类或动物中的治疗用途的肽包括寡肽和多肽特别是蛋白的一个重要方面是将所述肽纯化到足够高水平的纯度,以便所需要的蛋白实际上完全没有污染,特别是以下蛋白的污染,(a)可能在生产过程(通常为发酵方法或类似方法,使用选择的或遗传修饰过的合适的微生物菌株)中产生的任何无关蛋白,和(b)可能在生产过程中导入的不希望的金属离子(特别是重金属离子)。
固定化金属离子亲和层析法(IMAC)是通用的分离方法,它利用了很多生物聚合物所表现出来的对金属离子的亲和力的差异。所述技术包括合适的金属离子在固体支持物基质上的螯合作用,所述基质的表面事先用多齿配体进行过化学修饰。随后所得到的固定化金属离子螯合复合物具有与存在于相互作用蛋白表面上的一个或多个电子供体基团配位的潜力(Sulkowski,E.,Trends in Biotechnology,3(1985)1-6;Porath,J.,Carlsson,I.,Olsson,I.and Belfrage,G.,Nature,258(1975)598-599;Kagedal,L.,in″Protein Purification″(Ed.,J.C.Janson,and L.Ryden),VCH Publishers(1989)pp.227-251;Zachariou,M.and Hearn,M.T.W.,Biochemistry,35(1996)202-211。然后根据与各种吸附蛋白的固定化金属离子复合物的热动力学稳定性的差异,获得了分离选择性。其吸附复合物最不稳定的蛋白被最先洗脱,而形成更稳定的复合物的蛋白较后洗脱。相应的蛋白/固定化金属离子配位复合物的平衡缔合常数的差异越大,即离解常数(KD)的差异越大,所获得的分辨率越高。因此,氨基酸组成,特定氨基酸残基的表面分布,以及蛋白的构像都在决定蛋白对特定IMAC系统的亲和力方面发挥重要作用。因此,可以分辨在电荷,分子大小和氨基酸组成方面具有非常类似的特性,但是在它们的三级结构上不同的蛋白。
在过去20年中,对IMAC应用的大部分研究的兴趣点一直是围绕具有边界硬度的第一排过渡金属离子的应用(参见下文),如Cu2+,Zn2+和Ni2+。这些金属离子表现出中等的金属离子稳定常数,例如,对于芳族和脂族胺,以及对于羧酸官能团来说logβ值在5-10之间(Wong,J.W.,Albright,R.L.and Wang,N.H.L.,Separationand Purification Methods,20(1991)49-57;Zachariou,M.,Traverso,I..,Spiccia,L.and Hearn,M.T.W.,Journal of PhysicalChemistry,100(1996)12680-12690)。多种对M2+离子表现出这种结合特性的自由的三齿螯合物可以通过化学方法固定化到支持材料上。尽管它们在相应的logβ值大小和它们所得到的相对低的选择能力方面有限,自由类型的螯合化合物如亚氨基二乙酸(IDA)构成了迄今为止用于所述IMAC研究的主要类型的螯合配体[参见,例如,Kagedal,L.,in″Protein Purification″(Eds.J.C.Janson andL.Ryden),VCH Publishers(1989)pp 227-251]。基于固定化M2+-IDA的IMAC系统的典型用途包括利用固定化Cu2+-IDA从发芽的小麦中纯化α-淀粉酶[Zawistowska,U.,Sangster,K.,Zawistowski,J.,Langstaff,J.and Friessen,A.D.,Cereal Chemistry,65(1988)5413-5418];和利用固定化Zn2+-IDA从人血浆中纯化人凝血因子VII[Weeransinghe,K.M.,Scully,M.F.and Kadder,V.V.,BiochimicaBiophysica Acta,839(1985)57-65]和纯化α1-硫醇蛋白酶[Otsuka,S.and Yamanaka,T.(Eds),″Metalloproteins-Chemical Propertiesand Biological Effects″in″Bioactive Molecules″,Kodansha Ltd,Tokyo(1988),pp18-45]。IDA-型IMAC方法应用的扩展,即利用固定化Ni2+-次氨基三乙酸(Ni2+-NTA)纯化重组蛋白[Hochuli,E.,Bannwarth,W.,Dbeli,H.and Stuber,D.,Bio/Technology,6(1988)1321-1324](NTA是IDA的结构同系物),取决于相应于多-组氨酸肽通常为六-His的多核苷酸序列在基因水平上的掺入,所述肽赋予所述蛋白结合固定化Ni2+-NTA螯合复合物的更高的亲和力,因此使得所述蛋白能够选择性地保留在该IMAC吸附剂上。在本申请中,术语“吸着剂”和“吸附剂”主要用于表示官能化的聚合物基材(聚合物基材具有固定化在它上面的配体)与配位结合的金属离子,不过,上述术语还偶尔用于表示在它上面没有结合金属离子的官能化聚合物基材。
从以上对IDA-和NTA-型IMAC系统的用途的说明可以看出,用IMAC系统改变蛋白结合选择性的备选方法是通过改变螯合配体(ligate)的结构实现的。不过,在最近几年中,只引入了少数几种新的IMAC螯合配体。其中包括基于以下的系统:二齿螯合剂氨基氧肟酸(AHM)和8-羟基喹啉(8-HQ)[Zachariou,M.,Traverso,I.,Spiccia,L.and Hearn,M.T.W.,Journal of Physical Chemistry,100(1996)12680-12690];羧甲基天冬氨酸(CM-ASP),其对Ca2+的亲和力比IDA高[Porath,J.,Trends in Analytical Chemistry,7(1988),254-256;Mantovaara,T.,Pertofz,H.and Porath,J.,Biotechnology Applied Biochemistry,11(1989),564-569];正-磷酸丝氨酸(OPS),其能够螯合“硬的”金属离子,如Fe3+,Al3+,Ca2+和Yb3+,这是由于磷酸基团的参与[Zachariou,M.,Traverso,I.and Hearn,M.T.W.,Journal of Chromatography,646(1993),107-115];以及其他的三齿配体,如(2-吡啶基甲基)氨基乙酸酯(CPMA),二吡啶甲基胺(DPA)和顺-或反-羧甲基-脯氨酸[Chaouk,H.,Middleton S.,Jackson W.R.and Hearn,M.T.W.,InternationalJournal of BioChromatography,2(1997)153-190;Chaouk,H.andHearn,M.T.W.,Journal of Biochemical and Biophysical ResearchMethods,39(1999)161-177],四齿配体,如次氨基三乙酸(NTA)[Hochuli,E.,Bannwarth,W.,Dobeli,H.,Gentz,R.and Stuber,D.Bio/Technology,6(1988)1321-1325],它对M2+离子的亲和力比IDA高,因为它们的四齿性质,由于与IDA-型三齿配体相比失去了一个配位位点而具有较低的蛋白结合缔合常数;和五齿配体,如四亚乙基五胺(TEPA)[Hidaka Y.,Park,H.and Inouye,M.,FEBS Letters,400(1997)238-242]或N,N,N’-三(羧甲基)乙二胺(TED)[Porath,J.,Protein Expression & Purification,3(1992)263-281],其能通过五个供体原子与金属离子配位(即,对于TEPA来说,伯胺基团的两个氮原子和仲胺基团的三个氮原子,以及对于TED来说,仲胺基团的两个氮原子和来自三个羧基基团的三个氧原子)。
在将相对温和的洗脱条件用于层析方法时,用固定化金属离子亚氨基二乙酸螯合物(im-Mn+IDA)系统业已观察到了明显的金属离子泄露[Oswald,T.,Hornbostel,G.,Rinas,U.and Anspch,F.B.,Biotechnology Applied Biochemistry,25(1997)109-115;Kagedal,L.in Protein Purification(eds.J.C.Janson and L Ryden)VCHPublishers,New York(1989),pp 227-251]。因此,除了选择性调节问题之外,开发新型螯合配体的其他动机是与迄今为止一直使用的IDA-型或NTA-型系统相比,需要实现金属离子稳定常数的显著提高[Zachariou,M.,Traverso,I.,Spiccia,L.and Hearn,M.T.W.,Analytical Chemistry,69(1996)813-822]。
WO 03/042249特别涉及含有官能团的官能化的聚合物基材类别,其包含一个或多个环状、金属离子配位配合基团,所述基团具有至少3个金属离子配位供体原子,这些原子独立选自N,O和S。在用作基质供一个或多个金属离子与这些供体原子形成配位键,同时保留空的配位位点时,发现这些官能化的聚合物基材具有非常高的强度和/或对蛋白或多肽形式的融合蛋白的结合选择性,所述蛋白或多肽是用另一寡肽序列(“标记”) “标记过的”,掺入了一个或多个适当定位的氨基酸残基,能够形成与所述金属离子的空的配位位点的配位键。与无关蛋白的结合相比,融合蛋白对所述基质的结合的总体上明显更大的强度和/或选择性,有利于从含有融合蛋白和一种或多种无关蛋白的混合物中分离所述融合蛋白。在WO 03/042249中披露的优选的官能化(金属离子配位)聚合物基材采用了这样的官能团,其中,每一个环状、金属离子配位基团中的金属离子配位供体原子由该环中的三个氮供体原子组成,并且,它们特别适合用作某些金属离子的基质,这些离子具有相对“硬度”或“软度”而言的边界特性(参见下文),如Cu2+或Ni2+。非常适合作为“硬的”金属离子(如Ca2+,Mg2+,Mn2+和Fe3+)或相对“边界”硬度而言处于等级的“硬的”末端的金属离子(如Zn2+)的基质的官能化的聚合物基材系统,在WO 03/042249中描述较少。
发明的简要说明
本发明的一个目的是提供基于“硬的”金属离子(如Ca2+,Mg2+和Fe3+)和相对“边界”硬度而言位于所述等级的“硬的”末端的金属离子(如Zn2+)的新型IMAC系统,它通过与存在于生物分子中的硬的供体原子[特别是羧酸基团中的(如Asp或Glu氨基酸残基中的)氧原子和/或磷酸基团]的相互作用发挥功能。这种新型IMAC-型系统的重要特征是,它们能够同时获得与它们的靶分子的相互作用的混合模式,这种模式是基于配位(电子供体/电子受体)和静电(离子交换)过程的组合。其结果是,这种新型IMAC-型系统能够以具有选择性的形式起作用,这种作用是通过独特的相互作用的混合模式介导,因此,提供了蛋白纯化的新能力的机会。
因此,本发明的一方面涉及用官能团官能化的聚合物基材,所述官能团包含至少一个环状、金属离子配位配合基团,它在所述环状基团的环中包括至少3个氮供体原子,所述氮原子中的至少一个具有与它共价结合的可选经取代的羧基(低级烷基)基团或可选经取代的膦酰(低级烷基)基团。本发明的第二方面涉及上述类型的官能化的聚合物基材,还包括与所述官能团中的至少一个环状配合基团配位的金属离子。本发明的其它方面还包括制备所述官能化的聚合物基材的方法。
本发明的其他重要方面涉及:
在本发明中非常适合作为“标记”掺入到融合蛋白中的寡肽;
所述类型的融合蛋白,包括在它的氨基末端或羧基末端,或这两个末端,或感兴趣的蛋白的内部氨基酸序列中的位置与至少一种所述寡肽融合的感兴趣的蛋白;
编码所述融合蛋白的多核苷酸构建体,例如,载体;
包括所述多核苷酸构建体的宿主细胞;
生产所述类型的融合蛋白的方法,其中,上述类型的宿主细胞在所述融合蛋白能够表达的条件下,在生长培养基中培养,并由此从所述培养基中回收所述融合蛋白;和
纯化感兴趣的蛋白的方法,其中,让野生型蛋白或含有所述融合蛋白(包含感兴趣的蛋白)以及其他蛋白(无关蛋白)的蛋白样品与本发明的官能化的聚合物基材或含有金属离子的本发明的官能化的聚合物基材接触。
发明的详细说明
正如已经指出的,本发明的第一方面涉及用官能团官能化的聚合物基材,所述官能团包含至少一个环状、金属离子配位配合基团,它在环状基团的环中包括至少3个氮供体原子,其中至少一个氮原子具有与它共价结合的可选经取代的羧基(低级烷基)或可选经取代的膦酰(低级烷基)基团。
本发明的有用的聚合物基材包括水溶性聚合物和大体上水不溶性的聚合物,并且可以从多种聚合材料中选择。这些材料的例子如下:
多糖及其衍生物,包括琼脂糖,葡聚糖,纤维素,半纤维素,淀粉,和木聚糖等,以及这些多糖的衍生物。合适的多糖衍生物一般包括这样的衍生物,其中,所述多糖的一定比例的羟基被衍生化,以便形成醚(例如,低级烷基醚,如甲基醚)或酯(例如低级羧酸酯,如乙酸酯,和丙酸酯等),以及这样的材料,其中,起始多糖或它的衍生物业已通过用合适的交联剂处理进行过交联。
一般来说,基于大体上水不溶性的聚合物的本发明的官能化的聚合物基材,例如,非常适合装填成层析柱,用于直接导入介质(批量使用)和类似材料中,并且,特别适合本发明的这种类型的用途的多糖包括琼脂糖,葡聚糖及其衍生物,其多种合适的类型可以通过商业渠道方便地获得。因此,例如,多种琼脂糖产品是由AmershamPharmacia Biotech,Uppsala,Sweden生产的,并且以SepharoseTM为商标出售;可以得到的等级包括SepharoseTM 2B,4B和6B。各种等级的琼脂糖的交联衍生物(通过SepharoseTM与2,3-二溴丙醇交联制备)也可以从同一家公司购买,并且分别以SepharoseTM CL-2B,CL-4B和CL-6B,SepharoseTM 4和6 Fast Flow,SepharoseTM 6MB,和SuperoseTM 6和12为商标出售。
适用于本发明的多种葡聚糖-型或葡聚糖-琼脂糖复合材料也可以从Amersham Pharmacia Biotech公司获得,商品名称为SephadexTM,SuperdexTM(例如SuperdexTM 30,75和200)和SephacrylTM。SephadexTM范围内的产品是通过使葡聚糖与表氯醇交联制备的,并且以以下等级提供:SephadexTM G-10,G-15,G-25,G-50,G-75,G-100,G-150和G-200,随着G数字的增加,交联程度降低。SephacrylTM范围内的产品是通过让烯丙基-葡聚糖与N,N’-亚甲基-二丙烯酰胺交联制备的,并且包括SephacrylTM S-100,S-200,S~300,S-400,S-500和S-1000;后六种产品的差别表现在它们的孔径范围和粒度分布方面。SuperdexTM范围内的产品是通过让烯丙基-葡聚糖与各种组成的琼脂糖衍生物交联制备的。
聚亚烷基二醇及其衍生物,特别包括聚乙二醇(PEG),即乙二醇的缩聚物,其通式为HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH或H(OCH2CH2)nOH,并且它的平均分子量一般在200-6000的范围内。有多种PEG’s(包括平均分子量分别为400,600,1500,4000和6000的PEG’s)以各种名称(例如MacrogolTM,PEGTM,CarbowaxTM,NycolineTM,PluracolETM,Poly-GTM,Polyglycol ETM,SolbaseTM)从多个商业来源获得。PEG’s一般可溶于水,以及乙醇和多种其他有机溶剂,包括芳族烃,或者与它们混溶。类似的聚丙二醇[通式为H(OC3H6)nOH],其中的较低分子量的成员可溶于水,同样与本发明相关。所述聚亚烷基二醇的相关的衍生物包括部分醚化的衍生物,例如,这样的衍生物,其中,末端羟基之一业已被转化成低级烷基醚基团,如甲基醚基团。所述聚合物可方便地固定化在支持材料上,以便生产随后可以被激活的底物,并且随后用大环金属离子结合螯合配体通过本发明方法官能化或衍生化。
聚乙烯聚合物,包括聚乙烯醇-即羟基聚合物,通常是通过水解(“醇解”)聚乙酸乙烯酯的各种分子量部分生产的,通常通过碱或酸水解-及其衍生物。“醇解”程度可以通过以下方法改变:让聚乙酸乙烯酯中的乙酸酯基团的水解进行到大体上完成,或者通过在需要的醇解程度上使它停止。聚乙烯醇通常以四种分子量范围出售,即大约250,000-300,000(被称为超高粘度),大约170,000-大约220,000(被称为高粘度),大约120,000-150,000(被称为中等粘度)和大约25,000-大约35,000(被称为低粘度)。一般,聚乙烯醇的分子量越低,它们的水敏感度越高或者更容易溶于水。不过,醇解程度还在聚乙烯醇的水溶性和其他特性方面发挥作用。上述所有范畴内的聚乙烯醇都与本发明相关,如同例如它们的醚衍生物,如甲基醚衍生物。
感兴趣的其他聚乙烯聚合物材料包括以下材料,如ToyopearlUTMHW范围的多孔的为中等和低压力液相层析而设计的半刚性球形凝胶颗粒。所述材料在激活和官能化/衍生化之后,提供了制备与本发明相关的IMAC吸附剂的另一选择方案。ToyopearlTM HW凝胶(可以从Tosoh公司,Yamaguchi,Japan,和其他供应商处获得)是从只含有C,H和O原子的亲水性乙烯基聚合物合成的。可以获得的等级(在粒度和孔径方面不同)包括ToyopearlTM HW-40,HW-40C,HW-40F,HW-40S,HW-50,HW-50F,HW-50S,HW-55,HW-55F,HW-55S,HW-65F,HW-65S和HW-75F。
聚丙烯酰胺及其衍生物,包括基于聚丙烯酰胺和琼脂糖的复合材料,如UltrogelTM AcA凝胶(小球形式的复合的聚丙烯酰胺-琼脂糖,例如可以从Amersham Pharmacia Biotech公司获得)。UltrogelTM AcA凝胶范围包括AcA 22,AcA 34,AcA 44和AcA 54,其中,有关数字表示丙烯酰胺和琼脂糖的百分比,即,AcA 22包含2%丙烯酰胺和2%琼脂糖。所述支持材料的羟基的激活,提供了制备IMAC吸附剂的途径。
表面改性的二氧化硅,包括缩水甘油基丙氧基-改性的多孔二氧化硅,如LiChroSpherTM Diol(E.Merck,Darmstadt,Germany),ToyosodaTM TSKSW3000(Tosoh Corp.,Yamaguchi,Japan);氨基丙基-改性的二氧化硅,通过氨基丙基二乙氧基硅烷与具有合适孔径和合适平均直径的二氧化硅起反应(在存在合适催化剂的条件下)制备;和巯基丙基二氧化硅,通过巯基丙基二乙氧基硅烷与具有合适孔径和合适平均直径的二氧化硅起反应(在存在合适催化剂的条件下)制备。另外,具有合适孔径和合适平均直径的葡聚糖改性的或丁二烯-乙烯共聚物改性的二氧化硅可以用作层析支持材料。“裸露的”多孔二氧化硅适合所述衍生化以及随后的改性,以便产生相应的新型IMAC吸附剂,这种二氧化硅可以从多家供应商处方便地获得,包括E.Merck,(Darmstadt,Germany),Tosoh公司,Yamaguchi,Japan),Eka-NobelAB(Gteborg,Sweden)和Grace Davison GmbH(Worms,Germany)。
表面改性的金属氧化物,包括缩水甘油基丙氧基-改性的多孔氧化锆、氧化钛或氧化铝,以及它们的改性/变体,基于用第二种金属氧化物“掺杂的”各金属氧化物;通过让氨基丙基二乙氧基硅烷与具有合适孔径和合适平均直径的氧化锆、氧化钛或氧化铝起反应(在存在合适催化剂的条件下)制备的氨基丙基-改性的氧化锆、氧化钛或氧化铝;和通过让巯基丙基二乙氧基硅烷与具有合适孔径和合适平均直径的氧化锆、氧化钛或氧化铝起反应(在存在合适催化剂的条件下)制备的巯基丙基-改性的氧化锆、氧化钛或氧化铝。另外,具有合适孔径和合适平均直径的葡聚糖改性的或丁二烯-乙烯共聚物改性的氧化锆、氧化钛或氧化铝可以用作层析支持材料。“裸露的”多孔氧化锆、氧化钛或氧化铝适合所述衍生化和随后的修饰,以便产生相应的新型IMAC吸附剂,这种材料可以从多个供应商处方便地获得,包括YMC有限公司(Kyoto,Japan),Grace GmbH(Worms,Germany)和BioSepra公司(Paris,France)。
本发明的非常适合的聚合物基材包括琼脂糖,葡聚糖及其衍生物,例如,从上文所列举的材料中选择的材料。
在本发明的一个方面,本发明的官能化的聚合物基材中的环状、金属离子配位配合基团源于选自下列一组的杂环:三氮杂环烷和-环烯;和四氮杂环烷和-环烯。在所述官能化的聚合物基材中,特别适合的环状、金属离子配位配合基团包括源于选自下列一组的杂环的基团:
1,4,7-三氮杂环壬烷;
1,4,7-三氮杂环癸烷;
1,4,8-三氮杂环十一烷;
1,5,9-三氮杂环十二烷;
1,4,7,10-四氮杂环十二烷;
1,4,7,10-四氮杂环十三烷;
1,4,7,11-四氮杂环十四烷;
1,4,8,11-四氮杂环十四烷;
1,4,8,12-四氮杂环十五烷;和
1,5,9,13-四氮杂环十六烷。
与本发明的后一方面相关的是,在三-或四氮杂环烷或-环烯类型的上述环状、金属离子配位配合基团之一中的一个或多个环-CH2-基团或-CH=基团中(和/或在某些场合下,在环-NH-基团中)的氢原子可以选择性地被选自可选经取代的低级烷基基团和可选经取代的芳基基团的取代基取代;适合取代氢原子的选择性取代基的其他例子,特别是适合取代三或四氮杂环烷或-环烯类型的金属离子配位配合基团中的环-CH2-或-CH=基团中的氢原子的其他例子包括可选经取代的低级烷氧基基团。所述的低级烷基基团,低级烷氧基基团或芳基基团上的选择性的取代基可选择性地包括一个或多个金属离子配位供体原子,如一个或多个O或S供体原子。
在本发明中所使用的术语“低级烷基”用于表示具有1-6个碳原子的任何线性(直链)、分支或环状的烷基。线性烷基的例子有甲基,乙基,丙基,丁基,戊基和己基;分支的烷基的例子有异丙基,异-丁基,仲-丁基,叔丁基,异戊基和异己基;环状烷基的例子有环丙基,环丁基,环戊基和环己基。一般,具有1-3个碳原子的线性或分支低级烷基基团(即甲基,乙基,丙基和异丙基)非常适用于本发明。本发明的低级烷基基团上的合适的选择性取代基包括卤素,羟基,低级烷氧基和可选经取代的芳基。
在本发明中所使用的术语“低级烷氧基”用于表示具有1-6个碳原子的任何线性、分支或环状烷氧基基团。线性烷氧基基团的例子有甲氧基,乙氧基,丙氧基,丁氧基,戊氧基和己氧基;分支的烷氧基基团的例子有异丙氧基,仲-丁氧基,叔丁氧基,异戊氧基和异己氧基;环状烷氧基基团的例子有环丙氧基,环丁氧基,环戊氧基和环己氧基。一般,具有1-3个碳原子的线性或分支的低级烷氧基基团(即甲氧基,乙氧基,丙氧基和异丙氧基)非常适合本发明。
在本文中,术语″芳基″用于表示任何芳族基团,并且包括碳环和杂环芳族基团。它的例子有苯基,萘基,吡啶基,四唑基,噻唑基,咪唑基,吲哚基,喹啉基,嘧啶基,噻二唑基,吡唑基,唑基,异唑基,噻吩基,呋喃基或二唑基。本发明的芳基基团上的合适的选择性取代基包括卤素,氨基,羟基,低级烷基和低级烷氧基。
术语″卤素″表示Cl,F,Br或I。
对于与环状、金属离子配位配合基团中的至少一个环N原子共价结合的可选经取代的羧基(低级烷基)或可选经取代的膦酰(低级烷基)基团来说,羧甲基(-CH2COOH)和膦酰甲基[CH2PO(OH)2]分别业已证实是非常合适的。对于上面所提到的三氮杂环烷或-环烯类型的环状金属离子配位配合基团来说,似乎有利的是,三个环N原子中的至少两个(即两个或三个)具有与它共价结合的可选经取代的羧基(低级烷基)或可选经取代的膦酰(低级烷基)基团(例如,羧甲基或膦酰甲基)。对于上述四氮杂环烷或-环烯类型的金属离子配位基团来说,似乎有利的是,四个环N原子中的至少两个(即两个,三个或四个)具有与它共价结合的可选经取代的羧基(低级烷基)或可选经取代的膦酰(低级烷基)基团(例如,羧甲基或膦酰甲基)。
这种可选经取代的羧基(低级烷基)或可选经取代的膦酰(低级烷基)基团中的低级烷基部分上的合适的选择性取代基(例如,羧甲基或膦酰甲基的-CH2-部分上的选择性取代基)包括可选经取代的芳基,即,芳基(例如苯基)和经取代的芳基[例如,(低级烷基)苯基,如甲基苯基,乙基苯基,丙基苯基,异丙基苯基,环丙基苯基,环丁基苯基,环戊基或环己基苯基,其中,苯环上的低级烷基可以处在相对携带羧基或膦酰基团的碳原子的任何位置(即2-,3-或4-位)上。
一般有利的是,本发明的官能化的聚合物基材中的官能团通过接头或间隔基团X共价结合到聚合物基材上,所述基团X结合在环状、金属离子配位配合基团的环氮原子上。接头或间隔基团X可以是任何合适类型的接头或间隔基团,不过,通常是可以由双功能有机化合物(例如,具有至少两个反应性官能团的有机化合物,所述官能团选自以下基团,如羧基,硫醇,氨基丙基,卤素和环氧基(epoxy))一方面通过与聚合物基材上的合适的反应性官能团起反应,另一方面通过与环状、金属离子配位配合基团的环中的合适的反应性官能团(在这种场合下是经取代的氨基(-NH-))起反应衍生而来。通常非常适用于本发明的一种类型的接头或间隔基团X是这样的基团,它可以通过让表氯醇的卤素末端与例如所述聚合物基材表面上的羟基起反应,然后让它的环氧基与环状配合基团中的经取代的氨基起反应衍生而来。
在本发明官能化的聚合物基材的特别有用的实施方案中,所述接头或间隔基团X是可以由表氯醇衍生而来的基团,通过让它与琼脂糖或琼脂糖衍生物形式的聚合物基材起反应,然后让所得到的产物与变成与X结合的环状、金属离子配位配合基团的环-NH-基团起反应。
通过本说明书可以看出,本发明用于分离和纯化需要的蛋白(感兴趣的蛋白)的材料(官能化的聚合物基材)的重要特征是,在该材料中存在金属离子,它本身与官能团中的环状配合基团配位结合,并且反过来又能够与融合蛋白的寡肽“标记”部分的氨基酸残基中的供体原子配位结合,并且具有合适的选择性,其中,所述寡肽“标记”与感兴趣的蛋白的氨基酸序列结合。因此,本发明的另一方面涉及上述官能化的聚合物基材,其中,所述官能团中的环状配合基团中的至少一个具有与它配位的金属离子。本文所披露和描述的官能化的聚合物基材特别适合某些二价(2+带电的)或三价(3+带电的)金属离子的配位,特别是选自Ca2+,Mg2+,Zn2+和Fe3+的金属离子。正如本文所提供的实施例所表明的(参见下文),Ca2+是这方面的通用金属离子。
正如业已简要指出的,本发明的另一方面涉及制备本发明的官能化的聚合物基材的方法,该方法包括以下步骤:
选择具有反应性官能团的聚合物基材,所述官能团能够与具有第一和第二官能团的双功能试剂的第一官能团发生第一种反应;所述第一种反应导致了在聚合物基材和双功能试剂之间形成共价键;所得到的共价结合的试剂的第二官能团随后能够与存在于包括至少一个环状、金属离子配位配合基团的种类(species)中的反应性环-NH-基团发生第二种反应,所述环状金属离子配位配合基团在环状基团的环中包括至少3个氮供体原子,其中的至少一个氮原子具有与它共价结合的可选经取代的羧基(低级烷基)或膦酰(低级烷基)基团;并且,第二种反应导致了在所述种类和共价结合的试剂之间形成共价键;
让所述聚合物基材与所述双功能试剂起反应;和
让所得到的共价结合的试剂与所述种类起反应。
与本发明的上述方法相关的是,所采用的聚合物基材,和在该方法中所采用的反应性种类中的环状、金属离子配位配合基团,可以从上文结合本发明的官能化的聚合物基材所讨论的物质中选择。所用的双功能试剂通常是双功能有机化合物,例如具有至少两个反应性官能团的有机化合物,这些官能团选自以下基团,如羧基,硫醇,氨基丙基,卤素和环氧基。表氯醇可特别用作为多种类型的聚合物基材的双功能试剂,包括具有表面羟基的多糖及其衍生物.
正如通过上文对本发明的官能化的聚合物基材进行的讨论中可以看出的,含有所述环状、金属离子配位配合基团的反应性种类将合适地是能够产生上述类型之一的官能团(在所得到的官能化的聚合物基材产物中)的种类。因此,用于本发明方法的合适的反应性种类,包括含有一个或多个环状、金属离子配位配合基团的种类,所述基团具有反应性环-NH-基团,并且是由选自下列一组的杂环衍生的:三氮杂环烷和-环烯或四氮杂环烷和-环烯,例如包括一个或多个具有反应性环-NH-基团并且是由选自下面的杂环衍生的环状、金属离子配位配合基团的种类:
1,4,7-三氮杂环壬烷;
1,4,7-三氮杂环癸烷;
1,4,8-三氮杂环十一烷;
1,5,9-三氮杂环十二烷;
1,4,7,10-四氮杂环十二烷;
1,4,7,10-四氮杂环十三烷;
1,4,7,11-四氮杂环十四烷;
1,4,8,11-四氮杂环十四烷;
1,4,8,12-四氮杂环十五烷;和
1,5,9,13-四氮杂环十六烷。
上面针对与环状、金属离子配位配合基团的至少一个环N原子共价结合的可选经取代的羧基(低级烷基)或膦酰(低级烷基)基团的讨论(本发明的官能化的聚合物基材的说明)同样适用于本发明的上述方法。因此,羧甲基(-CH2COOH)和膦酰甲基[-CH2PO(OH)2]非常适合分别用作可选经取代的羧基(低级烷基)基团和膦酰(低级烷基)基团。
通过以上讨论还可以看出,琼脂糖和琼脂糖衍生物(如上述SepharoseTM产物)非常适合用作上述本发明方法中的聚合物基材。因此,非常合适的双功能试剂是表氯醇,并且在这方面可能有利地在所述聚合物基材与表氯醇起反应时进一步在反应混合物中掺入还原剂,如硼氢化钠。
本发明的范围还包括通过上述制备官能化的聚合物基材的方法获得或可通过其获得的官能化的聚合物基材。
另外,本发明的范围还包括制备本发明的官能化的聚合物基材的方法,所述聚合物基材还包括与其中的至少一个环状、金属离子配位基团配位的金属离子,该方法包括让本发明的官能化的聚合物基材与所述金属离子(例如,业已提到过的金属离子之一)的无机盐[例如硝酸盐,卤化物(氟化物,氯化物,溴化物,碘化物),硫酸盐,高氯酸盐,四氟硼酸盐,六氟磷酸盐或磷酸盐]或有机盐[例如,羧酸盐(如甲酸盐,乙酸盐,丙酸盐,或苯甲酸盐),四苯基硼酸盐或磺酸盐]的水溶液接触。通过所述方法获得或可通过其获得的含有金属离子的官能化的聚合物基材也属于本发明的范围。
对硬金属离子(和具有边界硬度的金属离子)具有强亲和力的金属离子配位(螯合)配体的选择和制备:本发明所定义的官能化的聚合物基材的重要的和有价值的用途是将它的含有金属离子的实施方案用于纯化蛋白,所述蛋白是融合蛋白形式的,其中,感兴趣的蛋白在它的氨基或羧基末端与寡肽“标记”融合,如本发明的含有Asp的寡肽。另外,两个感兴趣的蛋白或多肽分子或两种不同的感兴趣的蛋白或多肽分别在它们的氨基末端或羧基末端与寡肽“标记”同时融合,如本发明的含有Asp的寡肽,产生了新的融合蛋白结构,由此所述寡肽“标记”位于连接两个感兴趣的蛋白或多肽分子的内位(即内部位置)。
并非所有的螯合配体都满足固定化金属亲和层析法(IMAC)的合适配体的要求。所述螯合配体用于两个目的:(a)它们将金属离子固定到固体支持物上,和(b)它们调节金属亲和力结合,并因此调节吸附中心的强度和亲和特异性1。理想的是,所述螯合配体应当与金属离子形成稳定的复合物,以便在所述分子的吸附和解吸期间没有金属离子被释放到溶剂相中或转移到生物分子上。与此同时,它还应当留下至少一个,优选两个或两个以上金属离子的配位位点可用于蛋白结合。
图1:固定到基质(聚合物基材)上的配体
业已根据公开的方法2-4合成了基于大环cyclen和tacn的六种配体,并且其含有羧甲基或膦酰甲基悬垂臂。这些配体是1,4,7-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DO3A),1,7,-二(膦酰甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DO2P),1,4,7-三(膦酰甲基)-1,4,7,10-四氮杂环癸烷(DO3P),1-(羧甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷(T1A),1,4-二(羧甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷(T2A)和1,4-二(膦酰甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷(T2P)。正如在图1中所示出的,仲胺基团能够结合激活的凝胶(聚合物基材),生成IMAC支持物(官能化的聚合物基材)。相应的Ca2+-复合物的稳定常数,由Burai et al5对DO2P报导的(log KCa(II)L=12.8)和由Chang5a对DO3A报导的(log KCa(II)L=10.72),是较高的,并且这种配体是适用于所述类型的IMAC系统的,因为它们能使蛋白纯化期间的金属离子“泄露”最小,并且使金属离子从配体向蛋白的转移最少。另外,由于业已报导了钙的最大配位数为10,这些配位位点可用于蛋白结合。
通过文献中的方法2-4制备了三种大环DO2P,DO3A和DO3P(参见图2),并且通过NMR和质谱分析(MS)进行表征。DO3A和DO3P的制备是以高产率完成的,并且按比例放大该反应,成功地获得更大的数量(例如克级数量或以上)。所获得的NMR和MS数据,以及所获得的产率与以前所报导的数据2-4非常类似。
图2:具有羧甲基(在DO3A中)或膦酰甲基(在DO2P和DO3P中)官能团的三种cyclen-衍生的配体的结构
DO2P的合成需要进行某些优化,以便提高产量和效率。不能够实现放大到多克的数量。所获得的产率和NMR数据与文献中所披露的数据5,6非常类似。获得了DO2P配体的合适的晶体用于X-射线分析,但大环的严重无序妨碍了对晶体结构的满意精细化。不过证实了存在两个膦酰甲基臂躺在由大环限定的平面同一侧。业已获得了游离的配体DO3P的晶体,并且通过x-射线结晶学验证了它的结构。在下面的图3a和3b中分别示出了配体DO3P的ORTEP图和空间结构模型:
图3a:DO3P的ORTEP图图3b:DO3P的空间结构模型
在上述类型的三氮杂-和四氮杂环烷中,cyclen是可以通过商业渠道获得的,而tacn和cyclam是合成的。对于tacn来说,通过由Richman-Atkins7完善的方法进行多个步骤的合成,该方法基于选择性保护的多胺和二醇的环化。合成可以高产率和高纯度实现。下一个步骤涉及含有羧甲基或膦酰甲基侧臂的衍生化大环的合成(对于tacn来说,它的例子如下面的图4所示):
图4:具有一个羧甲基(Tacn1A),两个羧甲基(Tacn2A)或两个膦酰甲基(Tacn2P)官能团的tacn大环的结构
预计这些tacn-衍生的配体适合与IMAC系统中的Fe3+复合,因为Fe3+的最大配位数为六。将未衍生化的仲胺(-NH-)用于固定化到层析支持基质(聚合物基材)上,并且由于所述配体占据Fe3+配位层内的最多五个位点(对于固定化Tacn2A和Tacn2P而言),还存在至少一个配位位点可用于蛋白结合。
相应的四氮杂配体cyclam是通过基于Parker8披露的制备cyclen的方法合成的。用于cyclam合成的第一种前体(N,N’,N”,N-四甲苯磺酰基-1,5,8,12-四氮杂十二烷)是使用两种不同方法合成的7,8。这两种方法均产生具有相同的NMR谱和熔点的产物。还通过质谱分析证实了其结构。分别含有两个或三个羧甲基或两个或三个膦酰甲基臂的cyclam衍生的大环(图5),能够以与对tacn和cyclen分子所述类似的方式合成,并且以上述具有羧甲基和膦酰甲基悬垂臂的tacn和cyclen系统的12-员环类似物的形式起作用。
图5:具有羧甲基或膦酰甲基悬垂臂的四种cyclam-衍生的配体的结构
由于与tacn环相比环的大小增加了,所述衍生化的cyclam配体还可用于较大金属离子如钙或镁的复合。
将配体固定化(共价结合)到聚合物基材(基质)上,并且将金属离子固定化到配体上:本发明的IMAC使用固定化金属复合物,它是通过将金属离子结合(复合)到连接在层析基质或支持物上的螯合配体上产生的,以便捕获含有特定金属-结合位点的蛋白。所述蛋白的吸附是基于固定化金属离子和来自蛋白表面的电子-供体基团之间的配位相互作用。在制备本发明的IMAC吸附剂时,固定化金属复合物的生成通常涉及若干步骤。在典型的方法中,首先将螯合配体结合在层析基质(聚合物基材)上,所述基质事先业已使用双功能试剂激活,例如,表氯醇或1,4-丁二醇二缩水甘油基醚(双环氧乙烷)。第二个步骤涉及金属离子与固定化螯合配体复合,通常是通过用所述金属离子的盐(例如氯化物或硝酸盐)的水溶液处理完成。所得到的金属螯合物复合物能够与溶解在液体流动相中的蛋白分子相互作用,以便位于蛋白表面的氨基酸残基的电子-供体基团(例如,组氨酸残基的咪唑基)置换配位较弱的溶剂配体(例如,H2O),并且与固定化金属离子形成配位键。最后,通过降低流动相的pH完成结合蛋白的洗脱,或者通过使用竞争配体,该配体能将蛋白从金属离子上的配位位点置换下来。
通过选择金属离子、螯合配体和/或溶剂条件,或通过修饰靶蛋白,可以影响IMAC分离的选择性。
下面结合配体DO3A和DO3P(参见上文)并且结合商业销售琼脂糖衍生物形式的聚合物基材SepharoseTM 6FF,对固定方法进行说明,所述基材非常适合作为本发明的基材。每一种讨论的配体被设计成包含游离的胺基,用于与固体支持基质结合。业已检验了所得到的固定化(im)配体(im-DO3P,im-DO3A)结合钙离子的能力。
将配体固定到SepharoseTM 6FF上
可以使用以前披露的标准环氧基-激活方法将大环固定在SepharoseTM上。第一个步骤涉及用表氯醇在碱性条件下处理SepharoseTM凝胶(聚合物基材),以便产生环氧基-激活的凝胶。然后通过配体环中的亲核的仲胺基团与环氧基-激活的凝胶的亲电子的环氧化物表面基团起反应实现所述配体的结合。参见图6(下文),所述与环氧基团的反应导入了间隔基团,它使得固定化配体具有更高的构象自由度,以便与蛋白相互作用。由于所述配体是该系统中唯一含有N的成分,通过对氮进行分析可以计算所述基质上固定化配体的数量。参见下面的表1,使用固定化cyclen本身获得了最大的表面覆盖度(配体密度)。在为此而进行的实验中,DO3A配体以合理的水平固定(最佳量为大约300μmol/g干凝胶),而DO3P配体没有同样好地固定化。这可能是由于环氧基-激活的凝胶在DO3P的配体固定化之前储存了较长的时间。或者,低的配体覆盖度可能是由于配体的较大的空间位阻阻止了所有可用于相互作用的环氧基团的进入。另外,DO3P配体的膦酰基团与DO3A配体的羧基基团相比在用于固定化的pH条件下(pH12)带有更高的负电荷,并且静电排斥作用可能因此抑制固定化覆盖。
图6:配体固定化的示意图
表1:固定化配体的氮含量和计算的配体密度
金属离子的固定化
金属离子的固定化是通过将所述凝胶与相应的金属离子氯化物的溶液在室温下温育一小时的时间完成的。为了确保im-配体的悬垂臂的酸基团的完全脱质子作用,将金属离子溶液的pH提高到10(Fe3+除外,以便避免形成hydroxo或oxo种类)。通过原子吸附光谱学(AAS)测定确定结合的金属离子量,并且归纳在下面的表2中。为了说明所采用的方法,Ca2+离子的固定化是通过将凝胶(im-DO3A,im-DO3P)与CaCl2溶液(pH10)在室温下温育一小时完成的。
表2:与各种配体衍生物的Mn+结合
以上结果表明,在大多数场合下,金属与配体结合的化学计量为1∶1。对于DO3P来说,发现由凝胶吸收的Zn2+和Fe3+大约为2∶1,而对于T1A(即Tacn1A)和T2A(即Tacn2A)来说,发现Ca2+与配体的化学计量为大约1∶2。
设计用于结合固定化硬金属离子(或边界硬度的金属离子)的肽标记序列:应当指出的是,在本说明书中所使用的与金属离子相关的术语“硬的”,“硬度”和“软的”的含义是依据R.G.Pearson(例如,参见S.F.A.Kettle,Coordination Chemistry,Thomas Nelsonand Sons Ltd.,1969,pp.48-49)。在所述等级的一端,“硬的”金属离子是相对于它们与配体的结合平行于质子的金属离子,这些离子是小的,通常带有高的电荷,并且缺少价壳层电子,这些电子是容易变形或去掉的;硬金属离子包括,例如,Ca2+,Mg2+,Mn2+,Cr3+,La3+和Fe3+。在该等级的另一端,“软的”金属离子是大的,具有低的电荷或具有价壳层电子,这些电子是容易变形的或去掉的;软的金属离子包括,例如,Cu+,Ag+和Cd2+。其特性将它们置于硬的和软的之间的边界(即“边界硬度”)的金属离子包括,例如,ZnU,Fe2+,Co2+,Ni2+和Cu2+。
硬金属离子对硬的Lewis碱具有最强的亲和力。因此,蛋白中含有羧酸基团的氨基酸残基(Asp,Glu)可以牢固地结合在硬金属离子如Ca2+上。为了获得重组蛋白与硬金属离子之间的特定的相互作用,需要特殊的融合标记。这些硬金属离子结合标记理想地是短肽标记,可以使用重组遗传学技术将它导入所述蛋白。例如,为了设计特定的Ca2+-结合标记,分析了天然存在的Ca2+-结合蛋白中参与Ca2+结合的氨基酸序列。这些序列能以高的亲和力结合Ca2+,因此,具有提供标记设计的基础的潜力。所述蛋白的例子有钙结合蛋白-钙调蛋白(CaM),肌钙蛋白C(TnC),和小清蛋白(Parv)。所有这些蛋白都能以高亲和力结合Ca2+13:
CaM: 四个结合位点 log Ks=6
TnC: 四个结合位点 log Ks=7
Parv: 二个结合位点 log Ks=9
图7:基于X射线衍射和NMR研究的Ca2+/钙调蛋白的结构14。
图7显示具有四个钙-结合位点的钙调蛋白的结构。一般认可的是,四个结合位点中的两个对Ca2+具有较低的亲和力,而另外两个结合位点对Ca2+具有略高一些的亲和力。
所述结构研究表明,所述分子具有“哑铃”形状,两个球形末端通过长的暴露的α-螺旋连接。每一个末端具有两个Ca2+-结合位点,各自具有12个氨基酸残基的环,其中,诸如天冬氨酸和谷氨酸残基的残基(在下面的表3中用粗体字表示)与钙形成了静电/配位键。所述分子的羧基末端(结构域III,IV)中的两个Ca2+-结合位点对钙的亲和力比氨基末端部分(结构域I,II)高十倍。在表3中示出了四个钙-结合结构域和它们的序列:
表3:钙调蛋白的钙-结合位点的序列和位置
根据以上序列(表3),设计了八种肽序列(图8),它们有可能以不同的亲和力结合Ca2+。在1-3号肽中,有5个氨基酸残基位点参与Ca2+结合(在图8中用粗体表示)。鉴于所述标记对Ca2+的亲和力必须比Ca2+对配体的亲和力低(以便防止Ca2+从im-配体上流失),还设计了较短的标记(标记4-标记6),以便降低Ca2+对所述标记的结合亲和力。
标记1: MDADGNGTIDFAEF (SEQ.ID No.1)
标记2: MDIDGDGHINYEEF (SEQ.ID No.2)
标记3: MDVDGSGTIGSSEL (SEQ.ID No.3)
标记4: MDVDRSGTIGSSEL (SEQ.ID No.4)
标记5: MDADGN (SEQ.ID No.5)
标记6: MDIDGD (SEQ.ID No.6)
标记7: MDVDGS (SEQ.ID No.7)
标记8: MDVDRS (SEQ.ID No.8)
图8:钙结合标记的氨基酸序列。
除了上述“标记”序列之外,本发明还涉及所述序列的变体,其中,一个或多个氨基酸残基(例如,单个氨基酸残基)被不同的氨基酸残基置换(即代替),特别是被具有与被置换的氨基酸残基类似的化学官能度的氨基酸残基所置换。在本文中,术语“类似的化学官能度”用于表示被置换的氨基酸残基和置换它的氨基酸残基在极性,可极化性,酸性和碱性取代基的数量和/或结构类似性或同源性方面密切相关。因此,对于在图8中所示出的(上文)标记序列中的非-突出的氨基酸残基(即,没有用粗体字表示的残基)来说,例如,适合进行以下置换:
用Gly(G)残基(同样是非极性的)置换Ala(A)残基(非极性残基),或相反;
用Tyr(Y)残基(由于苯环上的4-羟基基团而与Phe不同)置换Phe(F)残基(包含苯环),或相反;
用其他两个残基中的一个、或另一个“不可极化的”残基如Pro(P)或Met(M)置换“不可极化的”Val(V),Leu(L)或Ile(I)残基。
对于在图8中所示出的标记序列中的突出的残基(用粗体字表示)(见上文)来说,合适的是例如进行以下置换:
用Glu(E)残基(同样“酸性”)置换Asp(D)残基(“酸性”残基),或相反;
用Gln(Q)残基置换Asn(N)残基。
包括图8中所示出的一个或多个氨基酸序列,和/或所述序列的一种或多种置换变体的寡肽同样构成了本发明的一个方面。在所述寡肽中,所述的“标记”序列(或它的置换变体)可以相同或不同。
应当理解的是,肽(寡肽)“标记”除了一种上述氨基酸序列,或上述它的置换变体之外,还可以包括一个或多个另外的氨基酸残基,如2-6或更多个另外的氨基酸残基,结合在图8所示出的寡肽″标记″的C-或N-末端(例如结合在八种序列(标记1-标记8)之一的C-或N-末端)。
采用众所周知的分子生物学方法和技术,优选基于聚合酶链式反应(PCR)的方法,将本发明的寡肽“标记”导入感兴趣的蛋白,可以在氨基末端,羧基末端或内部(内-)位置完成。其结果是,位于C-末端的寡肽“标记”的实施,仍然使得所披露的IMAC方法可用于本发明的大环螯合配体系统。另外,本发明的寡肽″标记”(例如在图8中所示出的标记之一)可以同时融合到两个感兴趣的蛋白或多肽分子上,或者融合到两种不同的感兴趣的蛋白或多肽上,分别融合在它们的氨基末端或羧基末端,从而形成新的融合蛋白结构,其中,所述寡肽“标记”位于连接两个感兴趣的蛋白或多肽分子的内位(即内部位置)。
包含标记序列的肽的合成:
为了检验上述标记序列用于本发明的IMAC系统中的合适性,通过Fmoc-型固相肽合成方法分别合成了具有标记1-标记8的序列的肽,该方法基于L-氨基酸的顺序添加,所述氨基酸是受到侧链保护和N-末端Fmoc-保护的(Fmoc=9-芴基甲氧基羰基),将所述氨基酸添加到不溶性的聚合物支持物上。在去掉N-末端保护基团之后,随着添加偶联剂(HOBt,HBTU,DIPEA)添加下一个Fmoc-保护的氨基酸。重复所述脱保护和偶联步骤,直到获得最终的粗制肽。可以将标准的TFA裂解方法用于将产物从树脂上裂解下来,并且从所述粗制肽上去掉侧链保护基团。通过制备型反相高压液相层析(RP-HPLC)纯化所述粗制肽,例如,使用浓度逐渐增加的乙腈进行梯度洗脱。
本发明的其他方面包括以下:
融合蛋白形式的多肽,包括在其氨基末端或羧基末端与至少一种寡肽融合的感兴趣的蛋白,所述寡肽在上文结合SEQ ID NO.1-8所述的那些之中,或在上文结合这类寡肽的置换变体所述的那些之中;正如业已讨论过的(参见上文),所述类型的融合蛋白包括这样的融合蛋白,其中,两个感兴趣的蛋白或多肽分子,或两种不同的感兴趣的蛋白或多肽,分别在其氨基或羧基末端同时与一个相同的寡肽(即,寡肽“标记”)结合,适当地是本发明的寡肽,以便形成这样的融合蛋白结构,其中,寡肽(即,“标记”)位于连接两个感兴趣的蛋白或多肽分子的内在位置(即内部位置)。在这种类型的融合蛋白结构中,寡肽“标记”的氨基酸序列的侧翼适当地是一个或多个酶促或化学裂解位点;
编码所述多肽的多核苷酸构建体,如载体;
可以通过以下方法获得的多肽:在允许所述多肽表达的条件下,在合适的生长培养基中培养包括所述多核苷酸构建体的宿主细胞(例如原核细胞,如大肠杆菌),以及从所述培养基中回收所述多肽;
含有所述多核苷酸构建体的宿主细胞,例如,原核细胞(例如大肠杆菌菌株);和
用于生产所述类型的多肽的方法,该方法包括在允许所述多肽表达的条件下在合适的生长培养基中培养所述类型的宿主细胞,以及从所述培养基中回收所述多肽;
本发明的另一方面涉及用于纯化感兴趣的蛋白的方法,该方法包括以下步骤:
让蛋白样品与含有金属离子的本发明的官能化的聚合物基材在所述多肽(融合蛋白)能结合含有金属离子的官能化的聚合物基材的条件下接触,以便与它形成复合物,该蛋白样品包括:融合蛋白形式的多肽,它包括在其氨基末端或羧基末端与本发明的至少一种寡肽(即,寡肽“标记”)融合的感兴趣的蛋白(即,上面已经提到过的类型之一的融合蛋白,包括这样的融合蛋白,其中,所述寡肽(即,“标记”)位于内位,如业已讨论过的);和其他(无关)蛋白;
用缓冲溶液洗涤所述复合物,以便除掉其他(无关)蛋白;和
将结合的多肽从洗涤过的复合物上洗脱下来。
上述方法还可以包括将寡肽(所述“标记”)从感兴趣的多肽或蛋白上裂解下来的步骤,例如,通过化学方法或通过酶方法,例如,内肽酶或外肽酶。
本发明还涉及通过上述方法获得或可通过其获得的纯化的蛋白。
具有亲和标记的靶蛋白的表达:可以将重组DNA技术用于将融合标记导入蛋白用于随后的纯化方法。亲和标记是短的DNA片段,它编码的氨基酸序列对金属离子具有强的结合亲和力。这些标记(c-DNA)连接(结合)在目标重组蛋白的c-DNA(N-或C-末端)。所得到的标记过的融合蛋白能够表达(生产),并且随后利用IMAC系统从粗制细胞提取物中纯化,因为所结合的标记选择性地或特异性地结合在固定化金属离子上。融合蛋白的洗脱可以通过采用连续降低的pH梯度实现。或者,可以将螯合剂,如EDTA添加到流动相中,以便洗脱所述蛋白。如果需要的话,可以使用化学或酶促方法将亲和标记从靶蛋白上去掉(后纯化)。
与在本发明中披露的纯化方法相关的多肽或蛋白(感兴趣的多肽或蛋白)包括以下:哺乳动物蛋白,例如,生长激素,包括人生长激素和牛生长激素;生长激素释放因子;甲状旁腺激素;促甲状腺激素;脂蛋白;α-1-抗胰蛋白酶;胰岛素A-链;胰岛素B-链;胰岛素原;促卵泡激素;降钙素;促黄体生成激素;胰高血糖素;凝血因子,如因子VII(包括因子VIIa),因子VIII,因子IX,组织因子,和vonWillebrands因子;抗-凝血因子,如蛋白C;心房钠利尿因子;肺表面活性物质;纤维蛋白溶酶原活化因子,如尿激酶或组织类型纤维蛋白溶酶原活化因子(t-PA);bombazine;凝血酶;肿瘤坏死因子-α和-β;脑啡肽;RANTES(受激活作用调节的正常情况下T-细胞表达和分泌的);人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α);血清白蛋白,如人血清白蛋白;副中肾管-抑制物质;松弛素A-链;松弛素B-链;松弛素原;小鼠促性腺激素相关肽;DNA酶;活化素(例如,活化素A,活化素B,活化素C,活化素D或活化素E);抑制素(例如,抑制素A或抑制素B);血管内皮生长因子(VEGF);激素或生长因子的受体;整联蛋白;蛋白A或D;类风湿因子;神经营养因子,如骨衍生的神经营养因子(BDNF),神经营养素-3,-4,-5,或-6(NT-3,NT-4,NT-5或NT-6),或神经生长因子如NGF-β;血小板衍生的生长因子(PDGF);成纤维细胞生长因子,如aFGF和bFGF;表皮生长因子(EGF);转化生长因子(TGF),如TGF-α和TGF-β,包括TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,TGF-β4和/或TGF-β5;胰岛素-样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II);脱(1-3)-IGF-I(大脑I GF-I);胰岛素-样生长因子结合蛋白;CD蛋白,如CD3,CD4,CD8,CD19或CD20;红细胞生成素(EPO);血小板生成素(TPO);骨诱导因子;免疫毒素;骨形态发生蛋白1-7(BMP 1-7);干扰素,如干扰素-α,-β或-γ;集落刺激因子(CSF),例如,M-CSF,GM-CSF或G-CSF;白介素(IL),例如,IL-1到IL-12;超氧化物歧化酶;T-细胞受体;表面膜蛋白;衰变加速因子(DAF);病毒抗原,例如,AIDS被膜的一部分;转运蛋白;归巢受体;地址素;调控蛋白;免疫粘合素;抗体;和上面所列举的任意多肽或蛋白的生物学活性片段或变体。
本文所使用的术语″多核苷酸″表示脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物,从5′向3′末端阅读。多核苷酸包括RNA和DNA,并且可以从天然来源中分离,在体外合成,或者从天然和合成分子的组合制备。多核苷酸分子的长度是以核苷酸(简称为″nt″)或碱基对(简称为″bp″)的形式给出的。术语″核苷酸″用于表示单链和双链分子,根据使用场合而定。当所述术语用于双链分子时,它被用于表示总体长度,并且被理解成等同于术语″碱基对″。本领域技术人员可以理解的是,双链多核苷酸的两条链的长度可以略微不同,并且其末端可能因为酶促裂解作用而错开;因此,双链多核苷酸分子中的核苷酸可能不是所有都配对的。这种没有配对的末端的长度一般不超过20nt。
本文所使用的术语“宿主细胞”表示任何细胞,包括杂交细胞,其中,可以表达异源DNA。典型的宿主细胞包括但不局限于细菌细胞,昆虫细胞,酵母细胞和哺乳动物细胞,包括人类细胞,如BHK,CHO,HEK,和COS细胞。
本文所使用的术语“载体”表示能够在宿主细胞中扩增的任何核酸实体。因此,所述载体可以是自主复制的载体,即以染色体外的实体形式存在的载体,它的复制与染色体复制无关,例如,质粒。另外,所述载体可以是这样的载体,在导入宿主细胞时,它整合到宿主细胞基因组中,并且与整合了它的染色体一起复制。载体的选择通常取决于要导入该载体的宿主细胞。载体包括但不局限于质粒载体,噬菌体载体,病毒或粘粒载体。载体通常包括复制起点,和至少一个选择基因,即编码可容易检测或其存在是细胞生长所必需的产物的基因。
在本说明书中,氨基酸残基是使用得到IUPAC-IUB(Commissionon Biochemical Nomenclature(CBN)认可的缩写表示的。对于氨基酸来说,通过以下缩写词表示的氨基酸是天然存在的L-形式的。另外,肽的氨基酸序列的左侧和右侧末端分别是N-和C-末端,除非另有说明。
氨基酸残基缩写词
在本说明书和权利要求书中所使用的酶分类符合Recommendations(1992)of the Nomenclature Committee of theInternational Union of Biochemistry and Molecular Biology,该文献的升级版本(包括增补)可以从世界范围网获得http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/。
实验部分
缩写词
APS 过硫酸铵
BES N,N-双-(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸
CAPS 3-(环己基氨基)-1-丙磺酸
CHES 2-(环己基氨基)-乙磺酸
cyclam 1,4,8,12-四氮杂环十五烷
Cyclen 1,4,7,10-四氮杂环十二烷
Da 道尔顿
DIPEA 1,3-二异丙基乙胺
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DO3A 1,4,7-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷
DO2P 1,7,-二(膦酰甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷
DO3P 1,4,7-三(膦酰甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷
EDT 1,2-乙烷二硫醇
GST 谷胱甘肽S-转移酶
HBTU O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基-脲-六氟磷酸盐
HEPES 4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸
HOBt N-(羟基苯并三唑)
IMAC 固定化金属离子亲和层析法
im 固定化的
im-Ca2+ 固定化钙离子
im-Fe3+ 固定化铁离子
im-Mn+ 固定化金属离子
im-Ca2+-DO3A 源于DO3A和Ca2+离子的固定化金属离子复合物
im-Ca2+-DO3P 源于DO3P和Ca2+离子的固定化金属离子复合物
IPTG 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
MES 2-(N-吗啉基)-乙磺酸
MOPS 3-(N-吗啉基)-丙磺酸
PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBS 磷酸盐缓冲盐水
SDS 十二烷基硫酸钠
Tacn1A或T1A 1-(羧甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷
Tacn2A或T2A 1,4-二(羧甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷
Tacn2P或T2P 1,4-二(膦酰甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷
Tacn 1,4,7-三氮杂环壬烷
Tris 三(羟基甲基)-氨基甲烷
TFA 三氟乙酸
金属离子配位配体
1,7-二(膦酰甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DO2P)的合成
DO2P的多个步骤的合成是使用以前报导的方法进行的5,6。
1,7-二(苄氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(I)
将Cyclen(0.5g)溶解在H2O(20ml)中,并且通过添加6M HCl将pH调整到3.0,随后添加二烷(15ml)。将苄基氯甲酸酯(12.8ml)溶解在二烷(10ml)中,并且通过注射器将该溶液添加到所述混合物中,同时通过添加2M NaOH(大约20ml)将pH保持在2-3之间。16小时之后,完成所述添加,并且在减压条件下蒸发溶剂。用二乙醚提取所得到的白色固体残余物,得到了澄清的油状物。
产率:0.7g:1.57mmol,54%
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ(ppm)2.80(br m,NCH2,8H),3.42( br m,NCH2,8H),5.15(s,OCH2,4H),7.34(m,C6H5,10H)。
1,7-二(苄氧基羰基甲基)-4,10-二(二乙氧基膦酰甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(II)
正如由Burai et.al在文献中所披露的5,向I(0.7g)中添加亚磷酸三乙酯(0.63g,20%过量),并且在冰上将该混合物冷却到0℃。经30分钟时间缓慢添加低聚甲醛(0.1g,10%过量),并且将所得到的混合物回温到室温。在室温下搅拌2天时间,然后在40℃下搅拌1天,得到澄清的黄色油状物,然后在高真空条件下,在40-50℃下保持几小时时间,以便除去挥发性杂质。将所得到的澄清的油状物用于下一合成步骤,而不进行进一步的纯化。
产率:0.5g,0.67mmol,43%
31P-NMR(CDCl3/H3PO4):δ(ppm)26.62
1H-NMR(CDCl3):δ(ppm):7.30(m,芳香族质子,10H);5.13(s,苄基质子,4H);4.05(m POCH2CH3,8H);3.4(br,CONCH2CH2NCH2P,8H);2.85(br,CONCH2CH2NCH2P,和NCH2P,12H);1.30(t,POCH2CH3,12H)。
1,7,-二(膦酰甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DO2P)(III)
将粗制油(II)溶解在5M HCl(50ml)中,并且回流24小时。在冷却到室温之后,用二乙醚萃取该混合物,并且在减压条件下蒸发二乙醚。将固体残余物溶解在无水乙醇(25ml)中,并且添加二乙醚(25ml)。马上形成了白色沉淀物,将其滤出和在真空条件下干燥。
产率:0.1g,0.28mmol,42%
熔点:285-290℃
31P-NMR:δ(ppm)22.26
Anal.C10H26N4O6P2·1.65H2O·1HCl计算值:C,28.17;H,7.25;N12.57;测定值:C,28.17;H,7.16;N,13.14
1H-NMR(D2O,pH~2.0):δ(ppm)2.91 3.0,3.3(br,环质子,16H),2.90(d,NCH2P,4H)
结晶学分析:
将DO2P从EtOH/H2O溶液中再结晶出来,然后添加二乙醚。经4℃放置两周形成了用于X-射线结晶学的合适的晶体。在表I中提供了晶体参数:
表I:DO2P的晶体数据
1,4,7-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DO3A)的合成
合成是按照公开的方法以四个步骤进行的3,9(路线图A)。1,4,7,10-四氮杂三环十三烷(1)是按照Atkins et al.等的方法制备的9,并且根据Dischino et al的方法进行步骤2-43。
路线图A:DO3A的合成
1,4,7,10-四氮杂三环十三烷(1)
将Cyclen(5g,29mmol)溶解在甲苯(50ml)中,并且添加二甲基甲酰胺二甲基缩醛(3.45g,29mmol)。在80℃下搅拌该混合物过夜,然后在减压条件下除去甲苯。通过在高真空条件下蒸馏纯化粗制油。
产率:4g,22.03mmol,76%
1H-NMR(CDCl3):δ(ppm)1.66(s,N-H,1H);2.88(s,CH2-CH2,16H);4.44(s,C-H,1H)。
1-甲酰-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(2)
将1,4,7,10-四氮杂三环十三烷(1;4g,22.03mmol)冷却到4℃,并且添加EtOH/H2O溶液(50ml,冷却到-20℃),让所得到的反应混合物缓慢回温到室温,然后在氮气下搅拌12小时。在真空中浓缩所述反应混合物,溶解在乙腈(50ml)中,并且再次浓缩。重复该过程三次,以便除去微量的H2O。在室温下在真空条件下干燥浅黄色油状物过夜,以便形成白色吸湿固体。
产率:3.95g,19.8mmol,90%
1H-NMR(D2O):δ(ppm)2.5-2.8(m,CH2,12H);3.55(m,CH2,4H);8.15(s,CHO,1H)。
1,4,7-三(乙氧基羰基甲基)-10-甲酰-1,4,7,10四氮杂环十二烷(3)
将溶解在DMF(20ml,冷却到4℃)中的3.95g(19.8mmol)2的溶液在氮气下搅拌,并且经30分钟时间添加叔丁基溴乙酸酯(15.43g,79.1mmol)。将反应混合物的温度维持在30℃下再35分钟。然后将溶解在水(80ml)中的无水碳酸钠(8.4g,80mmol)添加到上述反应混合物中,搅拌该混合物30分钟。在添加甲苯(20ml)之后,再搅拌该混合物4小时。然后将该混合物转移到分液漏斗中,并且分离各层。甲苯层用1M Na2CO3(50ml)萃取三次,然后用0.8M HCl(1×25ml),最后用H2O(25ml)萃取。合并含水层,并且用Na2CO3将pH调整到9.4。然后用二氯甲烷(DCM;50ml)萃取两次上述合并的层,并且合并DCM层,在Na2CO3上面干燥。有机层在真空条件下干燥,以便产生粘稠的浅黄色油状产物3。
产率:9.32g,17.2mmol,87%
1H-NMR(CDCl3):δ(ppm)1.45(s,CH3,27H);2.68-3.0(m,CH2,12H);3.2-3.6(m,CH2,10H);8.05(s,CHO,1H)。
1,4,7-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷DO3A(4)
向2g(3.7mmol)的产物3中添加5M HCl(100ml),并且在氮气条件下将该溶液加热至回流6小时。在旋转式蒸发器上浓缩所述反应混合物,添加水(50ml),然后在真空条件下再次浓缩该混合物。重复这一过程三次,以便除去微量HCl。然后将所得到的澄清的油状物溶解在H2O(50ml)中,在高真空条件下除去溶剂(冷冻干燥),以便得到浅黄色产物。
产率:1.27g,3.58mmol,97%
13C-NMR(D2O):δ(ppm)41.3,46.7,48.3,51.1,52.1,53.58,167.6,173.4
1H-NMR(D2O):δ(ppm)2.9-3.3(br,环质子,16H),3.6(s,CH2COOH,6H)
质谱[(ESI)m/z]:DO3A计算值:346;测定值:347(M+H+),345(M-H-)。
1,4,7-三(膦酰甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DO3P)的合成
DO3P是通过文献中披露的方法4,9,10如下制备的(路线图B):
路线图B:DO3P的合成
1,4,7,10-四氮杂三环十三烷(1)和1-甲酰-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(2)是按照上面对合成DO3A所述的方法合成的。
1,4,7-三(膦酰甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DO3P)(6)
将1-甲酰-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(2g,10mmol)和亚磷酸三乙酯(6g,36.1mmol,20%过量)放入圆底烧瓶,并且将所述烧瓶浸泡在冰浴中。经30分钟时间以小批量添加低聚甲醛(1g,33mmol,10%过量)。然后将该混合物回温到室温,并且在室温下搅拌2天时间,然后在40-50℃下搅拌1天时间。将透明的混合物在高真空条件下在50℃下保持若干小时,以便除去挥发性杂质。水解所得到的粗制膦酸酯(5),而不进行进一步纯化。将它溶解在5M HCl(200ml)中,并且回流该混合物两天时间。通过旋转蒸发除去盐酸,以便得到澄清的油状物。将它溶解在水中(100ml),并且在减压条件下除去溶剂。再重复该过程两次。最后将所述油状物溶解在水中(925ml),并且添加乙醇(10ml)。所述产物以白色固体形式沉淀,将其滤出,用水洗涤(3×20ml),并且风干。将粗制产物从热水中再结晶出来,以便得到精细的白色结晶固体产物6,在真空中将它干燥到恒定质量。
产率:4g,8.6mmol,86%
1H-NMR(D2O,NH3,pH10):δ(ppm)2.8(d,CH2PO(OH)2,4H,),3.15(br,环质子,14H),3.4(br s,CH2NHCH2,4H)
质谱[(ESI)m/z]:DO3P计算值:454;测定值:455(M+H+)。
1,4,8,12-四氮杂环十五烷(cyclam)的合成
N,N’,N”,N-四甲苯磺酰基-1,5,8,12-四氮杂环十二烷
方法A:
将1,5,8,12-四氮杂环十二烷(10g,57.4mmol)溶解在蒸馏水(70ml)中,并且在搅拌条件下缓慢添加氢氧化钠(9.2g,229.5mmol),确保温度不超过40℃。然后将该混合物冷却到15℃,并且用二乙醚(70ml)稀释。然后以小批量形式添加甲苯磺酰氯(43.75g,229.5mmol),以便确保温度保持在15℃。在冰上再搅拌该溶液1小时时间,然后在室温下放置过夜。将所得到的白色沉淀物滤出,用水洗涤,并且在80℃下干燥两小时。然后在热甲醇中搅拌所述粗制产物一小时,滤出并且在真空下干燥。
产率:35.4g,44.8mmol,78%
1H-NMR(d6丙酮):δ(ppm)7.73(8H,苄基质子),7.4(8H,苄基质子),3.18(8H,CH2),2.95(4H,CH2)2.42(12H),1.78(4H)
熔点:125-128℃.19,20
方法B:
将1,5,8,12四氮杂环十二烷(5g,28.7mmol)和K2CO3(8g)溶解在水(100ml)中,并且加热到80℃。以小批量形式经3小时时间添加甲苯磺酰氯(24.6g,129.15mmol)。加热并且搅拌反应混合物过夜。将所得到的澄清溶液冷却到室温,沉淀物形成。将所得到的白色固体滤出,并且分别用水,甲醇和二乙醚洗涤三次,然后在真空下干燥,以便得到白色粉末。
产率:17g,21.5mmol,75%
1H-NMR(d6丙酮):δ(ppm)7.73(8H,苄基质子),7.4(8H,苄基质子),3.18(8H,CH2),2.95(4H,CH2)2.42(12H),1.78(4H)
熔点:125-128℃.19,20
质谱[(ESI)m/z]:C36H46N4O8S4计算值:790;测定值:791(M+H+)。
将配体固定在SepharoseTM 6FF上
制备环氧基-激活的Sepharose 6FF
用水充分洗涤SepharoseTM 6FF(500g),吸干,并且放入圆底烧瓶中。添加含有NaBH4(1.88mg/ml)的2M NaOH(500ml),并且在室温下搅拌该悬浮液2小时。然后添加表氯醇(300ml),并且搅拌该悬浮液5天时间。通过真空过滤收集所得到的环氧基-激活的凝胶,用水充分洗涤(5×500ml),并且在4℃下在20%乙醇中保存,直到用于配体固定化。
DO3A的固定
制备DO3A的0.2M溶液(20ml),然后用2M NaOH调整到pH12。将该DO3A溶液添加到吸干的环氧基-激活的SepharoseTM 6FF(20g)中,并且在室温下振荡该反应混合物4天。将所得到的固定化DO3A凝胶(im-DO3A)滤出,用水充分洗涤(5×50ml),并且在4℃下在20%乙醇中保存。
DO3P的固定
由于DO3P不溶解于水,制备了DO3P在水中的悬浮液(10ml),并且用2M NaOH将pH调整到12。通过这样提高pH,发现DO3P可以溶解。将所得到的溶液稀释到最终体积为20ml,并且添加吸干的环氧基-激活的SepharoseTM(20g)。该悬浮液在室温下温育4天时间。在此之后,通过真空过滤收集固定化DO3P凝胶(im-DO3P),并且用5×50ml的水洗涤。所述凝胶在4℃下在20%乙醇中保存。
官能化Sepharose吸附剂的氮分析
分析固定化配体凝胶(im-DO3A,im-DO3P)的氮含量,以便确定配体固定化程度。对每一种凝胶来说,通过过滤收集大约10g(湿重)的凝胶,并且在真空条件下冷冻干燥至恒重。对干燥的吸附剂进行精确称重,并且通过Dairy Technical Services Ltd.,Melbourne,Australia分析氮含量。
将钙和其他金属离子固定在固定化的螯合配体上
向吸干的固定化配体凝胶(10g湿重)中添加0.1M CaCl2(或0.1M其他金属氯化物)溶液,然后用2M NaOH将pH调整到10,并且将总体积增加到50ml。所得到的混合物在室温下振荡温育1小时。然后通过过滤收集凝胶,并且用水洗涤(5×50ml)。在真空条件下冷冻干燥大约1g(湿重)的凝胶,精确称重,并且在5M HCl(20ml)中在50℃下消化2小时。用水将该溶液精确稀释到50ml,并且通过原子吸收光谱学(AAS)测定Ca2+(或其他金属离子)含量,使用VarianAA-1475原子吸收分光计,以金属-特异性波长和工作范围测定(例如对于Ca2+离子来说,波长为422.7nm,工作范围为1-4ppm)。
相应于标记序列的肽的合成
固相肽合成
使用PS3 Protein Technologies Automated PeptideSynthesiser(Rainin Instrument Co.,Woburn,MA,USA)合成了具有图7所示序列的八种肽(参见上文)。将树脂(0.2mmol)(与第一个氨基酸预先偶联)装载到专门设计的反应容器中,与DMF(10ml)混合,并且让它在室温下膨胀1小时。称取两倍过量的Fmoc-保护的L-氨基酸(0.4mmol),HOBt和HBTU,放入肽合成仪的独立的圆盘传送带小瓶中。对每一种肽来说,每一氨基酸(AA)的合成循环如下:
I脱保护(20%哌啶,在8ml DMF中):2×5分钟
II洗涤树脂(10ml DMF):6×30秒
III溶解AA/活化剂(activant)(7%v/v DIPEA,在8ml DMF中):1×30秒
IV AA偶联(HOBt,HBTU,DIPEA):1×60分钟
V洗涤树脂(10ml DMF):6×30秒
VI返回到I,并且与下一个氨基酸偶联
在合成结束之后,将树脂/肽产物转移到装有DMF的塑料烧结物中,并且用甲醇(2×10ml)和二乙醚(10ml)洗涤。粗制树脂/肽产物在干燥器中干燥过夜。
从树脂上裂解肽
将干燥的树脂/肽产物转移到50ml圆底烧瓶中,并且在冰浴中冷却。将预先准备好的冷却的裂解试剂混合物(苯酚/TFA/EDT/茴香硫醚/水-参见下文)添加到所述树脂/肽产物中,并且在室温下搅拌该混合物两小时。然后过滤该混合物,用TFA洗涤滤膜,并且在真空条件下浓缩合并滤液+洗液。然后添加冷的二乙醚,并且剧烈摇晃混合物。将沉淀的肽滤出,重新溶解在50%乙腈/水中,并且冷冻干燥过夜,以便得到绒毛状白色粗制产物。
裂解混合物: 0.375g苯酚
0.25ml去离子水
0.125ml EDT
0.25ml茴香硫醚
5.00ml TFA
结果归纳在下面的表II中:
表II:来自树脂的粗制肽的产率
粗制肽的纯化
在Waters Associates(Milford,MA,USA)液相色谱系统上进行制备和分析反相HPLC(RP-HPLC),该系统包括两个Model 600溶剂输送泵,Rheodyne注射器,WISP Model 712自动取样器和自动梯度控制器。检测是使用Model 486可变波长UV-检测仪进行的,该检测仪与Waters Millennium软件计算机连接。通过制备RP-HPLC纯化所述肽,使用不同洗脱梯度(参见下面的表III)的缓冲液A(0.1%TFA)至缓冲液B[90%(v/v)乙腈/水,0.1%TFA],历经1小时时间,流速为6ml/分钟,并且在230nm的波长下检测,使用购自TOSOH(Tokyo,Japan)的TSK-ODS-120T C-18(300×21.55mm)柱。用购自Pharmacia BiotechAB(Uppsala,Sweden)的Pharmacia(Frac-100)级份收集器收集来自RP-HPLC制备运行循环的级份,并且冷冻干燥过夜。通过分析RP-HPLC测定收集级份的纯度,使用购自TOSOH(Tokyo,Japan)的TSK-ODS-120TC-18(150×4.6mm)柱,洗脱梯度为缓冲剂B(0-85%),历经25分钟时间,流速为1ml/分钟,并且在214nm波长检测。
表III:每种肽的纯化结果(制备RP-HPLC)
通过分析RP-HPLC进一步分析所得到的纯化肽,使用更长的乙腈梯度,并且通过质谱分析证实分子量。参见表IV,肽1,2,3G,4,5和6G都具有符合计算质量的质谱。发现肽3R和6R包含缺失的产物,肽6R缺少了甲硫氨酸,而肽3R缺少了精氨酸。为了从完整长度的肽中分离所述缺失的产物,需要对洗脱梯度进行优化,以便明显增加梯度的长度。
电喷射电离质谱分析
通过电喷射电离质谱分析(ESI-MS)测定所述肽的分子量(MW),使用Micromass platform(II)四极MS,以及电喷射源和Masslynx NTversion 3.2软件(Micromass,Cheshire,UK)。将肽溶解在50%(v/v)乙腈/水和3%(v/v)甲酸的1∶1混合物中。扫描范围为0-2000m/z,通过手工注射器以10μl/分钟的速度注射样品。
表IV:计算和观察到的肽的分子量
带有亲和标记的目标蛋白(谷胱甘肽S-转移酶,GST)的表达
表达
GST-标记融合蛋白的表达是以不同的规模进行的,由此将含有重组GST-标记质粒(标记1-6,未标记过的GST和单独的载体)的大肠杆菌BL 21宿主细胞的单一菌落直接接种到10ml的2xYT培养基(16g/l胰蛋白胨,10g/l酵母抽提物,5g/l NaCl,含有100μg/ml的氨苄青霉素)中。培养物在37℃下剧烈摇晃培养过夜。将上述每一种培养物的10ml的等分样品添加到装有500ml的2xYT培养基的无菌的2-升带挡板的烧瓶中,并且在37℃下摇晃培养,直到在600nm波长下的吸光度(A600)达到0.5-1.0。添力IPTG,使最终浓度为1mM,并且在28℃下再持续培养3小时。将培养物转移到离心机容器中,并且在4℃下以7700xg的速度离心10分钟,使细胞沉淀。弃去上清液,并且将细胞沉淀重新悬浮在含有1xPBS,5mM EDTA和1mM PMSF的溶菌缓冲液中。将该溶液调整到总体积为30ml,并且添加鸡蛋请溶菌酶溶液(50mg/ml,占总体积的1/100)。在冰上温育所述溶液10分钟之后,添力MgCl2(2M,占总体积的1/1000)和DNAse-I(10mg/ml,占体积的/1000)的溶液,并且在冰上再温育该溶液20分钟。最后,在冰上通过三个30秒短时间的超声波处理破坏悬浮细胞,在每一次超声波处理之间有30秒的间歇。
通过在4℃下,在SS34转子中以13000xg的速度离心20分钟。将溶菌产物与细胞碎片分开。保留上清液进行纯化。
SDS PAGE分析
将每一种分级分离的样品(SM)和层析洗脱的样品[流通(FT),洗涤(W2)和洗脱(E)]的等份样品(32μl)转移到试管中,并且添加5x样品缓冲液(8μl)(参见下文)。在90℃下加热所述样品90秒,并且使用移液管将25μl的每一种样品导入15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶的相应的孔中。所述SDS-聚丙烯酰胺凝胶是具有4%Stacker的15%丙烯酰胺凝胶(厚度为1mm),并且制备如下:
分离凝胶 Stacker
丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液(30%/0.8%) 10ml 0.88ml
1.5M Tris-Cl pH8.8 5ml -
0.5M Tris-Cl pH6.8 - 1.66ml
10%SDS 0.2ml 66μl
H2O 4.7ml 4.0ml
10%APS 100μl 33.4μl
TEMED 14μl 7μl
样品缓冲液:
5x样品缓冲液组成为:
1.5M Tris-Cl pH8.8 1.5ml
甘油 2.5ml
SDS 0.5g
溴酚蓝 2mg
β巯基乙醇 1.0ml
水 添加到最终体积为5.0ml
SDS-聚丙烯酰胺凝胶在Tank Running缓冲液(0.025M Tris,0.192M甘氨酸,0.1%SDS,pH8.3)中电泳,使用Hoeffer Mini VE垂直电泳系统,每块凝胶的恒定电流为20mA,直到染料前沿到达分离凝胶的底部。
染色
银染:
使用Swain和Ross的银染方法对凝胶进行染色17,如下所示:银染方案(每块凝胶)
步骤 制剂 体积 时间(分钟)
1.固定 40%乙醇 80ml 10
10%乙酸 20ml
水 100ml
2.漂洗 水 200ml 10
3.固定/感光 戊二醛 200μl 5
甲醛 54μl
乙醇 80ml
水 120ml
4.漂洗 40%乙醇 200ml 20
5.漂洗 水 200ml 20
6.感光 硫代硫酸钠 0.05g 1
水 250ml -
7.漂洗 水 200ml 1
8.漂洗 水 200ml 1
9.银 硝酸银 0.2g 20
水 200ml
10.漂洗 水 200ml 1
11.显影 碳酸钠 10g
甲醛 160μl
水 400ml
12.终止 5%乙酸
考马斯蓝染色:
通过考马斯染色对所述凝胶进行染色过夜,这能将整个凝胶染成蓝色。在次日对凝胶进行脱色,从而只有蛋白条带保持蓝色。
染色 快速脱色
考马斯 2.5g 甲醇 300ml
甲醇 450ml 水 600ml
水 450ml 乙酸 100ml
乙酸 100ml
结果
通过重组DNA技术将标记导入蛋白GST。将GST用作模型蛋白,是因为它可以通过商业渠道获得,容易表达,进行过充分表征,并且便于使用谷胱甘肽SepharoseTM 4B从溶胞产物中纯化。标记过的GST蛋白分子的表达是使用宿主细菌细胞(大肠杆菌BL21)完成的。用IPTG诱导这些细胞,以便表达标记过的GST蛋白。从污染性宿主细胞蛋白中成功地纯化的标记过的GST蛋白通过SDS-Page进行分析。参见下面的图9,原材料(SM)和流通材料(FT)含有大量各种大小的污染性宿主蛋白。来自所述纯化的洗脱级份(E)显示,对于每一种标记过的GST,存在符合理论大小的条带(大约26kDa),并且洗脱的蛋白是相对纯的。Tag1-GST,Tag2-GST,Tag4-GST和Tag6-GST在主带下面具有较小的条带,该条带可能对应于通过宿主细胞蛋白酶的作用形成的截短的标记过的GST。
(Tag=标记,untag=未标记)
图9:大规模表达的SDS Page分析
使用所述载体对宿主蛋白对IMAC凝胶的亲和力进行的SDS-PAGE分析证实了少有/没有能够与标记过的GST蛋白共同纯化的低丰度宿主蛋白。纯化的蛋白在单一凝胶上电泳,以便比较表达的大小。正如所预期的,标记1-3(长的标记,参见图9)略大于标记4-6,并且标记2,4和6具有某些较小的污染物/截短产物(图10):
(Tag=标记,untag=未标记)
图10:对标记过的GST蛋白的纯化的SDS Page
通过MALDI-TOF质谱分析进一步表征这些标记过的GST蛋白,表明所有都表达了预期分子量的全长的蛋白(表V)。对标记2-,4-和6-GST观察到的污染物相当于标记从GST蛋白其余部分完全截短。鉴于这些截短的产物占总产物的10%以下,并且也不能够与im-M1+凝胶结合(其中是2+或3+金属离子,例如Ca2+),这样的蛋白样品仍然可用于对Ca2+(或其他金属离子)结合的后续分析。
表V:标记过的GST质谱分析结果
参考文献列表
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机译: 通过硬金属离子亲和色谱法纯化肽
机译: 通过硬金属离子亲和色谱法纯化肽
机译: 通过硬金属离子亲和色谱法纯化肽