深海沉积物总基因组的抽提方法

摘要

深海沉积物总基因组的抽提方法，包括样品的处理和DNA的抽提。用无菌人工海水基本盐溶解离心收集的深海沉积样品，向实验样品中加入高浓度细胞裂解液，在沸水浴中裂解细胞，加入酚/氯仿/异戊醇混合液离心，重复抽提，收集上清液；上清液用无水乙醇沉淀，离心收集沉淀；用乙醇洗涤沉淀物，沉淀物经真空干燥，溶解沉淀，即为基因组DNA提取液。本发明运用微生物学、生物化学、分子生物学、物理学和化学的原理，以解决针对生境特殊的深海微生物的总基因组DNA提取过程中存在的效率低、通用性差、产率低、花费高、样品耗量大等问题，从而提高深海样品中DNA的产率和种类数量，使其分子生态学研究结果更全面，更准确。

说明书

技术领域  本发明涉及深海微生物DNA的提取，具体涉及深海沉积样品基因组的提取，属于海洋生物技术领域。

背景技术  深海微生物基因资源和酶资源产业被称为21世纪可持续发展的蓝色海洋的朝阳产业，因而深海微生物资源研究已成为当今的科研热点。目前，分子生物学技术是认识和开发深海生物圈微生物资源的核心技术，而获得一定质量和浓度的基因组DNA又是开展分子生物学研究的基础。近年来针对陆地或淡水环境中微生物的基因组DNA抽提方法层出不穷，但是针对海洋微生物特别是深海微生物的基因组DNA抽提的方法较为匮乏。目前，科学工作者们常用抽提陆地或淡水环境中微生物的方法来抽提深海微生物的基因组，但深海高压、高温或低温、氧和营养物质匮乏等独特生存环境必定会影响微生物的形态与结构，如形成厚的细胞壁和荚膜等，这些结构变化将影响应用常规方法获取其基因组，阻碍进一步研究。此外，由于深海样品的采集十分不易，因而如何以最少的样品获得最多的微生物资源和基因资源也是海洋生物学者必须解决的问题。

发明内容  本发明的目的是提供一种高效、经济、简单且易于操作的方法，用以从深海沉积样品、深海液体或固体富集物、深海酵母菌或深海细菌的纯培养物等各类样品中提取高质量的深海微生物全基因组DNA。

本发明充分利用适当高温不仅可以裂解所有微生物的细胞壁，而且可以使DNA和蛋白质变性；根据DNA在适当的温度中自身可复性与凝聚的特性，而蛋白质在高温与高盐条件下会加速变性并沉淀，从而较好的使DNA和蛋白质等细胞成分分离开来。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

深海沉积物总基因组的抽提方法，包括：

1)样品的处理：用无菌人工海水基本盐溶解收集的深海沉积样品，混匀后收集上清液，对沉积物重复溶解洗涤，收集上清液；上清液置于离心机中高速离心，收集菌体等颗粒物质；菌体用灭菌磷酸盐缓冲液洗涤、离心除去杂质，收集到的沉积物为实验样品。

2)DNA的抽提：①向实验样品中加入高浓度细胞裂解液，充分混匀，放入沸水浴中8-15min；如果实验样品中以革兰氏阴性菌居多时：沸水浴时间一般控制在10min以内，如果实验样品中主要以革兰氏阳性菌或细胞壁外有荚膜或多糖或胞外吸附众多的颗粒物的微生物，沸水浴时间最好控制在10-15min；②转入55-62℃水浴中水浴30min以上。③随后转入72℃水浴中水浴30min以上。④加入酚/氯仿/异戊醇混和液，混匀，在室温下静置10min左右，离心，将上清液用酚/氯仿/异戊醇重复抽提一次，收集上清液。⑤上清液用-20℃至4℃的无水乙醇沉淀，沉淀温度为4℃，沉淀时间30min以上，离心收集沉淀。⑥用浓度为70％的乙醇洗涤沉淀物两次。⑦沉淀物置于室温或真空干燥，用TE或无菌去离子水溶解沉淀，即为基因组DNA提取液。

所述高浓度细胞裂解液的各成分的终浓度为：0.10mol/l≤EDTA≤0.30mol/l；0.005mol/l≤Tris·HCl≤0.150mol/l；0.10mol/l≤NaCl(mol/l)≤0.30mol/l；2％≤SDS的质量百分浓度≤7.5％；0.30％≤CTAB的质量百分浓度≤0.75％。

本发明运用微生物学、生物化学、分子生物学、物理学和化学的原理，提供一种DNA的提取方法，以解决针对生境特殊的深海微生物的总基因组DNA提取过程中存在的效率低、通用性差、产率低、花费高、样品耗量大等问题，从而提高深海样品中DNA的产率和种类数量，以便获得更多的深海微生物基因资源和了解更多深海微生物的种类，使其分子生态学研究结果更全面，更准确。

本发明深海沉积样品全基因组DNA提取方法区别于传统的冷冻研磨-酶解、CTAB-酶解等方法，其优点是充分利用在适当的高温高盐条件下不仅可以破碎微生物的细胞壁与细胞膜，而且可以使蛋白质变性并沉淀；通过不同的温度梯度变化处理，以去除蛋白质、糖类和细胞壁碎片等物质的污染。本方法不仅可以用于深海沉积样品总基因组的抽提，而且还可用于深海酵母菌及一些采矿细菌的基因组抽提。获得的基因组质量好浓度高可广泛应用于微生物分子生态多样性、分子鉴定、目的基因扩增、系统进化等各项研究。

下面结合附图进一步详述本发明：

附图说明

图1用该方法抽提到的样品基因组电泳图片。其中：1代表阴性对照；2代表抽提深海Rhodosporidium diobovatum获得的基因组，3代表抽提深海沉积样品获得的总基因组；4代表抽提矿水样品获得的总基因组；Marker为lambda DNA-HindIII digest marker(1ug)；箭头所示的数字表示DNA的大小，单位为kb。

图2 PCR扩增获得的深海Rhodosporidium diobovatum基因组的得到的18S rDNA。其中1代表阴性对照；Marker为100bp marker；2代表获得的长约1800 bp的18S rDNA序列；箭头所示的数字表示DNA的大小，单位为bp。

图3 PCR扩增获得的深海沉积样品的基因组的得到的16 rDNA。其中1代表获得的长约1500 bp的16 rDNA序列；2代表阴性对照；3代表阳性对照；Marker为100bp marker；箭头所示的数字表示DNA的大小，单位为bp。

图4深海沉积样品中的生物多样性RFLP分析指纹图谱。其中：M代表100bp marker；箭头所示的数字表示DNA的大小，单位为bp；Marker中央的电泳图谱代表不同克隆子经酶切得到的指纹图谱。

图5 PCR扩增获得的深海Rhodosporidium diobovatum基因组的得到的ITS1序列。其中，1代表获得的长约600 bp的ITS1序列；2代表阴性对照；M代表100bp marker；箭头所示的数字表示DNA的大小，单位为bp。

具体实施方式

实施例1：深海软泥样品中总基因组的抽提

(1)在无菌条件下，称取深海软泥样品3g并移入体积为50ml的无菌带盖的离心管中，加30ml无菌人工海水基本盐，充分振荡后置于摇床上以180rpm速率匀速摇10-20min，然后3000rpm离心3min，上清液转移到新的离心管中；沉淀再重复洗涤两次，均收集上清液，沉淀保存备用。

(2)上清液，以12000rpm离心15min，收集沉淀。

(3)往沉淀中加入20ml灭菌磷酸盐缓冲液，充分振荡后置于摇床上以180rpm速率匀速摇10min，以12000rpm离心15min，收集沉淀。

(4)重复步骤(3)两次。沉淀即为实验样品。取微量实验样品进行显微形态观察并进行革兰氏染色，初步观察样品中微生物的形态。

(5)把实验样品完全转移到5ml离心管中，加入高浓度细胞裂解液(按照1g∶10ml)，充分振荡10min，立即放入沸水浴中并开始计时8-15min(如果实验样品中以革兰氏阴性菌居多时：沸水浴时间一般控制在10min以内；如果实验样品中主要以革兰氏阳性菌或细胞壁外有荚膜或多糖或胞外吸附众多的颗粒物的微生物，沸水浴时间最好控制在10-15min)，每隔2-3min轻轻翻转离心管5-8次。

(6)接着转入55-60℃水浴中水浴1h，每隔15min轻轻翻转离心管5-8次。

(7)随后转入72℃水浴中水浴1h，每隔15min轻轻翻转离心管5-8次。

(8)向离心管中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(V/V/V：25∶24∶1)，上下轻轻倒转离心管15min后，随后室温(25℃)静置10min，接着12000rpm离心5min，轻轻收集上清液并转入到新的离心管中。

(9)重复步骤(8)一次。

(10)往离心管中加入2.5倍体积的-20℃冷冻的无水乙醇，上下轻轻倒转离心管10次后，置于4℃冰箱中沉淀至少1h。沉淀完毕后12000rpm离心15min，收集沉淀。

(11)向载有沉淀的离心管中加入2ml 70％的乙醇，轻轻倒转溶液8次后静置15min，随后12000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀。

(12)重复步骤(11)一次。

(13)沉淀物置于室温或真空干燥后，加适量TE或无菌双蒸水溶解沉淀，即为基因组DNA提取液，4℃保存备用。

实施例2  深海Rhodosporidium diobovatum基因组抽提。

(1)收集对数生长期的菌液5ml，12000rpm离心5min，收集沉淀。

(2)往沉淀中加入5ml灭菌磷酸盐缓冲液，充分振荡后置于摇床上以180rpm速率匀速摇10min，以12000rpm离心15min，收集沉淀。

(3)重复步骤(2)两次。沉淀即为实验样品。

(4)往离心管中加入高浓度细胞裂解液(按照1g∶10ml)，充分振荡10min，立即放入沸水浴中并开始计时10-15min，每隔2-3min轻轻颠倒EP管5-8次。其它步骤同实施例1。

所述人工海水基本盐的组分(g/l)是：NaCl：24.4770；Na₂SO₄：3.9170；KCl：0.6640；MgCl₂·6H₂O：4.9810；CaCl₂·H₂O：1.1020；NaHCO₃：0.1920；KH₂PO₄：0.1500；MnCl₂·4H₂O：0.2000；FeSO₄·7H₂O：2.0000；Na₂S₂O₄：1.0000。

所述高浓度细胞裂解液的配置(总体积100ml)：Tris.HCl(pH8.0，1mol/l)，12.5ml；EDTA(pH 8.0，0.5mol/l)，50ml；NaCl(5mol/l)，5ml；SDS(20％)，25ml；CTAB(10％)，7.5ml。