治疗细菌感染的达巴万星组合物

摘要

本发明提供了治疗细菌感染的方法和组合物。该组合物可为低水平溶剂存在下的因子的组合，所述因子包括A0、A1、B1、B2、C0、C1、异B0和MAG。本发明方法包括施用达巴万星制剂以治疗细菌感染，尤其是皮肤和软组织革兰氏阳性菌感染。给药方案包括多剂量达巴万星给药，达巴万星常常在血流中保持治疗水平至少一周，提供对抗细菌感染的延长的治疗作用。还包括了肾病患者的给药方案。

说明书

发明领域

[0001]本申请涉及达巴万星(dal bavancin)组合物及在治疗细菌感染的方法中使用所述组合物的方法。

对相关申请的交叉参考

[0002]本申请是基于2005年4月26日提交的美国申请系列第[代理人案卷号第892,280-225号]号的国际申请，它是2004年4月27日提交的美国申请系列第10/834,395号的部分继续申请，后者是2003年11月14日提交的美国申请系列第10/714,261号的部分继续申请，后者请求享有2002年11月18日提交的第60/427,654号、2003年7月8日提交的第60/485,694号、2003年8月13日提交的第60/495,048号和2003年8月19日提交的第60/496,483号美国临时专利申请的权利，所有这些文件的公开内容都全文引入本文作为参考。

发明背景

[0003]根据美国疾病控制及预防中心(U.S.Center for DiseaseControl and Prevention)，医院源性血流感染是导致美国死亡发生的主要原因。在美国，每年插入的7百万个中心静脉导管(CVC)中约有5％与至少一次血流感染事件有关(每年约350,000件)。当细菌通过静脉导管进入血流时则发生导管相关的血流感染，且可能危及生命。

[0004]皮肤和软组织感染(SSTI)(也称为复杂(complicated)的和/或不复杂的(non-complicated)皮肤和皮肤结构感染(SSSI))是常见的医学病症，且常在创伤和手术程序后发生。金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌是最常从深层软组织感染患者中分离出的病原体，虽然包括在健康皮肤上发现的那些在内任何病原生物体均可造成感染。很多SSTI的严重程度为轻度或中度，允许以口服杀菌剂和局部清洗进行成功的治疗。相比之下，常发生在有潜在危险因素(例如血管损伤、糖尿病)患者中的更加严重或复杂的感染和/或由难治性或多重耐药细菌造成的感染可能需要强有力的静脉内抗菌治疗和积极的外科清创。

[0005]葡萄球菌是临床和治疗问题，且自20世纪60年代早期开始越来越多地与医院感染有关。凝固酶阳性种类的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)已成为社区获得性和医院感染长期以来的问题，且已将若干凝固酶阴性葡萄球菌认定为机会性人病原体，尤其是在重症监护室危重患者的治疗中。临床关注的另一个主要原因是在世界很多地方耐青霉素肺炎链球菌菌株的分离增加。

[0006]糖肽类抗生素万古霉素和替考拉宁已用于对抗由下列生物造成的严重医院感染：多重耐药的革兰氏阳性病原体，尤其是MRSA、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)和肠球菌。万古霉素和替考拉宁可用于MRSA引起的感染，且直至最近，所有分离株都对其敏感。然而，目前据报道，具有中等敏感性或对替考拉宁和万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌菌株的分离频率逐渐增加。已报道了基于耐药机制而被分为″VanA″、″VanB″或″VanC″的多种万古霉素耐药菌株。因此，需要替代的治疗选择。

[0007]对多数革兰氏阳性菌，替考拉宁至少与万古霉素活性相当，且似乎造成更少的不良事件。两种治疗形式都需要至少每天一次给药以实现完全康复。目前，对由所述病原体中的某些所造成的严重感染的治疗选择相当受限。革兰氏阳性病原体对万古霉素的新兴耐药性使得高度期望得到具有增加效力潜能的新抗生素。

[0008]此外，需要与当前可用的治疗相比给药较低频率的给药方案以增加患者的舒适度，尤其是对于胃肠外(例如静脉内或肌肉内)施用抗生素。有时因需要以胃肠外方式进行多日抗生素给药而必需住院，较低频率的给药将有利于允许该治疗实施于门诊患者。

[0009]虽然给药较低频率的给药是抗生素给药方案所希望的特征，但是所施用的抗生素的″治疗窗″(即毒性特征)必须充分可接受以允许施用较大的单个剂量而不会在被治疗患者中造成严重不良反应而危害治疗。此外，即使当抗生素呈现适合的治疗窗时，仅在抗生素呈现适当的血清半衰期以在期望给药间隔内维持治疗功效时可能进行给药较低频率的给药。抗生素的血清半衰期决定活体内药物的寿命和给药后血清水平将达到仍可有效杀菌的最小低谷水平的时间长度。施用抗生素的第一剂量后随着时间产生的血清低谷水平决定何时必须施用另一剂量以保持活体内的抗生素的最小杀菌水平。

[0010]最近，已从天然糖肽类合理地合成了成功的糖肽类抗生素。例如，从最初从马杜拉放线菌属培养物分离出的天然抗生素A40926合成了半合成糖肽达巴万星(Malabarba等人，1998，美国专利第5,750,509号)。达巴万星在对抗各种细菌菌株方面已经比万古霉素或抗生素利奈唑胺显示出了更大的功效，并且代表了对皮肤和软组织感染的有希望的新疗法(参见例如Jabes等人，2004，Antimicrob.Agents Chemother.48：1118-1123)。根据美国专利第5,750,509号，达巴万星是在它的N¹⁵氨基上具有一甲基部分的糖肽抗生素(参见图1的编号)，该N¹⁵-一甲基氨基可以是游离的(即-NHCH₃)，或被氨基保护基如叔丁氧羰基、苄氧羰基、芳烷基或苄基保护。在′509专利中报道的制备某些达巴万星成分的方法也生成了少量达巴万星的N¹⁵，N¹⁵-二烷基类似物，但这些分子没有被表征。

[0011]考虑到以上病原体，具有对抗一种或多种微生物(包括抗生素耐药菌)活性的其它抗生素将具有商业价值，且将满足本领域长期以来的需要。

发明概述

[0012]本发明提供了用达巴万星治疗或预防细菌感染的组合物、方法和药盒。令人惊讶的是，已发现稳定的达巴万星剂型具有药物窗和延长的血清半衰期，以允许约每5-7天或更长时间一次的治疗方案，同时保持活体内的抗菌特性。

[0013]因此，一方面提供了包括单位剂量达巴万星、稳定剂和药学可接受的载体的药物组合物，其中达巴万星的量足以为个体提供治疗或预防上有效的达巴万星血浆水平至少5天。

[0014]本发明的药物组合物通常制成药学可接受的形式来给个体给药，例如，药学可接受的含水制剂。该药物组合物优选通过胃肠外途径给药，例如，静脉内或肌内。因此，在该优选实施方案中，所述药物组合物通常是无菌的。

[0015]在一些实施方案中，单位剂量的达巴万星是以干粉(例如冻干)形式提供的，并且在对个体给药之前重构在药学可接受的载体如无菌含水制剂中。在一个实施方案中，药学可接受的载体包括5％右旋糖水溶液。本发明的药物组合物可对需要治疗或预防细菌感染的哺乳动物如人给药。在一些实施方案中，药物组合物可包括至少一种非达巴万星的抗生素，例如能有效(例如杀菌)对抗革兰氏阴性菌的抗生素和/或能有效对抗达巴万星对其无效的革兰氏阳性物种的抗生素，所述物种例如VanA万古霉素耐药菌株。

[0016]本发明提供了组合物、其制备方法和用室温稳定的达巴万星药物组合物治疗或预防细菌感染的方法。

[0017]在一些实施方案中，在给个体施用以前，使用一种或多种稳定化物质来抑制一种或多种达巴万星组分在作为干粉(例如冻干)制剂和/或作为含水制剂储存期间降解。降解可随着时间导致不希望地形成活性较低和/或无活性的组分，这会在活体内潜在地引起不良效果。优选的稳定剂包括非离子性组分，例如糖或糖醇，例如单-、二-或多糖或其衍生物，例如甘露醇、乳糖、蔗糖、山梨醇、甘油、纤维素、海藻糖、麦芽糖或右旋糖或其混合物。

[0018]在一个实施方案中，本发明包括含稳定达巴万星的药物组合物。

[0019]在另一个实施方案中，本发明包括含达巴万星和稳定剂的药物组合物。

[0020]在又一个实施方案中，本发明包括含达巴万星和稳定剂的pH约1-7、更优选2-6的药物组合物。在另一个实施方案中，组合物的pH为约3-5。稳定剂可包含糖类或氨基酸。糖类可为甘露醇、乳糖、或甘露醇和乳糖的组合。甘露醇和乳糖可以相等量或不等量加入。在一个实施方案中，加入相等量的甘露醇和乳糖，并且pH调节至约pH4.5。

[0021]在另一个实施方案中，本发明还包括含达巴万星和甘露醇的pH约3的药物组合物。在一个实施方案中，组合物的pH为约3.3。在另一个实施方案中，该组合物可进一步包含乳糖。乳糖和甘露醇可以相等量或不等量加入。

[0022]在另一个实施方案中，本发明还包括含达巴万星和稳定剂的药物组合物，其中，稳定剂包含甘露醇和乳糖。甘露醇和乳糖可以相等量加入。该组合物的pH可任选为1-7，更优选2-6，更优选3-5，更优选4-5，更优选约4.5。

[0023]由于糖苷键的原因，糖肽类、尤其是达巴万星是非常不稳定的。在室温下可存在一些降解，在40℃下降解更多。一些上述制剂可能需要特别的储存条件。特别地，可能需要冷藏(例如-40-10℃，可选地，-20-9℃，更优选2-8℃)。制剂可能另外要灭菌。当给药时，它们将形成稳定的、澄清的、无颗粒的溶液。溶液应当是稳定的，且不含沉淀物。

[0024]上述药物组合物在约25℃下经过约2年后，优选降解不超过约4％，更优选不超过约3％，更优选不超过约2％，更优选不超过约1％，更优选不超过约0.5％。可选地，上述药物组合物在约25℃下经过约2年后，具有不超过约4％MAG，更优选不超过约3％MAG，更优选不超过约2％MAG，更优选不超过约1％MAG，更优选不超过约0.5％MAG。

[0025]在另一个实施方案中，上述药物组合物在约40℃下经过约3-6个月后，优选降解不超过约6％，更优选不超过约5％，优选不超过约4％，优选不超过约3％，优选不超过约2％，优选不超过约1％。可选地，上述药物组合物在约40℃下经过约3-6个月后，优选具有不超过约6％MAG，更优选不超过约5％MAG，优选不超过约4％MAG，优选不超过约3％MAG，优选不超过约2％MAG，甚至更优选不超过约1％MAG。希望获得在40℃下稳定的化合物，特别是在不能将化合物储存在冰箱中或室温下的地方(例如，第三世界国家和印第安人居留地)。

[0026]在又一个实施方案中，药物组合物在约2-8℃下经过约2年后，降解不超过3％，更优选不超过约2％，更优选不超过约1％，更优选不超过约0.5％。可选地，药物组合物在约2-8℃下经过约2年后，具有不超过3％MAG，更优选不超过约2％MAG，更优选不超过约1％MAG，更优选不超过约0.5％MAG。

[0027]本发明包括可包含任何达巴万星因子的组合的达巴万星组合物。这些因子包括达巴万星因子A₀、A₁、B₁、B₂、C₀、C₁、异B₀和MAG。

[0028]本发明还包括降低达巴万星组合物中溶剂水平的干燥方法。该方法包括如下步骤：提供含达巴万星、水和溶剂的湿达巴万星，在约30℃下或更低温度下在约50毫巴或更低真空压下干燥湿达巴万星，直至湿达巴万星的含水量低于约20％(w/w)。然后将水加入湿达巴万星，并重复干燥步骤。重复这些加入水和干燥湿达巴万星的步骤，直至溶剂水平低于约3.0％(w/w)。这些步骤可重复一次、两次、三次、四次、五次、六次或达到所需的溶剂含量必需的那么多次。类似地，本发明还包括具有低溶剂水平的达巴万星组合物。在一个实施方案中，溶剂水平可低于3.0％(w/w)，可选地低于2.5％(w/w)，可选地低于2.0％(w/w)，可选地低于1.5％(w/w)，可选地低于1.0％(w/w)，可选地低于0.5％(w/w)，可选地低于0.1％(w/w)。溶剂可为丙酮。可选地，溶剂可为以下任何溶剂：乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、乙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、1，4-二噁烷、三氯乙烯、苯、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、1，1-二氯乙烷、1，1，1-三氯乙烷、乙腈、氯苯、环己烷、二氯甲烷、1，2-二甲氧基乙烷、N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、1，4-二噁烷、2-乙氧乙醇、乙二醇、甲酰胺、己烷、2-甲氧乙醇、甲丁酮、甲基环己烷、N-甲基吡咯烷酮、硝基甲烷、吡啶、二氧噻吩烷、四氢萘、甲苯、1，1，2-三氯乙烷、二甲苯、乙酸、茴香醚、1-丁醇、2-丁醇、乙酸丁酯、叔-丁甲醚、枯烯、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙醚、甲酸乙酯、甲酸、庚烷、醋酸异丁酯、醋酸异丙酯、3-甲基-1-丁醇、甲乙酮、甲基异丁酮、2-甲基-1-丙醇、戊烷、1-戊醇、1-丙醇、2-丙醇、乙酸丙酯、1，1-二乙氧基丙烷、1，1-二甲氧基甲烷、2，2-二甲氧基丙烷、异辛烷、异丙醚、甲基异丙基酮、甲基四氢呋喃、石油醚、三氯醋酸和三氟醋酸。另外，干燥过程可在约28℃或更低的温度下进行，可选地在约26℃或更低的温度下进行，可选地在约24℃或更低的温度下进行，可选地在约22℃或更低的温度下进行，可选地在约20℃或更低的温度下进行，可选地在约15℃或更低的温度下进行，可选地在约10℃或更低的温度下进行。干燥过程的真空压可为约50毫巴或更低，可选地约45毫巴或更低，可选地约40毫巴或更低，可选地约35毫巴或更低，可选地约30毫巴或更低，可选地约25毫巴或更低，可选地约20毫巴或更低，可选地约15毫巴或更低，可选地约10毫巴或更低，可选地约5毫巴或更低。另外，含水量可低于约25％(w/w)，可选地低于约20％(w/w)，可选地低于约15％(w/w)。

[0029]除了低溶剂含量以外，干燥过程也可降低达巴万星组合物中存在的MAG的量。MAG的存在量可低于约5％HPLC分布，可选地低于约4.5％HPLC分布，可选地低于约4.0％HPLC分布，可选地低于约3.5％HPLC分布，可选地低于约3.0％HPLC分布，可选地低于约2.5％HPLC分布，可选地低于约2.0％HPLC分布，可选地低于约1.5％HPLC分布，可选地低于约1.0％HPLC分布，可选地低于约0.8％HPLC分布，可选地低于约0.6％HPLC分布，可选地低于约0.5％HPLC分布，可选地低于约0.4％HPLC分布，可选地低于约0.3％HPLC分布，可选地低于约0.2％HPLC分布，可选地低于约0.1％HPLC分布。

[0030]本发明还包括含达巴万星因子B₂和异B₀的药物组合物。B₂和异B₀各自的含量可以独立地不超过约3.0％HPLC分布，可选地可以独立地不超过约2.5％HPLC分布，可选地可以独立地不超过约2.0％HPLC分布，可选地可以独立地不超过约1.5％HPLC分布，可选地可以独立地不超过约1.0％HPLC分布，可选地可以独立地不超过约0.5％HPLC分布，或可选地可以独立地不超过约0.1％HPLC分布。

[0031]另外，本发明还包括含达巴万星因子B₂、异B₀和MAG的药物组合物。B₂、异B₀和MAG各自的含量可以独立地不超过约3.0％HPLC分布，可选地可以独立地不超过约2.5％HPLC分布，可选地可以独立地不超过约2.0％HPLC分布，可选地可以独立地不超过约1.5％HPLC分布，可选地可以独立地不超过约1.0％HPLC分布，可选地可以独立地不超过约0.5％HPLC分布，或可选地可以独立地不超过约0.1％HPLC分布。

[0032]本发明还包括治疗细菌感染的方法，包括给需要治疗的患者提供至少一种上述药物组合物，并给患者施用治疗有效剂量的无菌、稳定、无颗粒、澄清的达巴万星。该方法可进一步包括施用单个后续治疗有效剂量。可在初始剂量以后大约5-10天或约一周施用单个后续治疗有效剂量。也可在初始剂量以后大约5-10天或约一周施用单个后续治疗有效剂量，其中不插入任何达巴万星剂量。在另一个实施方案中，该方法可包括施用多个后续剂量。可以大约5-10天间隔或一周间隔施用多个后续剂量。也可以大约5-10天间隔或一周间隔施用多个后续剂量，其中不插入任何达巴万星剂量。该方法还可包括在施用第一个剂量以后进一步监测感染的步骤，并且任选地相应调节后续剂量。

[0033]本发明还包括治疗肾损伤患者细菌感染的方法，包括给患者施用治疗有效剂量的无菌、稳定、无颗粒、澄清的达巴万星。损伤可以是轻度到重度。在一个实施方案中，治疗有效剂量在患者中达到至少100mg/L的峰浓度(C_max)。在另一个实施方案中，治疗有效剂量达到了至少13,000mg.h/L的患者暴露(曲线下面积)。该方法可包括施用约300-1200mg单剂量达巴万星，可选地约400mg，可选地约500mg，可选地约600mg，可选地约700mg，可选地约800mg，可选地约900mg，可选地约1000mg，可选地约1100mg，可选地约1200mg。

[0034]治疗肾损伤患者细菌感染的方法还可包括施用多剂量达巴万星。在一个实施方案中，可施用两个剂量，间隔约5-约10天，例如约一周间隔，或可选地约10-约18天间隔，例如约2周(或14天间隔)。可选地，剂量频率可为例如一周两次剂量、一周三次剂量、或一周多剂量。可选地，给药间隔可为例如以下任何：约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多天间隔。给予的剂量数可以为例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或多个剂量，在初始剂量以后的每个剂量在所选剂量间隔以后给予。

[0035]在一个实施方案中，第一剂量可为约750mg，第二(或后续)剂量可为约250mg。在另一个实施方案中，第一剂量可为约750mg，第二(或后续)剂量可为约150mg。在另一个实施方案中，第一剂量可为约750mg，第二(或后续)剂量可为约125mg。在另一个实施方案中，第一剂量可为约1000mg，第二(或后续)剂量可为约500mg。

[0036]在另一个实施方案中，第一剂量可为约200mg-约1500mg，可选地约200mg-约1300mg，可选地约100mg-约1500mg，可选地约200mg-约1400mg，可选地约300mg-约1300mg，可选地约400mg-约1200mg，可选地约500mg-约1100mg，可选地约600mg-约1000mg，可选地约1000mg，可选地约950mg，可选地约900mg，可选地约850mg，可选地约800mg，可选地约750mg，可选地约700mg，可选地约650mg，可选地约600mg，可选地约550mg，或可选地约500mg。第二剂量或后续剂量可为约200mg-约1500mg，可选地约200mg-约1300mg，可选地约100mg-约1500mg，可选地约200mg-约1400mg，可选地约300mg-约1300mg，可选地约400mg-约1200mg，可选地约500mg-约1100mg，或可选地约600mg-约1000mg，可选地约600mg，可选地约550mg，可选地约500mg，可选地约450mg，可选地约400mg，可选地约350mg，可选地约300mg，可选地约250mg，可选地约200mg，可选地约150mg，或可选地约100mg。可以理解的是，在给药方案中，任何以上第一剂量可与任何以上第二剂量或后续剂量组合。

[0037]在肾损伤患者或正常患者的多次给药方案中，第一剂量和第二(或后续)剂量之比可用倍数来定义。第一剂量的量可比第二剂量的量大约1倍。可选地，第一剂量可比第二(或后续)剂量的量大约1.5倍，大约2倍，大约2.5倍，大约3倍，大约3.5倍，大约4倍，大约4.5倍，大约5倍，大约5.5倍，或大约6倍。

[0038]类似地，第二(或后续)剂量的量可比第一剂量的量小约6倍。可选地，第二(或后续)剂量的量可比第一剂量的量小约5.5倍，可选地小约5.0倍，可选地小约4.5倍，可选地小约4.0倍，可选地小约3.5倍，可选地小约3.0倍，可选地小约2.5倍，可选地小约2.0倍，可选地小约1.5倍，可选地小约1.0倍。

[0039]治疗肾损伤患者细菌感染的方法可包括施用单剂量的达巴万星。患者可患有轻度、中度、重度或末期肾损伤。该单剂量的量可为约1200mg，可选地约1150mg，可选地约1100mg，可选地约1050mg，可选地约1000mg，可选地约950mg，可选地约900mg，可选地约850mg，可选地约800mg，可选地约750mg，可选地约700mg，可选地约650mg，可选地约600mg，可选地约550mg，可选地约500mg。单剂量的量还可为约250mg-约1300mg，可选地约300mg-约1200mg，可选地约350mg-约1100mg，可选地约400mg-约1000mg，可选地约450mg-约1000mg，可选地约500mg-约1000mg，可选地约550mg-约950mg，可选地约600mg-约900mg，可选地约650mg-约850mg。

[0040]本发明还包括制备上述药物组合物的方法，包括提供达巴万星并加入稳定剂。在一个实施方案中，稳定剂是糖类或糖。在另一个实施方案中，稳定剂是甘露醇、乳糖或其组合。

[0041]在又一个实施方案中，该方法进一步包括调节组合物pH的步骤，如果需要的话。在一个实施方案中，将pH调节至约1-7，更优选约2-6，更优选约3-5。可用pH调节剂调节pH。pH调节剂包括碱金属和碱土金属的无机碱，例如NaOH、Ca(OH)₂、KOH和Mg(OH)₂。碱金属和碱土金属的无机氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐也可用作pH调节剂。无机弱酸和两性酸例如磷酸、硼酸、硫酸和所有其它含硫的酸的碱金属盐和碱盐也可用作pH调节剂。氨基酸例如赖氨酸、葡甲胺、精氨酸、n-甲基葡糖胺也可用于调节pH。有机碱，包括所有的胺、酚、弱羧酸、二羧酸、羟基羧酸和它们的盐也可用于调节组合物的pH。

[0042]另一方面，提供了治疗有此需要的个体细菌感染的方法，包括以足以在个体中提供治疗有效的达巴万星血浆水平持续至少5天的量施用至少一个单位剂量的达巴万星，和药学可接受的载体。达巴万星的治疗有效血浆水平通常为至少约4mg达巴万星每升血浆。在一个实施方案中，所施用的达巴万星剂量是临床有效的量，并且相对于用药物如替考拉宁和万古霉素的标准护理，它还具有降低的不良副作用。

[0043]达巴万星可以单剂量或以多剂量施用。在一些实施方案中，施用约100mg-约4000mg、例如3000mg的单剂量的达巴万星。在不同实施方案中，单个达巴万星剂量可包括至少约0.1、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5或3克中的任何一个。

[0044]在其它实施方案中，以约5-约10天间隔，例如约一周间隔，施用两个剂量。第一剂量可为约500-约5000mg达巴万星，第二剂量可为约250mg-约2500mg达巴万星。通常，第一剂量包括第二剂量中所含的达巴万星量的约1.5-约3倍，通常至少约2倍。例如，第一剂量可为约1000mg，并且第二剂量可为约500mg达巴万星。在另一个实施方案中，第一剂量可为约1200mg，并且第二剂量可为约600mg。在施用两个剂量的方法中，在施用第二剂量之前个体中达巴万星血浆谷水平通常是每升血浆约4mg，经常至少约10mg，经常至少约20mg，更经常至少约30mg达巴万星，更经常是至少约40mg达巴万星每升血浆。

[0045]通常，本发明方法包括胃肠外给药，例如静脉内给药。在一些实施方案中，给药是静脉内，控制给药速率使得给药要经过至少约30分钟或更久。

[0046]本发明方法可用于治疗革兰氏阳性细菌感染，例如金黄色葡萄球菌或酿脓链球菌皮肤和软组织感染。在一些实施方案中，感染是青霉素耐药的和/或多重耐药的。

[0047]另一方面，提供了预防细菌感染的方法，该方法包括以足以在个体中提供预防有效的达巴万星血浆水平持续至少约1天、3天、5天、一周、10天或更长时间的量施用至少一个单位剂量的达巴万星，和药学可接受的载体。达巴万星的剂量可为例如约100mg-约1000mg。在一些实施方案中，达巴万星是在医疗处置或住院之前、期间、或之后施用。

[0048]本发明的治疗或预防方法可包括施用至少一种非达巴万星的抗生素，优选对革兰氏阴性菌有效的抗生素和/或对革兰氏阳性菌有效的抗生素，这些细菌是达巴万星所不能有效对抗的，例如VanA菌株。

[0049]另一方面，提供了药盒，它包括至少一个单位剂量的达巴万星和用于细菌感染的治疗或预防方法的说明书，所述达巴万星的量足以在个体中提供治疗有效的达巴万星血浆水平持续至少约5天或提供预防有效的达巴万星血浆水平持续至少约1天。药盒可包含两个单位剂量，其中第一剂量包括第二剂量中所包括的达巴万星量的1.5-3倍，经常至少约2倍。药盒还可包括非达巴万星抗生素，优选对革兰氏阴性菌有效的抗生素。

[0050]在一个实施方案中，提供了药盒，它包括含有干粉(例如冻干)达巴万星组合物的第一容器和含有预定量的用于与达巴万星组合物混合的生理学可接受的水溶液的第二容器。该溶液优选是无菌水溶液。在一个实施方案中，药盒包括将达巴万星组合物给个体施用的递送装置，例如注射器或静脉内给药装置。

[0051]本发明还提供了对感染性微生物有用的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物。本发明化合物对于治疗和/或预防微生物感染，例如SSTI和其它细菌感染是有用的。

[0052]本发明部分基于发现了N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物，它具有至少可与先前已知的N¹⁵-一烷基抗生素化合物如达巴万星化合物相当的、或甚至更大的抗微生物活性。另外，如下列实施例中所述，当与先前已知的N¹⁵-一烷基抗生素化合物如N¹⁵-一甲基达巴万星化合物相比，本发明的某些N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物显示出了更广谱的抗微生物活性。

[0053]一方面，本发明提供了式(I)的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物：

本发明的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物(原子编号根据图26)在氨基末端氮上包含两个烷基取代基。换句话说，在式(I)中，R¹和R¹′是烷基。在本发明最优选的实施方案中，R¹和R¹′是甲基。式(I)的其它取代基在下面详细描述。优选的取代基包括在本领域技术人员已知的抗生素A40926化合物和/或达巴万星化合物上发现的那些取代基。例如，在优选的实施方案中，G和M是糖基部分，例如在下面章节中描述的氨基葡糖醛酸基和吡喃甘露糖基部分。在某些实施方案中，氨基葡糖醛酸基部分被酰化，例如被脂肪酸酰化，并且在某些实施方案中，吡喃甘露糖基部分被乙酰化。

[0054]在某些实施方案中，X是OH，而在进一步的实施方案中，X是氨基烷基氨基。氨基烷基氨基可以是本领域技术人员已知的任何氨基烷基氨基，包括在美国专利第5,750,509号中描述的那些。在优选实施方案中，X是N，N-二甲氨基丙氨基。如下列实施例中详细所述，其中X是氨基烷基氨基的式(I)化合物显示出了可与相应的达巴万星化合物如美国专利第5,750,509号中所述的那些化合物相比的或更大的抗菌活性。尽管其中X是氨基烷基氨基的化合物是优选的，然而其中X是OH的化合物例如对于制备其中X是氨基烷基氨基的本发明化合物也是有用的，并且它们本身也可以用于治疗和/或预防微生物感染。

[0055]另一方面，本发明提供了包含本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物和第二化合物的组合物。第二化合物可以是本领域技术人员已知的任何化合物。在特定实施方案中，第二化合物是抗生素化合物，例如抗生素A40926化合物或达巴万星化合物。在进一步的实施方案中，第二化合物还是本发明的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物。本发明的示例组合物包括抗生素A 40926化合物和/或达巴万星化合物的混合物，它进一步包含式(I)化合物。在特定实施方案中，组合物富含本发明的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物。富集可以相对于组合物的抗生素A40926化合物和/或达巴万星化合物，或相对于组合物的其它化合物，或这两者。在某些实施方案中，本发明提供了包含纯化的本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物，分离的本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物，或纯化和分离的本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的组合物。

[0056]进一步的方面，本发明提供了包含本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的药物组合物。优选的组合物包含其中X是氨基烷基氨基的式(I)化合物。组合物可以进一步包含其它活性成分，包括本领域技术人员已知的抗生素A40926化合物和/或达巴万星化合物。在某些实施方案中，药物组合物进一步包含药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。在特定实施方案中，本发明提供了用于例如治疗和/或预防微生物感染的本发明化合物的药物单位剂量。

[0057]进一步的方面，本发明提供了包含适合于与药学可接受的赋形剂一起重构的含达巴万星因子B₀和B₂的无菌、稳定的、无颗粒达巴万星粉末的剂型。名称B₂、C₂和N¹⁵，N¹⁵-二甲基达巴万星B₀可互换使用。在一个实施方案中，因子B₀的含量不少于约75％HPLC分布，可选地不少于约80％HPLC分布，可选地不少于约85％HPLC分布，可选地不少于约90％HPLC分布，可选地不少于约95％HPLC分布。B₂的含量不少于约4.0％HPLC分布，可选地不少于约5.0％HPLC分布，可选地不少于约6.0％HPLC分布，可选地不少于约7.0％HPLC分布，可选地不少于约8.0％HPLC分布，可选地不少于约9.0％HPLC分布，可选地不少于约10.0％HPLC分布，可选地不少于约15.0％HPLC分布，可选地不少于约20.0％HPLC分布，可选地不少于约25.0％HPLC分布，可选地不少于约30.0％HPLC分布，可选地不少于约40.0％HPLC分布。特定组分的百分比HPLC分布可以通过比较每个单一组分的面积与总色谱面积来计算。该剂型可进一步包括至少一种另外的因子，例如达巴万星因子A₀、A₁、B₁、C₀或C₁。

[0058]进一步的方面，本发明提供了含达巴万星因子B₀和B₂的药物组合物。在一个实施方案中，因子B₀的含量不少于约75％HPLC分布，可选地不少于约80％HPLC分布，可选地不少于约85％HPLC分布，可选地不少于约90％HPLC分布，可选地不少于约95％HPLC分布。B₂的含量不少于约3.0％HPLC分布，可选地不少于约4.0％HPLC分布，可选地不少于约5.0％HPLC分布，可选地不少于约6.0％HPLC分布，可选地不少于约7.0％HPLC分布，可选地不少于约8.0％HPLC分布，可选地不少于约9.0％HPLC分布，可选地不少于约10.0％HPLC分布，可选地不少于约15.0％HPLC分布，可选地不少于约20.0％HPLC分布，可选地不少于约25.0％HPLC分布，可选地不少于约30.0％HPLC分布，可选地不少于约40.0％HPLC分布。如上定义，特定组分的百分比HPLC分布可以通过比较每个单一组分的面积与总色谱面积来计算。药物组合物可进一步包括至少一种另外的因子，例如达巴万星因子A₀、A₁、B₁、C₀或C₁。

[0059]另一方面，本发明还提供了B₂组分的去-浓缩。在一个实施方案中，因子B₂的含量不多于约5.0％HPLC分布，可选地不多于约4.5％HPLC分布，可选地不多于约4.0％HPLC分布，可选地不多于约3.5％HPLC分布，可选地不多于约3.0％HPLC分布，可选地不多于约2.5％HPLC分布，可选地不多于约2.0％HPLC分布，可选地不多于约1.5％HPLC分布，可选地不多于约1.0％HPLC分布，可选地不多于约0.5％HPLC分布，可选地不多于约0.1％HPLC分布。

[0060]另一方面，本发明提供了治疗和/或预防有此需求的对象微生物感染的方法。该方法可以包括对该对象施用有效量的本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物。本发明包括预防或治疗革兰氏阳性或抗生素耐药性细菌感染，例如芽孢杆菌、棒状杆菌、李斯特菌、肠球菌、葡萄球菌、链球菌、奈瑟菌或梭菌属感染，尤其是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、A群和C群链球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、淋病奈瑟菌、或艰难梭菌。可以用本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物、组合物和方法预防或治疗的其它感染包括革兰氏阴性细菌感染，例如巴尔通体属、布鲁氏菌属、弯曲杆菌属、肠杆菌属、埃希氏杆菌属(以及其它Proteobacteria)、弗朗西斯氏菌属、缠绕杆菌属、嗜血杆菌属、克雷伯氏菌属、军团杆菌属、钩端螺旋体属、摩根氏菌属、莫拉菌属、变形杆菌属、普罗威登斯菌属、假单胞菌属、沙门氏菌、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、寡养单胞菌属、弧菌属和耶尔森氏菌属感染，尤其是大肠埃希菌、普通变形杆菌、绿脓假单胞菌，和酵母菌如白色念珠菌感染。

附图的简要说明

[0061]图1A描述了在25℃下，在含或不含甘露醇的不同药物组合物中，相对于时间的达巴万星成分B₀的量。

[0062]图1B描述了在25℃下，在含或不含甘露醇的不同药物组合物中，相对于时间的MAG的量。

[0063]图2A描述了在40℃下，在含或不含甘露醇的不同药物组合物中，相对于时间的达巴万星成分B₀的量。

[0064]图2B描述了在40℃下，在含或不含甘露醇的不同药物组合物中，相对于时间的MAG的量。

[0065]图3A描述了在25℃下，在含甘露醇和/或乳糖的不同药物组合物中，相对于时间的达巴万星成分B₀的量。

[0066]图3B描述了在25℃下，在含甘露醇和/或乳糖的不同药物组合物中，相对于时间的MAG的量。

[0067]图4A描述了在40℃下，在含甘露醇和/或乳糖的不同药物组合物中，相对于时间的达巴万星成分B₀的量。

[0068]图4B描述了在40℃下，在含甘露醇和/或乳糖的不同药物组合物中，相对于时间的MAG的量。

[0069]图5描述了在静脉内单次输注1000mg达巴万星以后，相对于时间的达巴万星血浆浓度。

[0070]图6描述了达巴万星与人血清白蛋白结合的等温滴定量热法数据(上图)，和与测定自达巴万星：蛋白为2∶1的结合模型的曲线相拟合的数据的图示(下图)。

[0071]图7描述了达巴万星的电喷射电离质谱。

[0072]图8是达巴万星浓度相对于达巴万星多聚体对单体的总体比率的图，并描述了达巴万星多聚体对单体的总体比率随着达巴万星浓度增加而增加。

[0073]图9是pH相对于达巴万星多聚体对单体的总体比率的图，并描述了达巴万星多聚体对单体的总体比率随着pH增加而增加。

[0074]图10描述了在甲酸铵5mM pH5溶液中的达巴万星的电喷射电离质谱。

[0075]图11描述了在甲酸铵50mM pH5溶液中的达巴万星的电喷射电离质谱。

[0076]图12描述了在甲酸铵100mM pH5溶液中的达巴万星的电喷射电离质谱。

[0077]图13描述了在水中的替考拉宁(50μg/mL)的电喷射电离质谱。

[0078]图14描述了在水中的替考拉宁(100μg/mL)的电喷射电离质谱。

[0079]图15描述了HSA对26℃(pH 7.4)下达巴万星/三肽结合作用的表观解离常数的影响。

[0080]图16描述了在相同条件下，使用相同的三肽溶液，三肽与万古霉素和达巴万星结合的等温量热(ITC)数据的对比。

[0081]图17A和17B描述了达巴万星单体和多聚体(包括二聚体)与三肽配体和HSA的可能的相互作用。图17A描述了在溶液中单体-二聚体平衡的达巴万星作为单体与HSA上的两个独立位点结合。图17B描述了配体与溶液中的达巴万星二聚体结合并更弱地与连接到HSA上的达巴万星单体结合。

[0082]图18提供了平均达巴万星血浆浓度-时间曲线。

[0083]图19提供了平均达巴万星血浆浓度-时间曲线。

[0084]图20提供了另外的平均达巴万星血浆浓度-时间曲线。

[0085]图21提供了在整个相对治疗期的达巴万星暴露相对于肌酸酐清除率的图。

[0086]图22提供了在相对治疗期过程中的暴露相对于总体暴露的对比。

[0087]图23提供了肾功能正常对象和重度肾损伤对象的达巴万星浓度-时间曲线。

[0088]图24提供了达巴万星血浆浓度时间曲线。

[0089]图25提供了在整个治疗期中达巴万星暴露的对比。

[0090]图26提供了抗生素A40926化合物和达巴万星化合物的结构，包括所选原子的编号；

[0091]图27提供了达巴万星B₀的结构；

[0092]图28提供了本发明示例的N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物的结构；

[0093]图29-31提供了说明本发明实施例的图解，证实了本发明N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物的结构；

[0094]图32-33提供了证实N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物结构的ESI和HPLC色谱图；

[0095]图34提供了达巴万星B₂的结构；

[0096]图35提供了达巴万星B₂(N¹⁵，N¹⁵-二甲基达巴万星B₀)的红外光谱；

[0097]图36提供了达巴万星B₂(N¹⁵，N¹⁵-二甲基达巴万星B₀)的ESI-MS谱；和

[0098]图37图解说明了本发明组合物的HPLC示踪。

[0099]图38提供了异B₀的质谱。

[00100]图39图解说明了异B₀的HPLC示踪。

[00101]图40A-C提供了异B₀的质谱。

[00102]图41提供了异B₀的¹H-NMR谱。

[00103]图42提供了异B₀的¹³C-NMR谱。

[00104]图43提供了达巴万星质子定位的鉴定。

[00105]图44提供了在股感染小鼠中达巴万星的血浆药代动力学。

[00106]图45提供了单剂量达巴万星随时间对体内杀死肺炎链球菌的作用。

[00107]图46提供了单剂量达巴万星随时间对体内杀死金黄色葡萄球菌的作用。

[00108]图47提供了达巴万星给药间隔和对抗肺炎链球菌功效之间的关系。

[00109]图48提供了达巴万星给药间隔和对抗金黄色葡萄球菌功效之间的关系。

[00110]图49提供达巴万星PK/PD参数和对抗肺炎链球菌功效之间的关系。

[00111]图50提供了达巴万星PK/PD参数和对抗金黄色葡萄球菌功效之间的关系。

[00112]图51提供了达巴万星对抗各种菌株的剂量反应曲线。

[00113]图52提供了达巴万星对抗肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的剂量反应曲线。

[00114]图53提供了达巴万星在被肺炎链球菌感染的正常小鼠和中性粒细胞减少小鼠中的剂量反应曲线。

[00115]图54提供达巴万星在肺和股感染模型中的剂量反应曲线。

发明的详细描述

定义

[00116]当描述本发明化合物、包含该化合物的药物组合物和使用该化合物和组合物的方法时，下列术语具有下列含义，除非特别说明。

[00117]″抗生素A40926化合物″指的是本领域技术人员已知的糖肽抗生素。典型的抗生素A40926化合物描述在美国专利第4,935,238、4,868,171和4,782,042号中，其内容由此被全文引入本文作为参考。

[00118]″达巴万星化合物″指的是在美国专利第5,750,509号和美国专利申请公开第2004/0142883号中所述的糖肽抗生素，其内容由此被全文引入本文作为参考。本领域技术人员已知的典型达巴万星化合物的系统命名是瑞斯托霉素A苷元，5，31-二氯-38-脱(甲氧羰基)-7-脱甲基-19-脱氧-56-0-(2-脱氧-2-((10-甲基-1-氧代十一烷基)氨基)-β-D-glucopyranuronosyl)-38-(((3-(二甲氨基)丙基)氨基)-羰基)-42-0-α-D-吡喃甘露糖基-N¹⁵-甲基-。实例包括在图26和27中描述的那些。达巴万星化合物包括在56位和42位具有任选糖部分和在糖上具有任选酰基例如脂肪酸的那些化合物。达巴万星化合物可以衍生自本领域技术人员已知的天然抗生素A-40926。典型的达巴万星化合物包括在美国专利申请公开第2004/0142883号中描述的那些，例如达巴万星A₀、A₁、B₀、B₁、C₀和C₁。

[00119]在以下章节中详细描述的″N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物″指的是本发明化合物，即，在它的N¹⁵氮上具有两个烷基的抗生素化合物。本发明的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物可以衍生自抗生素A40926化合物或衍生自达巴万星化合物如达巴万星A₀、A₁、B₀、B₁、C₀和C₁。

[00120]在以下章节中详细描述的″N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物″指的是本发明化合物，即在它的N¹⁵氮上具有两个甲基的抗生素化合物。

[00121]″酰基″指的是基团-C(O)R，其中，R是烷基。

[00122]″烷基″指的是单价饱和的脂肪族烃基，优选具有1-约11个碳原子，更优选1-8个碳原子，再优选1-6个碳原子。烃链可为直链或支链。该术语的示例是例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基、正辛基和叔辛基等基团。术语″低级烷基″指的是具有1-6个碳原子的烷基。

[00123]″亚烷基″指的是二价饱和的脂肪族烃基，优选具有1-11个碳原子，更优选1-6个碳原子，它可以是直链或支链。该术语的示例是例如亚甲基(-CH₂-)、亚乙基(-CH₂CH₂-)、亚丙基异构体(例如-CH₂CH₂CH₂-和-CH(CH₃)CH₂-)等基团。

[00124]″氨基″指的是基团-NH₂。

[00125]″烷氨基″指的是基团-NH-烷基或-N(烷基)₂。

[00126]″氨基烷基氨基″指的是-NR-(烷基)-NR′R″形式的基团，其中，R、R′和R″各自独立代表氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基(cycloheteroalkyl)、取代的杂环烷基、杂芳基或取代的杂芳基。优选R、R′和R″基团包括氢和烷基。典型的氨基烷基氨基描述在美国专利第5,750,509号中，其内容由此被全文引入作为参考。

[00127]″羧基″指的是基团-C(O)OH。

[00128]″二烷氨基″指的是基团-NRR′，其中，R和R′各自独立地代表如本文定义的烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、杂芳基或取代的杂芳基。

[00129]″卤代″或″卤素″指的是氟、氯、溴和碘。优选的卤素基团是氟或氯。

[00130]通过比较对应于特定组分的峰面积与总色谱面积，计算特定组分的″百分比HPLC分布″。

[0013]″药学可接受的″意味着联邦政府或国家政府(通过对于调查研究或商业应用的管理机构)批准的，或列举在美国药典或其它公认用于动物尤其用于人类的药典中的。

[00132]″药学可接受的盐″指的是本发明化合物的盐，它是药学可接受的，且具有想要的母体化合物的药理学活性。这些盐包括：(1)与有机酸或无机酸形成的酸加成盐，这些酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、丙酸、己酸、环戊丙酸、乙醇酸、戊二酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、山梨酸、抗坏血酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、苦味酸、肉桂酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、月桂酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、苯甲酸、谷氨酸、羟萘甲酸、水杨酸、硬脂酸和粘康酸等酸；或(2)当母体化合物中存在的酸性质子遇到以下情况时形成的盐：(a)被金属离子，例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子取代，或被碱金属或碱土金属氢氧化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁和氢氧化钡、胺取代，或(b)与有机碱配位，例如脂肪族、脂环族或芳香族有机胺，例如甲胺、二甲胺、二乙胺、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡萄糖胺等(参见例如美国专利第5,606,036号)。

[00133]盐进一步包括，仅仅举例而言，钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、四烷基铵盐等，且当化合物包含碱性官能团时，无毒有机酸或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、醋酸盐、马来酸盐和草酸盐等。术语″药学可接受的阳离子″指的是酸性官能团的无毒药学可接受的阳离子抗衡离子。这样的阳离子的例子是钠、钾、钙、镁、铵和四烷基铵阳离子等。

[00134]″药学可接受的赋形剂″指的是与本发明化合物一起施用的稀释剂、辅剂、赋形剂或载体。

[00135]″溶剂化物″指的是本发明化合物或其盐，它进一步包括通过非共价分子间力结合的化学计量量的或非化学计量量的溶剂。当溶剂是水时，溶剂化物是水合物。

[00136]″预防(Preventing)″或″预防(prevention)″指的是减少获得疾病或病症的风险(即，引起疾病的至少一种临床症状不在对象中发生，该对象可能暴露于或易患疾病，但尚未经历或表现出疾病症状)。优选地，预防指的是在未被疾病或病症影响或还未表现出疾病或病症的症状的对象中使用化合物或组合物，例如还未被感染或还未表现出感染症状的对象。

[00137]″对象″包括人类。术语″人″、″患者″和″对象″在本文中可互换使用。

[00138]″治疗有效量″指的是当给患者施用治疗疾病时，化合物或组合物的量足以实现对该疾病的治疗。″治疗有效量″尤其可以根据化合物、疾病及其严重性、受治疗患者的年龄、体重等而改变。

[00139]对任何疾病或病症的″治疗(treating)″或″治疗(treatment)″在一个实施方案中指的是改善患者中存在的疾病或病症(即，抑制或减轻疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施方案中，″治疗(treating)″或″治疗(treatment)″指的是改善至少一个身体参数，该参数可能是患者难以辨别的。在又一个实施方案中，″治疗(treating)″或″治疗(treatment)″指的是身体上地(例如稳定可辨别的症状)或生理学上地(例如稳定身体参数)或在这两方面调节疾病或病症。在又一个实施方案中，″治疗(treating)″或″治疗(treatment)″指的是延缓疾病或病症的发作。

[00140]可以理解的是，具有相同分子式，但其原子的键合性质或顺序或其原子在空间的排列不同的化合物被称为″异构体″。其原子在空间的排列不同的异构体被称为″立体异构体″。

[00141]不是彼此镜像的立体异构体被称为″非对映异构体″，是彼此的不可重叠镜像的立体异构体被称为″对映异构体″。当化合物具有不对称中心时，例如当它与四个不同基团键合时，可能存在一对对映异构体。对映异构体可以以其不对称中心的绝对构型表征，并根据Cahn和Prelog规则被指定为(R)或(S)，或可以以其中分子旋转偏振光平面的方式表征，并被指定为右旋或左旋(即，分别为(+)-或(-)-异构体)。手性化合物可以作为单独的对映异构体或作为其混合物存在。包含等比例对映异构体的混合物被称为″外消旋混合物″。

[00142]在某些实施方案中，本发明化合物可具有一个或多个不对称中心；该化合物因此可以作为单独的(R)-或(S)-对映异构体或作为其混合物生产。除非另外说明，例如通过指定通式任何位置的立体化学，说明书和权利要求书中对特定化合物的说明或命名都意欲既包括单独的对映异构体又包括其混合物(外消旋或否)。测定立体化学和分离立体异构体的方法是本领域公知的。在特定实施方案中，本发明提供了经碱处理的本文所述化合物的立体异构体。

[00143]本发明提供了新的达巴万星药物组合物、制备药物组合物的方法和使用该新组合物治疗细菌感染的方法。尤其是，本发明提供了具有杀菌活性的稳定的达巴万星组合物，它可冷藏或在室温下保存长时间，更优选在室温下至少一年，更优选在室温下至少两年，而不出现达巴万星活性组分的显著降解。

[00144]本发明还提供了改进的剂量方案和新的达巴万星组合物，和治疗耐抗生素细菌感染的改进方法。尤其是，本发明提供了具有对抗一种或多种抗生素耐药菌株例如MRSA的活性的达巴万星组合物，它可以每5-7天或更长时间一次的给药方案给药。

[00145]在科学文献中也被称为BI 397或VER001的达巴万星是半合成的糖肽混合物，其性质已报道在美国专利第5,606,036、5,750,509、5,843,679和5,935,238号中。

[00146]当用在本文中时，术语″达巴万星″指的是包含如下成分的组合物：一种或多种、优选两种或多种、在某些情况下三种或多种、在某些情况下四种或多种、在某些情况下五种或多种如下所述密切相关的被称为″A₀″、″A₁″、″B₀″、″B₁″、″C₀″、″C₁″、″B₃″或″C₂″、″D₀″和″D₁″的同系物、或其单体、多聚体(即二聚体或更高阶的多聚体)、互变异构体、酯、溶剂化物或药学可接受的盐。当用在本文中时，″二聚体″或″多聚体″指的是同型二聚体或同型多聚体，即由相同达巴万星同系物单体构成的二聚体或多聚体；或异型二聚体或异型多聚体，即由至少两种不同的达巴万星同系物单体构成的二聚体或多聚体。因子区别在于N-酰基氨基葡萄糖醛酸部分的脂肪酸侧链结构，除了C₂(也叫作B₂)以外。C₂组分的质谱表明在末端氨基上存在另外的亚甲基。达巴万星常常包括″MAG″，它是如下所述缺乏酰基葡糖醛胺(acylglucuronamine)部分的非同系物变体。个别地，达巴万星同系物和MAG有时候在本文中被称作″达巴万星组分″。

[00147]如Malabarba和Donadio(1999)Drugs of the Future24(8)：839-846中所述，通过化学修饰天然糖肽复合物A-40,926制备达巴万星。达巴万星的主要组分是因子B₀，它占整个复合物的＞75％。

[00148]达巴万星组合物中存在的各组分的量由多种因素决定，包括例如天然糖肽复合物A-40926(它是达巴万星的前体，参见例如美国专利第5,843,679号)的制备中所用的发酵条件、用于从发酵肉汤中回收A-40926的条件，用于选择性酯化A-40926的糖部分的羧基的化学反应、用于使肽基羧基酰胺化的条件、用于使N-酰氨基葡糖醛酸官能团的羧基酯皂化的条件、用于从合成混合物中回收达巴万星的条件和类似条件。

[00149]在优选实施方案中，达巴万星组合物包含至少约80-约98％重量的B₀组分。在特别优选的实施方案中，达巴万星包含如下量的B₀：

表1.达巴万星组合物中B₀组分的优选量

优选的¹更优选的¹再更优选的¹80-9880-9780-9681-9881-9781-9682-9882-9782-9683-9883-9783-9684-9884-9784-9685-9885-9785-9686-9886-9786-9687-9887-9787-9688-9888-9788-9689-9889-9789-9690-9890-9790-96

¹各范围代表相对于包括MAG在内的达巴万星组合物中所存在的全体达巴万星组分的B₀的摩尔％。

[00150]在一个实施方案中，达巴万星组合物或制剂包含最少量的组分C₀、C₁和C₂(B2)，如果有的话。在另一个实施方案中，达巴万星组合物或制剂不包含任何的组分C₀、C₁和C₂(B2)。

[00151]先前已经用HPLC纯化了各达巴万星因子，并用NMR表征。在美国专利第5,750,509号中，Malabarba等人描述了抗生素A40926衍生物，其表征为在N-酰基氨基葡糖醛酸基部分上具有羧基、(C₁-C₄)烷氧羰基、氨基羰基、(C₁-C₄)烷氨基羰基或羟甲基取代基，且在分子的63位上具有羟基或聚胺取代基。发现本发明化合物在体外具有对抗耐糖肽肠球菌和葡萄球菌的高活性。然而，Malabarba等人既没有认识到药学有益的因子的组合，也没有鉴定或表征缺乏酰基葡糖醛胺部分的降解产物。Malabarba等人从未监测MAG，或生产出无菌形式。Malabarba等人仅仅用HPLC纯化了少量，并未进行定量物质分析。

[00152]数种达巴万星组分的化学结构式如下II所述：

  达巴万星组分        R    R    分子量      A₀    -CH(CH₃)₂    H    1802.7      A₁    -CH₂CH₂CH₃    H    1802.7      B₀    -CH₂CH(CH₃)₂    H    1816.7      B₁    -CH₂CH₂CH₂CH₃    H    1816.7      B₂或C₂    -CH₂CH(CH₃)₂    CH₃    1830.74      C₀    -CH₂CH₂CH(CH₃)₂    H    1830.7      C₁    -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃    H    1830.7      D₀    -(CH₃)₂    H    1788.66      D₁    -CH₂CH₃    H    1788.66      MAG    --    H    1459.27

[00153]所有上述达巴万星组分对多种革兰氏阳性菌具有杀菌活性。然而，被称为″MAG″的一种非同系达巴万星组分(它缺少其它组分中存在的酰基葡糖醛胺部分)与其它达巴万星组分相比，体内和体外的杀菌功效都较低(参见表2和3)。认为MAG是一种或多种其它达巴万星组分的分解产物。因此在优选实施方案中，达巴万星中MAG的量低于所存在的包括MAG在内的所有达巴万星组分的约4、3.5、3、2.5、2、1.5、1或0.5摩尔百分比。

表2.MAG与达巴万星和万古霉素相比，对抗金黄色葡萄球菌鼠类败血症的ED₅₀

 微生物化合物MIC(μg/mL)ED₅₀(mg/kg) MSSA金黄色葡萄球菌Smith 819MAG达巴万星万古霉素0.50.060.50.30.051.7 MRSA金黄色葡萄球菌3817MAG达巴万星万古霉素0.5≤0.030.51.60.71.0

**治疗：通过皮下途径，在感染10分钟内处理一次

表3.微生物学活性

 微生物                       MIC μg/mL    MAG    达巴万星 L819金黄色葡萄球菌Smith    0.5-0.5-0.25    ≤0.13-0.06-＜0.03 L819金黄色葡萄球菌Smith 50％血清    1-1-1    1-2-2 L613金黄色葡萄球菌临床分离株    1-0.5-0.5    0.5-0.06-＜0.03 3797金黄色葡萄球菌临床分离株GISA    0.5-0.5    2-2 3817金黄色葡萄球菌临床分离株    0.5    ＜0.03 L147表皮葡萄球菌    0.25-0.13-0.13    ≤0.13-＜0.03＜0.03 L49酿脓链球菌C203    0.5-0.5-0.25    ≤0.13-＜0.03＜0.03 L44肺炎链球菌UC41    1-0.5-0.5    0.25-＜0.03-＜0.03 L602溶血性葡萄球菌临床分离株    ＞32-32    ＞32-＞32 L149粪肠球菌    0.25-0.5-0.5    0.06-0.06 L562粪肠球菌临床分离株    32-＞32-＞32    ＞32-＞32-＞32 L1666屎肠球菌Van-A    ＞32-＞32-＞32    ＞32-＞32-＞32 L102枯草杆菌ATCC    0.13-0.13    ＜0.03-＜0.03 L47大肠埃希菌SKF12140    ＞32-＞32-＞32    ＞32-＞32-＞32 G16440大肠埃希菌iperperm    8-8-16    16-8-16 L79普通变形杆菌    ＞32-＞32-＞32    ＞32-＞32-＞32 L4铜绿假单胞菌ATCC10145    ＞32-＞32-＞32    ＞32-＞32-＞32 L145白色念珠菌SKF2270    ＞32-＞32-＞32    ＞32-＞32-＞32

[00154]最终药物物质中的其它修饰源自发酵过程，随后的化学步骤，或干燥步骤。异B₀(RRT 0.76)是达巴万星B₀的非对映异构体，它是由达巴万星核心结构内不稳定质子的差向异构化引起的。它在前体A-40926与碱的脱乙酰化过程中产生，形成A-40,926的非对映异构体。该非对映异构体随后在后续的化学修饰步骤中转变成异B₀。异B₀在HPLC释放法中很好拆分，是API中检测到的唯一立体异构体。实验室数据已经证明了异B₀不在将酯形式(MA-A-1)转变成达巴万星的碱性水解过程中形成。已经用NMR和MS表征了异B₀，并且已经证实了它在体内可与达巴万星B₀相比的生物学活性。

[00155]达巴万星组合物中的异B₀水平低于约3.5％，可选地低于约3.0％，可选地低于约2.5％，可选地低于约2.0％，可选地低于约1.5％，可选地低于约1.0％，可选地低于约0.5％，可选地低于约0.4％，可选地低于约0.3％，可选地低于约0.2％，或可选地低于约0.1％。

[00156]达巴万星组合物中的异B₀水平可可选地为约0.5％-约3.0％，可选地约0.5％-约2.8％，可选地约0.5％-约2.5％，可选地约0.5％-约2.3％，可选地约0.5％-约2.0％，可选地约0.5％-约1.8％，可选地约0.5％-约1.5％，可选地约0.5％-约1.3％，或可选地约0.5％-约1.0％，或可选地约0.1％-约0.5％。

[00157]达巴万星组合物中的异B₀水平可选地不低于约1.0％，可选地不低于约1.5％，可选地不低于约2.0％，可选地不低于约2.5％，可选地不低于约3.0％，可选地不低于约3.5％，可选地不低于约4.0％，可选地不低于约4.5％，或可选地不低于约5.0％。

[00158]认为达巴万星通过结合肽聚糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸-终末前体来抑制细菌细胞壁的生物合成。达巴万星的二聚体或更高阶的多聚体通过亲脂侧链与细菌的细胞质膜相互作用可具有进一步的抗菌特性。参见例如Malabarba和Ciabatti等人(2001)CurrentMedicinal Chemistry 8：1759-1773。对达巴万星多聚体的进一步研究可在2003年11月4日提交的名为″治疗细菌感染的达巴万星组合物″的代理人案卷号为第34231-20052.00号的美国系列第10/714,166号中找到，其公开内容由此被全文引入本文作为参考。

[00159]在体外，非临床和临床数据表明达巴万星有益于治疗由MRSA和CoNS和所有链球菌和非VanA肠球菌(包括对万古霉素不太敏感或具有耐药性的VanB和VanC表型)所引起的严重革兰氏阳性感染。

[00160]达巴万星在体外对于抗葡萄球菌(包括一些耐替考拉宁的菌株)比替考拉宁和万古霉素更具活性。达巴万星对于抗链球菌(包括耐青霉素的菌株)比替考拉宁或万古霉素具有更好的活性。达巴万星在体外和体内对于抗多种革兰氏阳性菌(包括大多数耐药菌株)均具有活性。

[00161]达巴万星通常作为达巴万星组合物给个体施用。当用在本文中时，术语″达巴万星组合物″或″达巴万星制剂″指的是组合物，通常是包含上述达巴万星和一种或多种其它非达巴万星组分的药物组合物，所述非达巴万星组分例如是药学可接受的载体、稳定剂、缓冲剂或其它类似组分。

[00162]如实施例1中所示，达巴万星以1周的剂量给药间隔是有效的。因此，达巴万星相对于其它治疗选项的优点在于基于每周一次施用该抗生素的能力，从而使患者依从性最大化，并潜在地将胃肠外抗生素给药的住院需求最小化，或缩短其住院期。频率更低的给药通常允许进行门诊治疗，因此降低治疗费用。如实施例1中进一步所示，在施用第一剂量后约1周达巴万星的第二剂量意外地提供治疗功效上的显著改进，其中，第二剂量约为第一剂量的一半。

使用方法

[00163]先前已经报道了达巴万星的各种给药方案，包括单剂量和多给药方案。Leighton等人报道了最佳剂量比(负荷剂量(LD)/维持剂量(MD))为10∶1的多剂量给药。在该研究中，剂量按比例上升至1120mg单剂量(SD)和多剂量方案直至500mg BID第1天，接着每天100mg，连续6天。Leighton等人″Dalbavancin：Phase I Single andMultiple-Dose Placebo Controlled Intravenous Safety，Pharmacokinetic Study in  Healthy Volunteers，″41^st ICAACAbstracts，Chicago，IL，September 22-25 2001，Abstract No.951，p.25。

[00164]Leighton等人还描述了其它单剂量和多剂量给药。在单剂量研究中，报道剂量经由一系列140mg、220mg、350mg、500mg、630mg、840mg和1120mg按比例上升。在多剂量阶段，给药由负荷剂量组成，作为两个相等剂量以12小时为间隔施用，接着是维持剂量。起始给药方案是150mg BID的负荷剂量，接着是30mg每天的维持剂量，共6天。剂量按比例上升如下进行：200mg BID/40mg、300mg BID/60mg、400mg BID/80mg和500mg BID/100mg。Leighton等人″Dalbavancin：Phase I Single and Multiple-dose PlaceboControlled Intravenous Safe Pharmacokinetic Study in HealthyVolunteers.″41^st ICAAC，Chicago，IL，December 2001，Poster No.951。

[00165]White等人报道了单次0.5小时静脉内输注70mg、140mg、220mg或360mg的给药方案。多给药方案包括每天给药70mg，共7天。White等人″V-Glycopeptide：Phase 1 Single andMultiple-Dose Placebo Controlled Intravenous Safety，Pharmacokinetic，and Pharmacodynamic Study in HealthySubjects.″40^th ICAAC，Toronto，Canada，September 17-20，2000，Poster No.2196和第2196号摘要。所有上述参考文献由此特别被全文引入作为参考。

[00166]提供了向需要治疗细菌感染的个体施用达巴万星的新方法。治疗可以包括预防、治疗或治愈。该方法包括以治疗或预防有效量施用一个或多个单位剂量的达巴万星。

[00167]当用在本文中时，″治疗有效量″指的是将提供所要治疗结果(例如减少或消除细菌感染)的达巴万星的量。治疗有效量可以一个或多个剂量给药。″预防有效量″指的是当给易患和/或例如由于医疗操作或住院或暴露于患有细菌感染的个体而可能染上细菌感染的个体时，足以防止未来细菌感染或减轻其严重程度的达巴万星的量。达巴万星通常在药学可接受的载体中给药。

[00168]达巴万星通常作为易溶于水的盐酸盐提供。

[00169]典型地，达巴万星作为达巴万星制剂中的″单位剂量″给药，该制剂包括当给个体施用时，其量足以提供治疗或预防有效的达巴万星血浆水平持续数天(通常至少约5天、1周或10天)的达巴万星。

[00170]当用在本文中时，″个体″指的是脊椎动物，通常指哺乳动物，经常指人。

[00171]尽管认为MAG比其它同系物具有更短的半衰期，但上述达巴万星的所有同系物在血浆中均呈现出了延长的半衰期，通常是9天或更长。长半衰期允许比万古霉素或替考拉宁更长的剂量间隔。如实施例1中所述，与经常用于万古霉素的每天两次给药计划或通常用于替考拉宁的每天一次的给药计划相比，达巴万星的每周一次给药即可有效控制细菌感染。尤其就改进的便利性和患者对治疗方案的依从性而言，以较低频率施用达巴万星可提供优于万古霉素和替考拉宁的显著治疗优点。可以比其它可用的治疗选项要低的给药频率施用异常高的剂量(即，导致异常高的和持久的血清水平)。因为在实现较低频率给药所需的浓度下，达巴万星在体内呈现出了最小的不良效果(证明了大的药物窗)，并且进一步因为达巴万星血液水平在整个治疗方案中维持在最低杀菌水平以上(证明了延长的达巴万星血浆半衰期)，因此可用于达巴万星的新给药方案可提高功效。延长的血清半衰期与大药物窗的组合允许以较低频率施用达巴万星。

[00172]另外，优选将达巴万星与抑制一种或多种达巴万星组分降解的稳定剂一起配制。在一个优选实施方案中，达巴万星以1∶2重量比的甘露醇：达巴万星配制。在另一个优选实施方案中，达巴万星以1∶1∶4重量比的甘露醇：乳糖：达巴万星配制。

[00173]在一些实施方案中，以可使治疗有效(即杀菌)的药物血浆水平持续若干天(经常是至少约5-约10天，经常是至少约1周)的剂量施用达巴万星制剂。一般而言，维持血浆中的达巴万星在约4mg/l的最小杀菌浓度或以上持续至少5天。达巴万星经常维持在至少约5mg/l、经常至少约10mg/l、经常至少约20mg/l、经常至少约30mg/l、经常至少约40mg/l的血浆水平持续至少5天，常持续至少约1周或更长时间。达巴万星血浆水平可以本领域公知的方法测定，例如液相色谱法、质谱法或微生物学生物检定。在实施例5中提供一种用于定量血浆中达巴万星的方法的实施例。

[00174]达巴万星血浆浓度水平的上限通常是由抑制所治疗患者群中不可接受的不良效果的剂量来规定。

[00175]达巴万星组合物可以单剂量或以多剂量施用。当作为单剂量施用时，优选将达巴万星组合物制成含有足量达巴万星以实现体内杀菌活性持续至少5天，优选至少7天，且更优选至少10天。

[00176]当采用多剂量时，可每周一次施用达巴万星，持续2周或2周以上。在一个实施方案中，以至少2个剂量，经常间隔约5-约10天的2个剂量，更经常是每周一次持续2周，施用达巴万星。如实施例1中所示，所述给药方案提供了优于常规抗生素治疗方案的显著优点。

[00177]达巴万星组合物也可间隔两天或多天或间隔至少一周以多剂量施用，或以一个或多个两周一次的剂量施用。在一些实施方案中，每周一次施用达巴万星组合物，随后两周一次或每月一次。在一些实施方案中，达巴万星每隔一周施用一次，持续2、3、4、5、6周或更长时间。

[00178]最有利地，因为使用了更高的较低频率剂量，所以不需要每天给药。例如，单剂量或多剂量可为约0.1-约5克。可施用约0.1-约4克例如约3克的单剂量以用于治疗各种感染。当施用多剂量时，例如每周一次，各剂量可在例如约0.25-约5.0克的范围内。

[00179]就其中施用单剂量治疗感染的实施方案而言，剂量可以是例如约0.1-约5克、或约0.5-约4克、或约1-约3.5克、或约2-约3克，例如约3克。在一些实施方案中，施用约1、1.5、2、2.5或3克的单剂量以治疗细菌感染。就其中施用单剂量进行预防的实施方案而言，剂量例如可为约0.1-约3克、或约0.1-约1克，例如约0.5或约0.25克。

[00180]在包括多剂量的给药方案中，单个剂量可相同或不同。在一些实施方案中，施用比一个或多个后续剂量更高的第一剂量，即，例如约1.5-10倍更高，在某些情况下9倍更高，在某些情况下8倍更高，在某些情况下7倍更高，在某些情况下6倍更高，在某些情况下5倍更高，在某些情况下4倍更高，在某些情况下3倍更高，在某些情况下2倍更高。例如，第一剂量可为约0.5克-约5克，且第二剂量为约0.25克-约2.5克，第一剂量可为约0.8-约2g，且第二剂量为约0.4-约1克，或第一剂量可为约0.4-约3g，且第二剂量为约0.2-1.5g。

[00181]在一些实施方案中，施用至少2个剂量，其中第一剂量包括约两倍于后续剂量的达巴万星。在一个实施方案中，第一剂量包括约1克达巴万星，且后续剂量包括约0.5克。在另一个实施方案中，第一剂量包括约0.5克达巴万星，且后续剂量包括约0.25克。

[00182]在一些实施方案中，间隔两天或两天以上或间隔至少约一周以相同或不同量的2个剂量施用达巴万星组合物。经常间隔约5-约10天，更经常间隔约1周施用两个约0.2-约1.5克的达巴万星剂量。在一个实施方案中，间隔约1周施用约1克达巴万星的第一剂量和约0.5克达巴万星的第二剂量。

[00183]在多剂量给药方案中，剂量之间的时间例如可在约5-约10天的范围内，经常是约一周，可选地约2周。给药频率可为例如每周两个剂量或每周多个剂量。给药间隔或剂量之间的时间例如可为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25天或更多天中的任何一个。所给的剂量数可以是例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个剂量，初始剂量之后的各剂量是在所选剂量间隔以后施用。

[00184]在多个剂量给药方案中，达巴万星的″谷水平″或在达巴万星的第一剂量之后并就在施用第二剂量之前血浆中的达巴万星水平为至少约4mg/l。优选地，在诸如约一周的给药间隔末的谷水平优选为至少约20mg/l，更优选至少约30mg/l，甚至更优选至少约40mg/l。

[00185]达巴万星可以胃肠外给药，例如肌内(i.m.)、静脉内(i.v.)(快速推注或缓慢输注)、皮下(s.c)、腹膜内(i.p.)或鞘内(i.t.)。给药计划与所施用的实际剂量可根据诸如感染性质与严重程度、患者的年龄、体重、全身健康状况和特定患者对达巴万星的耐受性而有所变化，但这对于健康专家而言是可确定的。在一个实施方案中，在达巴万星的1克静脉内给药一周以后，随后给予0.5克静脉内剂量。

[00186]可以以控制速率将药物施用和传递给患者，例如静脉内，以便血液中的浓度不会增加太快或者发生沉淀。在一些实施方案中，以适当速率施用达巴万星，以便药物与血流中的内源蛋白形成复合物。不受限于特定理论，相信诸如人血清白蛋白的内源蛋白可在体内与一个或两个达巴万星同系物单体分子形成复合物。当存在足量达巴万星时，相信至多两个达巴万星同系物分子将结合到内源蛋白上，并且进一步相信通过在两个不同结合位点结合独立的达巴万星同系物分子来形成此复合物。可选地，二聚体达巴万星结合到内源蛋白上的单个结合位点上也是可能的。对以上讨论的达巴万星-内源蛋白复合物的进一步详细研究可见于2003年11月4日提交的题为″COMPOSITI0NS ANDMETHODS FOR TREATING BACTERIAL INFECTI0NS WITHPROTEIN-DALBAVANCIN COMPLEXES″的代理人案卷号第34231-20053.00号的美国系列第10/713,924号中，其公开内容由此被全文引入作为参考。

[00187]输注持续时间可以是例如约1分钟-约2小时，或可选地，约15分钟-约2小时。例如，可使用约30分钟的输注持续时间，其中剂量是约0.5-约1克。在控制速率条件下进行静脉内给药可产生比在体外生理pH下在溶液相中可达到的浓度远远过量的体内达巴万星浓度。尽管不希望受限于理论，但此可归因于达巴万星与诸如血清白蛋白的内源蛋白形成复合物，与体外研究相比，其可增加达巴万星在血浆中的溶解度。

[00188]在体外或离体形成达巴万星复合物可允许更快的给药，例如至少约1分钟、至少约10分钟或至少约20分钟。通过将人血清白蛋白和/或另一种内源蛋白与达巴万星混合从而在体外或离体形成复合物可获得所述复合物，并且接着将此复合物给所治疗的患者施用。可选地，人血清白蛋白或其它内源蛋白可从自体来源获得，或从经修饰以含有所述蛋白的基因的微生物通过表达来获得。

[00189]所施用的达巴万星的量可以是本文公开的任何剂量。通常选择达巴万星剂量以便药物以治疗或预防有效(即杀菌)的血浆水平持续延长时间，经常是至少5天，更经常是约一周或更长时间。优选施用可产生并维持杀菌浓度至少约一周(或约5-约10天)的达巴万星剂量。杀菌浓度定义为经24小时杀死至少99％体外实验最初存在的细菌所需要的达巴万星的浓度。血浆达巴万星的最小杀菌浓度通常是约4mg/l。

[00190]可治疗的适应症的实例包括复发的和不复发的皮肤和软组织感染(SSTI)(也称为复杂和不复杂的皮肤和皮肤结构感染(SSSI))、血流感染(BSI)、与导管相关的血流感染(CRBSI)、骨髓炎、假体关节感染、外科预防、心内膜炎、医院或社区获得性肺炎、肺炎球菌性肺炎、发热中性粒细胞减少症的经验疗法、关节腔感染和装置感染(例如起搏器和内部心脏除颤器)。可治疗革兰氏阳性或耐抗生素的细菌感染，例如葡萄球菌、链球菌、奈瑟菌属或梭菌属感染，尤其是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、酿脓链球菌、A群和C群链球菌、淋病奈瑟菌或艰难梭菌。

[00191]本发明提供了治疗皮肤和软组织感染(SSTI)的方法。可受益于此治疗的患者可具有深部或表浅感染。SSTI可涉及更深的软组织和/或需要重大外科手术干预，例如严重脓肿、感染的溃疡、重度烧伤或深度和大面积蜂窝织炎。还可治疗受感染的外科伤口。达巴万星治疗皮肤的功效是意外和令人惊奇的结果，因为达巴万星在体内与蛋白复合(参见实施例5)。

[00192]皮肤和皮肤结构感染的临床表现可从轻度毛囊炎到严重坏死性筋膜炎而有所不同。获得模式也可随社区获得性皮肤和皮肤结构感染而有所变化，所述感染之前经常是由职业暴露或娱乐活动引起的损伤并通常与较大的病原体多样性相关。医院获得性皮肤和皮肤结构感染通常与外科手术、褥疮发生和导管插入有关。手术后感染是第三常见的医院感染，并占向全国院内感染监测系统(NNIS)报道的所有医院感染的17％。最常见的感染源是患者的内源菌群。金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性的葡萄球菌和肠球菌属是最经常从SSTI分离出的病原体。

[00193]SSTI感染的症状可包括红斑、触痛或疼痛、发热或局部温热、排液或淌液、肿胀或硬化、发红或波动。可得益于以本发明方法进行治疗的患者包括具有深部或复杂感染或需要外科手术干预的感染的患者，或具有潜在糖尿病或外周血管疾病的患者。所述感染经常是由革兰氏阳性菌引起的，例如葡萄球菌或链球菌，例如金黄色葡萄球菌或酿脓链球菌。治疗皮肤或软组织细菌感染的方法包括以一定量并根据上述给药方案将治疗有效量的达巴万星对需要治疗的个体给药。在一些实施方案中，分两个剂量静脉内施用达巴万星组合物，经常是间隔约5-约10天，更经常是间隔约1周。在一些实施方案中，第一剂量包括至少两倍于第二剂量的达巴万星。在一个实施方案中，第一剂量是约1000mg，且第二剂量是约500mg。在另一个实施方案中，第一剂量可为约1200mg，且第二剂量可为约600mg。

[00194]本发明还提供了用于预防性防止细菌感染发生的方法，例如是由金黄色葡萄球菌、或由奈瑟菌属或梭菌属细菌引起的感染。在本发明的预防方法中，将预防有效量的达巴万星给例如通过医疗操作可能对细菌感染敏感的个体施用。达巴万星经常是以足以提供预防有效的血浆水平持续至少约1天、至少约3天、至少约5天、或至少约一周或更长时间的量来施用。达巴万星组合物可在外科手术之前或之后作为抗感染的预防步骤例如胃肠外施用，例如肌内(i.m.)、静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)、皮下(s.c)或鞘内(i.t.)注射。可在诸如外科手术的侵入性医疗操作或在诸如医院的医疗护理机构中住院之前或之后即刻、之前或之后一天或多天或约一周、或期间施用达巴万星组合物以预防感染。预防方法可用于其中个体可能或很可能染上细菌感染的任何情形中，包括其中个体已经暴露于或很可能暴露于细菌感染的个体的情形。就预防方法而言，达巴万星组合物可作为单剂量施用，或作为两个或两个以上相同或不同量的剂量间隔数天到约一周施用。在一个实施方案中，达巴万星组合物可在插入静脉内导管之前或同时施用，以预防血流相关的感染。

[00195]就预防方法而言，达巴万星组合物可根据上述任何给药方案以单剂量或多剂量施用。达巴万星组合物经常是作为包含约0.1-约3克、或约0.1-约1克，例如约0.25克或约0.5克的单剂量施用。在一个实施方案中，经过约2分钟-约1小时(例如约30分钟)的时限静脉内施用约0.25克的单剂量。在另一个实施方案中，与另一药物(例如抗生素)治疗的施用同时经静脉内施用达巴万星组合物。

[00196]在任何上述治疗或预防方法中，达巴万星组合物可与至少一种其它抗生素同时或相继施用。在一些实施方案中，除达巴万星之外还施用至少一种其它抗生素，它对一种或多种达巴万星不能有效对抗的革兰氏阴性细菌种类和/或革兰氏阳性菌株有效(例如杀菌)。在一些实施方案中，达巴万星和有效对抗(例如杀菌)至少一种革兰氏阴性细菌种类的至少一种抗生素是作为达巴万星组合物中的混合物施用的。

药代动力学

[00197]使用小鼠、大鼠、家兔、狗和迷你猪进行达巴万星的动物研究。

[00198]使用各种验证方法来定量达巴万星。达巴万星API由5个同系物(A₀、A₁、B₀、B₁和B₂)组成。用基于抗菌活性的方法测量所有微生物学活性的达巴万星组分。用色谱法，测量主要组分B₀联合组分B₁(总共占90％-95％的达巴万星)，以总达巴万星的方式报道结果。液体闪烁计数(LSC)和液相色谱法联合放射化学检测(LC/RC)可检测施用了放射标记药物的动物血浆、尿和粪便中的达巴万星和代谢产物。每当定量了施用了临床相关剂量的动物血浆中的达巴万星和药物衍生的放射性时，药物和放射性的浓度-时间曲线可叠加。这表明，实际上血浆中所有药物衍生的放射性都是完整的药物。

[00199]在IV剂量给药以后，药物广泛分布到整个体内，到所有检测的器官和组织中。达巴万星渗透到大鼠和迷你猪皮肤内。达巴万星动力学表现方式在各个物种中可预测。发现血浆清除率(CL)与物种体重成比例。另外，达巴万星穿过大鼠胎盘，且在胎儿大鼠血浆中出现。

[00200]达巴万星不是肝细胞色素P450同工酶的底物、抑制剂、或诱导物。该药物在体外不被大鼠、狗或人肝微粒体；大鼠、狗或人肝细胞；或人肾微粒体代谢。达巴万星不影响分离出的人肝微粒体对标记底物代谢。达巴万星对大鼠给药不诱导任何P450活性。

[00201]在多个物种中观察到了类似的达巴万星代谢产物谱。已经在大鼠、狗和人尿中观察到了两(2)种代谢产物(OH-达巴万星和MAG)。这两种代谢产物在人血浆中都是不能检出的或接近于检出限(＜0.4mg/L)，比达巴万星的抗菌活性小，只稍微有助于(如果有一些的话)体内活性。用临床相关剂量，在动物血浆中普遍观察到了类似的结果。

[00202]该药物具有双重排泄途径(肾脏和粪便)，作为完整的药物和代谢产物排泄。达巴万星排泄在大鼠、狗和人的尿和粪便中。大部分剂量都排泄成尿中的完整药物。也在尿中发现了OH-达巴万星和MAG。在动物粪便中发现了一些完整的药物连同痕量代谢产物。人粪便包含微生物学活性的达巴万星组分。达巴万星也排泄到大鼠乳汁中。因此，达巴万星经由代谢、尿排泄和粪便排泄从身体消除。这将预期，根据患者的人口统计学，只需要极小(如果有任何的话)的剂量调整。令人惊奇的是，患有严重肾衰竭的患者(肌酸酐清除率CL_CR低于30mL/min)比正常肾功能患者(肌酸酐清除率CL_CR大于80mL/min)达到更高的水平。在第1天接受1g剂量的重度患者似乎与在第1天接受100mg和在第8天接受500mg的正常患者的水平相似。

药物组合物

[00203]本发明提供了为根据上述方法施用达巴万星而配制的药物组合物。本发明的药物组合物可为达巴万星的单位剂量形式，它包括当组合物给个体施用时，足以提供治疗或预防有效的达巴万星血浆水平持续数天(经常是至少约3天、至少约5天、或至少约一周或更长时间)的量的达巴万星，和药学可接受的载体。一般而言，治疗或预防有效的达巴万星血浆水平是至少约4mg每升血浆。达巴万星血浆水平可以通过本领域公知方法例如上述方法测量。

[00204]达巴万星可任选为药学可接受的形式用于给个体施用，任选为药学可接受的无毒性的盐。

[00205]达巴万星的适当的盐的实例包括通过与有机和无机酸发生标准反应所形成的盐，所述酸是例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、琥珀酸、柠檬酸、抗坏血酸、乳酸、马来酸、谷氨酸、樟脑酸、戊二酸、乙醇酸、邻苯二甲酸、酒石酸、月桂酸、硬脂酸、水杨酸、甲磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸等酸。可与达巴万星形成盐的碱的代表性实例包括碱金属或碱土金属氢氧化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁和氢氧化钡；氨和脂肪族、脂环族或芳族有机胺，例如甲胺、二甲胺、二乙胺、乙醇胺和甲基吡啶(参见例如美国专利第5,606,036号)。

[00206]在一些实施方案中，提供适合于胃肠外给药例如静脉内注射的药学可接受的达巴万星含水制剂。为了制备该含水制剂，可使用本领域公知的方法，且可使用本领域通常使用的任何药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或其它添加剂。在一个实施方案中，用于静脉内注射的药学可接受的含水制剂包括5％右旋糖。

[00207]达巴万星可胃肠外给药，即，给药途径是在一层或多层皮肤或粘膜之下或穿过它们的注射。由于该途径包围了这些人体高度有效的防护屏障，必须达到不含微生物和不溶性颗粒的特别纯的胃肠外剂型。用于制备该剂型的方法必须体现药品生产质量管理规范，它将在无菌性和疗效方面生产和维持所需质量的产品。另外，当在室温下保存实用剂型和便利剂型时，该剂型应当是稳定的。

[00208]有通常可用于将大批药物原料转变成适合于胃肠外给药剂型的数种常规方法。这些方法一般列在Remington′sPharmaceutical Sciences，第十八版，1990(″Remington″)中。

蒸汽灭菌

[00209]USP将蒸汽灭菌定义为在高压容器中在最低121℃下采用饱和高压蒸汽至少15分钟。固体形式的药物可放在高压灭菌器中进行蒸汽灭菌。液体形式的药物可直接放在高压灭菌器中，或包含在密封容器中并放在高压灭菌器进行相同类型的蒸汽灭菌。

干热灭菌

[00210]在干热灭菌中，大批药物原料在相对低湿度下经受高温。由于干热比湿热对于灭菌的功效低，因此需要比蒸汽灭菌中所用的暴露时间更长和温度更高。目标是通过氧化过程杀死微生物。虽然建立确切的且正确的时间-温度循环并不是常规的，然而所用的典型温度是140-170℃，1到3小时。

辐射灭菌

[00211]辐射灭菌可利用电磁辐射或粒子辐射。包含光子能量的电磁辐射包括紫外线、γ、x-射线和宇宙辐射。从放射性物质例如钴-60或铯-137发射出的γ辐射是最常使用的电磁灭菌源。最广泛用于灭菌的粒子辐射是β粒子或电子辐射。

无菌过滤

[00212]无菌过滤从液体流中除去但不破坏微生物的方法。该过滤是为对其它类型灭菌方法不稳定的溶液所选用的方法。

无菌冷冻干燥(冻干)

[00213]该方法采用无菌过滤，随后步骤是通过使冷冻溶液升华而从溶液中分离经灭菌的药物，留下药物物质。该方法通常包括下列步骤：

1)将大量药物溶于水溶液

2)通过膜过滤使溶液灭菌

3)在开口的、预先灭菌的小瓶中装入经灭菌的溶液，并放在冻干室内

4)冷冻小瓶中的溶液

5)排出室内空气，以使冰在低温下升华

6)将温度升高至室温或更高，以去除残留水分。

添加无菌水(蒸气)的无菌冷冻干燥(冻干)

[00214]该方法采用无菌过滤，随后步骤是通过冷冻干燥(冻干)而从溶液中分离无菌药物，并加入蒸气形式的无菌水。

无菌沉淀

[00215]该方法采用无菌过滤，随后步骤是从溶液中沉淀出无菌药物。更详细地，首先将大量药物以升高温度(高于室温)溶于水中，然后在无菌状态下过滤加热的溶液，以除去任何微生物，然后将过滤的溶液冷却以从溶液中沉淀出药物。然后通过过滤或离心分离从溶液中分离出沉淀的药物，并在无菌状态下通过粉末填充填装到容器内。为了使粉末填充可以实现，药物必须具有良好的流动性——粉末通常应是颗粒状的、非晶体的、且具有均匀的粒度。

[00216]用于胃肠外给药的药物组合物包括达巴万星和生理可接受的稀释剂，例如注射用无菌或去离子水、生理盐水、5％右旋糖、水混溶性溶剂(例如乙醇、聚乙二醇、丙二醇等)、非水性媒剂(例如油，如玉米油、棉籽油、花生油和芝麻油)或其它常用稀释剂。制剂可另外包括例如聚乙二醇、聚丙二醇或其它已知增溶剂的增溶剂、用于稳定溶液的缓冲剂(例如柠檬酸盐、乙酸盐和磷酸盐)和/或抗氧化剂(例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠)(参见例如美国专利第6,143,739号)。其它合适的药学载体及其制剂描述在E.W.Martin的″Remington′sPharmaceutical Sciences″中。如现有技术中已知的，还可将本发明的药物制剂制备成含有可接受水平的颗粒(例如无粒子)和制备成无热原(例如符合美国药典中的可注射物的要求)。

[00217]在一个实施方案中，通过将经干燥(例如冻干)的达巴万星剂量溶解于一定量的体积足以溶解冻干物的水中并优选地溶解于去离子水中来提供药物组合物，其经常含有稳定剂或稳定剂混合物。足以进行溶解的水的量通常是大约10mL并且达巴万星溶液的所得pH值高于3.0并且是约3.5到4.5。该溶液进一步稀释在第二稀释剂中，第二稀释剂通常包含5％右旋糖，例如用于静脉内给药的滴液袋中所含的量，将达巴万星溶液的pH升高至约5-5.5。在另一个实施方案中，滴液袋中达巴万星溶液的pH是约4.5。第二稀释剂可为注射用去离子和无菌水。在一个实施方案中，含水稀释剂是5％右旋糖。

[00218]可在其中保持达巴万星的杀菌有效性的条件下在无菌小瓶中构成用于胃肠外使用的药物组合物，其含有上述治疗或预防有效量的一个或多个单位剂量的达巴万星，任选包括赋形剂。组合物可呈干(例如冻干)粉形式。在使用前，粉末可用生理可接受的稀释剂重构，并通过注射器抽出溶液以给患者施用。上述药物制剂可通过任何可接受的方式灭菌，所述方式例如包括电子束或γ灭菌法或通过无菌过滤。

[00219]用于胃肠外给药的典型制剂可包括达巴万星，其浓度例如是每毫升最终制剂中约0.1-约100mg、约0.5-约50mg、约1-约10mg、或约2-约4mg达巴万星。

[00220]在一些实施方案中，本发明的药物组合物包括达巴万星和一种或多种另外的抗生素的混合物。优选地，混合物中的至少一种非达巴万星抗生素有效对抗(例如杀菌)一种或多种革兰氏阴性菌类(诸如阿苏胺)和/或有效对抗(例如杀菌)达巴万星所不能有效对抗的一种或多种革兰氏阳性菌株(诸如利奈唑胺或达托霉素)。混合物也可包括上述药学可接受的载体。

[00221]在一些实施方案中，本发明的药物组合物包括一种或多种抑制一种或多种达巴万星组分降解为活性较低或无活性的材料、同系物或相关物质(例如MAG)的稳定化物质。当用在本文中时，“稳定化物质”或“物质”指的是稳定组合物中一种或多种达巴万星组成组分(例如B₀)的水平的稳定剂。“稳定有效量”指的是足以提高达巴万星组合物的一种或多种组分的长期稳定性的稳定剂的量。在一些实施方案中，可通过两种或两种以上稳定化物质的混合物提供稳定有效量，其中单独各物质不是以足以提供稳定化效果的量存在。

[00222]稳定剂的实例例如包括非离子物质，如糖，例如单、二或多糖或其衍生物；糖醇；或多元醇。所述稳定化物质例如包括甘露醇、乳糖、蔗糖、山梨醇、甘油、纤维素、海藻糖、麦芽糖、棉子糖、右旋糖、低分子量和高分子量葡聚糖或其混合物。

[00223]除了糖，稳定剂也可为氨基酸。氨基酸稳定剂包括天然和合成氨基酸和氨基酸衍生物。在优选实施方案中，氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和天冬酰胺。稳定剂也可为环糊精、环状酰胺例如烟酰胺和苯甲酰胺、水杨酸及其邻位-、间位-、对位-取代的羟基酸和酯。

[00224]除了添加稳定剂，还发现调节化合物pH可提高组合物稳定性。提高稳定性或使稳定性最大化的组合物的特定pH取决于所添加的稳定剂的类型和量。pH可优选约1-7，更优选2-6，更优选3-5，更优选4-5，更优选大约4.5。

[00225]在一个实施方案中，药物组合物包括重量比是1∶2的甘露醇∶达巴万星。在另一个实施方案中，药物组合物包括重量比是1∶1∶4的甘露醇∶乳糖∶达巴万星。令人吃惊的是，已发现甘露醇与乳糖的组合比单独的任一种物质提供更好的稳定化效果。本发明的药物组合物的pH值例如经常是约3到约5，例如约3.5或约4.5。

[00226]在一些实施方案中，可使用一种或多种方法减少MAG形成。例如，可在稳定化物质如甘露醇和/或乳糖的存在下冷冻干燥达巴万星用于减少形成的MAG的量。

[00227]达巴万星组合物的储存经常是在低于环境温度的温度下(例如在约5℃下)，以提高稳定性。

干燥

[00228]从高分子量天然产物中去除丙酮可以是非常困难的，因为它可以和高分子量天然产物形成加合物。可以在水的存在下完成除丙酮，水在固体产物中取代丙酮。而且，由于可能形成MAG，所以干燥达巴万星的过程更为精细，其取决于pH、温度、真空和时间。为了使MAG的形成最小化，并加速干燥过程，在干燥过程中将低内毒素水加入或喷在产品上以取代丙酮。随后再用数小时干燥减少过量的水。

[00229]在真空下进行干燥(内部温度＜25℃)。当大部分丙酮已经从产品中除去时，将约20％(w/w)的低内毒素水喷雾在固体产品上，并在相同条件下继续干燥。为了追踪干燥过程，进行丙酮和KarlFischer(K.F.)分析，并将另外的水喷雾在固体产品上，直至残留丙酮低于1.5％。

研究25

在20-30℃下在50毫巴下干燥

[00230]首先在实验室中使用旋转蒸发器模拟该过程。在30℃下不加水干燥第027批次达巴万星，得到含6.4％MAG和3.2％丙酮的产品。将126g这种干燥的达巴万星批次(第027批次，HCl/达巴万星比为1.7mols/mol)装入1L圆底烧瓶，每2小时用25mL水对该固体进行喷雾，维持水浴温度为20-30℃，真空度为50毫巴。在特定时间抽取达巴万星样品，并分析丙酮、K.F.和MAG分析。将所得数据报道在表4A中。在该表格中报道的所有MAG百分数是实际量和起始量之间的差异。

表4A

时间hT℃P毫巴水％丙酮％ΔMAG％喷雾的水％0--1.63.2-20220-25508.32.8020420-255015.61.9020620-255023.30.90-8305022.60.56--10305021.80.430-12305020.80.220-

在相同条件下另外干燥数小时，将含水量降低至低于15％，完成该实验。

在30℃下在10毫巴下干燥

[00231]使用前述实验相同的装置，在30℃下和在10毫巴下干燥125g第027批次达巴万星，MAG6.4％(HPLC面积％)24小时。将所得结果报道在表4B中。

表4B

时间hT℃  P  毫巴  KF  ％  丙酮  ％  ΔMAG  ％  喷雾的水  ％0-  -  1.6  3.21  -  20230  10  13.0  1.09  0  20430  10  15.08  1.18  0  20630  10  16.8  0.02  0  -2430  10  8.89  0.02  0

[00232]从这些实验室实验可以得出结论，通过向固体产品添加水可以简化干燥过程。因为达巴万星降解成MAG是水解步骤，人们可以预期水的增加将增大降解过程，因此这些结果是出人意料的。以这种方式，丙酮很快就从产品中去除了，从而减少了干燥时间，并避免了另外的MAG的形成。此外可以观察到(表4B)，较低的残余压力显著缩减了干燥过程。还令人惊奇的是，在大量水的存在下降低了丙酮水平。

在转筒式干燥机中干燥达巴万星

[00233]将湿达巴万星放入转筒式干燥机DR 216，并在29-32℃(外部温度)以最大真空度(＜50毫巴)干燥。开始时，内部温度从30℃降低至17-18℃，然后，当温度开始提高时，对产品取样进行分析(水17.2％，丙酮9.5％)。在这时，将低内毒素水(约20％，w/w)喷雾到干燥机中，喷雾在搅拌的产品上，并按时再取样进行分析。2小时以后，再次喷雾低内毒素水直至丙酮的量低于0.5％(表4C)。

表4C

外部温度29-30℃                                                  压力＝10-15毫巴

时间h重量Kg内部温度所加的水mL(^*)分析#水％丙酮％MAG面积％019.10.11117.4**218.3**323.520020101917.279.52**4.526.850020020101913.594.100.136.528.150020020101919.600.610.168.528.120020101922.380.130.129.528.520020101919.860.120.1311.521.920020101917.680.090.311529.520020101914.11n.d.0.38

最终重量2592g，分析#200201027：水(K.F.)13.93％，丙酮0.12％，MAG 0.38％。(*)取样后将水喷雾在转筒式干燥机内

在存在水和缺乏水的情况下干燥的比较

[00234]该研究是在缺乏水(第027批次)和在存在水(第027/R批次)的情况下对第027批次达巴万星和第027/R批次达巴万星的干燥过程之间进行比较。使用转筒式干燥机(DR 216)，在25-35℃(内部温度)下，真空干燥第027批次达巴万星(14.6Kg)和第027/R批次达巴万星(8.3Kg)。不加水干燥第027批次。相反，将四份每份400mL的低内毒素水喷雾到第027/R批次上。在各个干燥过程中，在特定时间对达巴万星取样进行分析。结果报道在表5中。对于第027批次来说，只在干燥过程结束时测定MAG。

表5

Lot 027  Lot 027/R  小时  温度  (℃)  压力  毫巴   KF  (％)  丙酮  (％)   MAG   (％)  温度  (℃)  压力  毫巴  KF  (％)  丙酮  (％)  MAG  (％)  所加的  水(mL)  0  32  280   0.52(*)  30  171  0.22  (°)  2  29  32  3  -  -  23  57  16  6.7  0.23  7  -  -  29  1  7.4  3.94  0.44  400  9  -  -  28.4  2  8  2.6  0.48  400  11  -  -  28  4  10  1.5  0.59  400  12.5  -  -  27  12  13.9  1  0.74  400  15  -  -  27.3  9  12  0.45  0.88  -  17  35  0  5.5  2.9  18  -  -  -  -  27.5  8  11.5  0.26  0.96  -  26  37.8  -  -  -  65  35.7  0  1.6  3.1  n.a.  分析# 200101408  MAG 6.46％  KF 1.63％  丙酮3.14％  分析# 200101944  MAG 1.81％  KF 11.86％  丙酮 0.27％

(^*)分析# 200101392                                                (°)分析# 200101913

全规模生产数据

[00235]下表6是在2002和2004的全规模生产中方法和MAG水平的总结。

表6

生产                  2002                   2004Lot020004/R  020005/R  020006  DA204001 DA2040002 DA2040003％MAG2.3  0.8  1.7    0.4 0.3 0.3

[00236]在2002过程中，达巴万星产品在低于30℃的温度下真空干燥。在不同时间将低内毒素水喷雾在产品上。持续干燥直至丙酮含量低于0.5％。

[00237]在2004过程中，通过离心分离回收达巴万星API，用冷丙酮(0-10℃)洗涤，并真空干燥(内部温度＜25℃)。MAG是达巴万星的主要降解产物，它的形成取决于温度。在干燥处理过程中加入水，以置换丙酮，最终实现丙酮含量低于1.5％(GC)。从表5中显而易见的是，在水的存在下低温干燥导致出乎意料低含量的丙酮(比较Lot027/R中的0.27％和Lot 027中的3.14％)和出乎意料低含量的MAG降解产物(比较Lot 027/R中的1.81％和Lot 027中的6.46％)。

[00238]因此，干燥达巴万星的方法包括向达巴万星产品加入水的步骤，以置换丙酮。加入的水的优选量是假定最终干燥产品的约20％。可选地，水的量可为假定最终干燥产品的约15％，可选地约25％，可选地约30％，可选地约40％，可选地约45％，可选地约50％。

[00239]干燥达巴万星的方法可包括在约100托下，在低于约25℃的温度下不添加任何水，干燥达巴万星产品再约2小时的步骤。然后将低内毒素水喷雾到产品上，然后干燥产品再约2个小时。然后取样并检查丙酮水平。如果该水平高于约1.5％，就将另外的水喷雾在产品上，并再次干燥产品直至丙酮水平低于约1.5％。

制造

[00240]在100,000级(D级)区域中进行所有大量溶液的制造操作。在100级(A级)层流区域中进行无菌填充。

[00241]将适当的制造小瓶装入理论批量体积约80％的注射用水。混合溶液，并将温度维持在15-30℃。加入达巴万星并混合，直至达巴万星溶解。加入至少一种稳定剂到溶液中并混合，直至溶解。加入注射用水，使得溶液达到最终体积，如果需要的话，用0.1N HCl或1.0N NaOH调节pH至适当的pH。通过两层连续的0.2μm灭菌过滤器过滤对大批溶液进行灭菌，装入已灭菌的接受小瓶中。(如果需要的话可以使用预滤器，以帮助过滤器澄明，或减少灭菌过滤器上负载的颗粒)。将溶液无菌罐装入无菌/除热原的I型玻璃小瓶中。将无菌硅化处理过的冻干塞子部分插入冻干位置，并将小瓶转移到冻干室中。

[00242]在有代表性的小瓶上使用热电偶探头监测冻干过程。在-45℃下冷冻小瓶，并持续3小时，在这之后应用真空。将架温调节到-25℃。当所有的热电偶都是-29℃或更高温度时，将架温调节到0℃。当所有的热电偶都是-5℃或更高温度时，将架温调节到+30℃。当所有的热电偶都是+27℃或更高温度时，保持小瓶的温度14±2小时。通过引入无菌氮气将室内压恢复到大气压，该氮气已经通过0.2μm过滤器过滤，然后压扁冻干架密封小瓶。然后从室内取出小瓶，进行铝密封。

[00243]通过适当的方法对所有组分和装置灭菌。洗涤小瓶，并在不低于255℃的温度下，在干热灭菌器中对小瓶灭菌不少于3小时。在123-125℃的温度下，室内压约33psi，对塞子进行蒸气高压灭菌。无菌范围内的停留时间通常是50-60分钟。

[00244]使用″过度杀灭(overkill)″法对蒸气和干热灭菌周期进行灭菌方法的验证。AU灭菌周期提供了充分的致死率，不论天然存在的微生物是什么，都可提供至少10^-6的微生物存活率。以足以提供不低于12log减少的致死率设计所有的周期。干热周期将提供最小3log的内毒素减少。

稳定性研究

[00245]发现达巴万星在冷冻干燥处理过程中分解。在稳定性研究过程中，发现加入稳定剂降低了活性组分B₀分解的量。

[00246]在25℃和40℃下，各种达巴万星冻干制剂随时间的稳定性显示在图1-4中。依据FDA指南，假定在40℃下稳定3到6个月的产品将在室温下稳定2年。图1A、2A、3A和4A显示了达巴万星组分B₀的量降低，它是达巴万星杀菌活性组分之一。如上所讨论，组分B₀也是大多数达巴万星组合物的主要组分之一。图1B、2B、3B和4B显示了MAG的量增加，MAG是活性较低的组分，它被认为是一种或多种其它达巴万星组分的分解产物。表7列出了在稳定性研究中使用的各个制剂的组成，其结果显示在图1-4中。任何这些组合物可用于生产稳定的、无菌的、无颗粒的剂型。

表7.各个达巴万星制剂的组成

组合物  达巴万星  (mg/小瓶)  甘露醇  (mg/小瓶)乳糖(mg/小瓶)  pHA  250  62.5--  3.4B  250--  3.69C  250  62.5--  3.80D  250--  3.01E  250  62.5--  3.01F  250--  4.5G  250  62.5--  4.5H  250  62.5--  5.3I  250  125--  5.0J  250  62.5--  5.0K  250  125--  4.5L  250  62.5--  4.5M  250  62.562.5  4.5N  250  --125  4.5O  250  125--  3.3

[00247]如图1B和2B中所示，在T＝0时，在组合物D中已经存在有显著量的(大于4％)MAG，该组合物包含达巴万星，不含其它非达巴万星组分，它未经pH调节(pH约3.01)，分别在25℃和40℃下。在较高温度下，MAG的形成以大得多的速率增加。在40℃下经过3个月和6个月以后，组合物D分别有21.0％MAG和23.7％MAG(参见图2B)。这暗示着纯达巴万星是高度不稳定的，仅仅冻干达巴万星将导致显著的降解。另外，常规干燥也会导致MAG降解产物的形成。一些达巴万星制剂需要在-20℃下贮存。

[00248]当pH提高时，不加入任何其它的非达巴万星组分，稳定性也会提高。组合物D未经pH调节，其pH为约3.01。组合物B被调节至pH 3.69。组合物F被调节至pH 4.5。如图1A和2A中所示，当pH提高时，随着时间的过去B₀的初始降解较少和总体降解较少。类似地，在图1B和2B中，在两个温度下，在刚开始时和随着时间的过去，在调节至较高pH的组合物中MAG的形成较少。

[00249]甘露醇的加入也显示出显著提高了达巴万星的稳定性。和组合物D相比(它没有调节pH，也不包含甘露醇)，随着时间的过去，因子B₀的降解和MAG的增加也显著降低了。如在组合物E(62.5mg甘露醇，约pH 3.01)中所示，即使没有任何pH调节，在最初的冻干过程中和随着时间的过去，在稳定性方面也有显著提高。在T＝0时，在T＝25℃(参见图1A)和T＝40℃(参见图2A)下，存在大约2％MAG，它少于T＝0时在组合物D中存在的MAG的量的一半。

[00250]当pH提高且甘露醇的量保持恒定时，达巴万星的稳定性也提高了。组合物E、C和G的比较显示，当pH从约3.01提高到3.8到4.5时，达巴万星降解的量也降低了。如图1A和2A中所示，当pH提高时，随着时间的过去有较少的B₀初始降解和较少的全部降解。类似地，在图1B和2B中，在刚开始时和随着时间的过去，在调节至较高pH的组合物中形成了较少的MAG。

[00251]当保持pH不变时，增加甘露醇的量也导致稳定性提高。例如，尽管在pH4.5时分别包含62.5mg和125mg甘露醇的化合物L和K在T＝0时具有相似的B₀含量，但是经过12个月以后，B₀的百分比变化对于化合物K显著较小。类似的情况可以在化合物J和I中看到，它们在pH5.0时分别包含62.5mg和125mg甘露醇。

[00252]虽然仅仅包含甘露醇的组合物的pH改变确实导致了B₀降解量的改变，然而不存在可预测的趋势。分别在pH4.5、5.0和5.3，化合物L、J和H包含62.5mg甘露醇。经过12个月以后，在25℃时，B₀的百分比变化分别为1.0、1.2和0.7。分别在pH3.3、4.5和5.0，化合物0、K和I包含125mg甘露醇。经过12个月以后，在25℃时，这些组合物的B₀的百分比变化分别为0.5、0.1和0.3。值得注意的是，在40℃下经过2个月，在化合物0中，组分B₀的量仅仅降低了1.9％，在化合物M中降低了1.0％(参见图4A)。

[00253]尽管化合物0(125mg甘露醇，pH 3.3)的B₀百分含量的改变类似于在含125mg甘露醇的组合物(参见组合物I和K)中发现的其它区别，如图3A中所示，在T＝0时B₀最初降解的量对于化合物0显著较少(88.3％B₀)。当与化合物K(pH4.5)和化合物I(pH5.0)(它们分别含有85.3％B₀和85.5％B₀)相比时，这尤其明显。在化合物0中存在的B₀的量和MAG的量之间的区别(参见图3A和B)最有可能用下列事实解释，如之前解释过的，B₀不是降解形成MAG的唯一的达巴万星组分。

[00254]乳糖也似乎是达巴万星的适当的稳定剂。对于在pH4.5时包含125mg乳糖的化合物N来说，在25℃下经过12个月，B₀的百分含量变化只有0.6。在40℃下经过2个月，B₀的百分含量变化只有1.4。然而单独的乳糖似乎并不会稳定达巴万星，甘露醇也是。在pH4.5时，在40℃下经过2个月，化合物K(125mg甘露醇)的B₀组分只下降了1.0。

[00255]甘露醇和乳糖联用也似乎稳定了达巴万星，这是特别优选的。甘露醇和乳糖具有相似的稳定性质。然而甘露醇是利尿剂。因此，在优选实施方案中，将甘露醇的量最小化。化合物M包含甘露醇和乳糖各62.5mg。如在图3A中看到的，在25℃下经过12个月，MAG的百分含量变化只有0.6。另外，如在图4A中看到的，在40℃下经过3个月，MAG的量只增加了2.1％。这比在化合物N(125mg乳糖)和K(125mg甘露醇)中看到的降解都小，它们二者在40℃下经过3个月都显示出了MAG的量增加2.9％。意外的是，在其它制剂中使用的甘露醇和乳糖各自量的一半的联用会导致达巴万星稳定性更大的增加。

[00256]在大约pH4.5下，在各个温度下，被甘露醇和乳糖稳定的达巴万星的其它稳定性数据报道在下表8A-D中。

表8A.注射用达巴万星Lot 554399在40℃/75％TH下的稳定性(500mg小瓶，甘露醇和乳糖，pH 4.5)

        试验                           时间(月)    0    1    3    6物理外观白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体HPLC 测定95.495.792.291.6组分分布(A₀+A₁)2.62.52.42.5B₀87.086.085.484.9(B₁+B₂)5.86.26.36.4降解产物MAG1.01.51.92.2不确定的最多个体n.d.n.d.n.d.n.d.总降解产物1.01.51.92.2重构时间115574755溶液外观澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液颗粒物质颗粒≥10μm符合USP------颗粒≥25μm符合USP------水分0.40.50.50.6重构溶液的pH4.34.64.54.5无菌状态符合USP------

n.d.未检测到

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

表8B.注射用达巴万星Lot 554399在30℃/65％RH下的稳定性(500mg小瓶，甘露醇和乳糖，pH4.5)

      试验                                      时间(月)    0    1    3    6    9    12物理外观白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体HPLC测定95.497.394.293.794.093.8组分分布(A₀+A₁)2.62.52.52.52.42.4B₀87.086.285.885.386.785.9(B₁+B₂)5.86.26.46.55.56.4降解产物MAG1.01.11.31.51.71.7不确定的最多个体n.d.n.d.n.d.n.d.0.1n.d.总降解产物1.01.11.31.51.81.7重构时间11514653403749溶液外观澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液颗粒物质颗粒≥10μm符合USP---------------颗粒≥25μm符合USP---------------水分0.40.40.40.50.60.5重构溶液的pH4.34.54.54.44.54.5无菌状态符合USP---------------

n.d.未检测到

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

表8C.注射用达巴万星Lot 554399在25℃/60％RH下的稳定性(500mg小瓶，甘露醇和乳糖，pH 4.5)

    试验                         时间(月)    0    3    6    9    12物理外观白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体HPLC测定95.494.693.293.992.6组分分布(A₀+A₁)2.62.52.52.52.4B₀87.086.085.987.086.2(B₁+B₂)5.86.46.35.76.4降解产物MAG1.01.21.21.41.4不确定的最多个体n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.总降解产物1.01.21.21.41.4重构时间11555685450溶液外观澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液颗粒物质颗粒≥10μm符合USP---------符合USP颗粒≥25μm符合USP---------符合USP水分0.40.30.40.40.5重构溶液的pH4.34.54.54.64.6无菌状态符合USP---------符合USP

n.d.未检测到

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

表8D.注射用达巴万星Lot 554399在5℃下的稳定性(500mg小瓶，甘露醇和乳糖，pH 4.5)

    试验                             时间(月份)    0    3    6    9    12物理外观白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体HPLC测定95.494.792.793.793.4组分分布(A₀+A₁)2.62.52.52.52.4B₀87.086.286.187.686.9(B₁+B₂)5.86.46.35.76.4降解产物MAG1.00.90.91.00.9不确定的最多个体n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.总降解产物1.00.90.91.00.9重构时间11590887572溶液外观澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液颗粒物质颗粒≥10μm符合USP---------符合USP颗粒≥25μm符合USP---------符合USP水分0.40.30.30.40.4重构溶液的pH4.34.54.54.54.6无菌状态符合USP---------符合USP

n.d.未检测到

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

[00257]进一步的长期稳定性研究数据列在表9-11中。利用二元流动相梯度和UV检测系统，通过反相HPLC测定样品，以测定达巴万星制剂的稳定性。使用外标测定达巴万星含量。通过将各个单个组分面积与所有主要药物组分总面积进行比较，计算达巴万星组分的百分分布。通过将各个杂质面积与总色谱面积进行比较，计算杂质的百分分布。

[00258]测试样品的HPLC测定、生物检定、含水量、微生物限度、pH、HPLC分布或总杂质。结果显示在表9-11中。第025批次的稳定性数据显示在表9A、10A和11A中，它在T＝0时含有1.5％MAG。第020005/R批次的稳定性数据显示在表9B、10B和11B中，它在T＝0时含有0.8％MAG，作为所述不同干燥过程的结果，描述如下。

[00259]在-20℃下的贮存过程中，达巴万星显示出了良好的稳定性(参见表9A-B)，在生物检定、HPLC测定、HPLC分布或总杂质方面没有显著变化。观察到了pH保持不变，含水量稍微增加。

[00260]在5℃下经过36个月观察到了降解(参见表10A)，如MAG含量增加约2.9％和因子B₀相应降低约3.6％所证明的。没有观察到总杂质趋势，生物检定和pH保持基本不变。在第020005批次中观察到了类似的结果(参见表10B)。

[00261]在25℃下贮存经过12个月的过程中，观察到了更广泛的降解(参见表11A)，MAG增加约10.2％，因子B₀降低了大约8.5％。其它因子、相关物质和pH水平保持不变。含水量增加了约1.6％。

表9A.第025批次未制剂的达巴万星在-20℃下的稳定性数据(pH3.5)

    试验                                                时间(月)    0    3    6    9    12    18    24    36物理外观------------------------HPLC测定(无水，游离碱，％w/w)92.093.390.188.688.491.189.690.3组分分布(HPLC％AUC)A₀+A₁4.04.04.04.03.93.93.93.8B₀83.483.582.182.984.483.883.582.7B₁+B₂7.57.48.18.07.47.37.57.9相关物质(HPLC％AUC)MAG1.51.51.31.61.31.51.41.2不确定的最多个体0.20.20.20.20.20.20.20.2总杂质5.15.15.85.24.34.95.25.6水分(％w/w)11.013.312.112.612.112.812.214.2pH3.02.93.02.92.92.92.92.8微生物限度^*＜10，＜10cfu/g---------------------

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

^*总需氧菌计数，总合的霉菌和酵母菌计数

表9B.第020005/R批次未制剂的达巴万星在-20℃下的稳定性数据

    试验                                        时间(月)    0    3    6    9    12    18物理外观白色到棕褐色粉末白色到棕褐色粉末白色到棕褐色粉末白色到棕褐色粉末白色到棕褐色粉末白色到棕褐色粉末HPLC测定(无水，游离碱，％   w/w)92.094.492.194.691.092.1组分分布(HPLC％AUC)A₀+A₁2.52.52.52.52.42.5B₀87.187.586.786.686.587.3B₁+B₂6.25.66.26.26.65.9相关物质(HPLC％AUC)MAG0.80.90.90.80.90.9不确定的最多个体0.20.20.20.30.20.2总杂质4.34.54.64.74.44.4水分(％w/w)18.220.120.120.32019.6pH2.42.52.42.52.52.6微生物限度^*2，1cfu/g---------------

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

^*总需氧菌计数，总合的霉菌和酵母菌计数

表10A.第025批次未制剂的达巴万星在5℃下的稳定性数据

    试验                                                时间(月)    0    3    6    9    12    18    24    36物理外观HPLC测定(无水，游离碱，％w/w)92.091.090.391.890.589.388.287.3组分分布(HPLC％AUC)A₀+A₁4.04.03.93.93.83.93.83.7B₀83.483.181.381.883.382.281.379.8B₁+B₂7.57.47.97.77.27.27.27.5相关物质(HPLC％AUC)MAG1.51.82.02.52.83.33.84.4不确定的最多个体0.20.30.30.20.20.20.20.3总杂质5.15.56.96.55.76.77.79.0水分(％w/w)11.012.311.813.215.014.814.917.6pH3.03.03.02.92.92.92.92.8微生物限度^*＜10，＜10cfu/g---------＜1，3cfu/g---＜1，1cfu/g＜1，1cfu/g

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

^*总需氧菌计数，总合的霉菌和酵母菌计数

表10B.第020005/R批次未制剂的达巴万星在5℃下的稳定性数据

    试验                                    时间(月)    0    3    6    9    12    18物理外观白色到棕褐色粉末白色到棕褐色粉末白色到棕褐色粉末白色到棕褐色粉末白色到棕褐色粉末白色到棕褐色粉末HPLC测定(无水，游离碱，％w/w)92.092.091.791.889.289.7组分分布(HPLC％AUC)A₀+A₁2.52.52.52.42.42.3B₀87.187.185.685.384.684.3B₁+B₂6.25.66.26.16.45.5相关物质(HPLC％AUC)MAG0.81.51.92.12.64.1不确定的最多个体0.20.20.20.20.20.3总杂质4.34.95.86.36.67.9水分(％w/w)18.217.417.216.415.414.2pH2.42.52.42.52.52.5微生物限度^*2，1cfu/g---------＜1，＜1cfu/g---

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

^*总需氧菌计数，总合的霉菌和酵母菌计数

表11A.第025批次未制剂的达巴万星在25℃/60％RH下的稳定性数据

    试验                           时间(月)    0    1    3    6    12物理外观---------------HPLC测定(无水，游离碱，％w/w)92.090.987.085.278.8组分分布(HPLC％AUC)A₀+A₁4.03.93.83.73.4B₀83.481.679.576.374.9B₁+B₂7.57.47.07.36.3相关物质(HPLC％AUC)MAG1.53.66.08.111.7不确定的最多个体0.20.20.20.40.3总杂质5.17.19.612.715.4水分(％w/w)11.011.312.112.912.6pH3.03.03.03.03.0微生物限度^*＜10，＜10cfu/g---------1，＜1cfu/g

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

^*总需氧菌计数，总合的霉菌和酵母菌计数

表11B.第020005/R批次未制剂的达巴万星在25℃/60％RH下的稳定性数据

    试验                   时间(月份)    0    1    3    6物理外观白色粉末白色粉末白色粉末白色粉末HPLC测定(无水，游离碱，％w/w)92.0 91.287.283.3组分分布(HPLC％AUC)A₀+A₁2.52.52.32.3B₀87.184.982.378.7B₁+B₂6.25.35.35.8相关物质(HPLC％AUC)MAG0.83.66.18.2不确定的最多个体0.20.20.30.7总杂质4.37.310.113.2水分(％w/w)18.215.213.812.6pH2.42.62.52.5微生物限度^*2，1cfu/g---------

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

^*总需氧菌计数，总合的霉菌和酵母菌计数

[00262]还进行无菌产品的稳定性试验。测试块状和溶液样品的外观、重构时间、pH、HPLC测定、生物检定、含水量、无菌度、HPLC分布和相关物质。结果显示在表12-14。

[00263]当在5℃下贮存时，冻干产品显示出了良好的稳定性，在HPLC测定或HPLC分布方面只有少量改变(参见表12A和B)。当温度提高时(参见表13和14)，因子B₀有降低，MAG有相应的增加。其它因子似乎不受温度影响。产品外观和pH似乎不受温度影响。也不可能测定重构时间的明显趋势，因为考虑到溶解产品的外观检查可以需要数秒钟。

表12A.注射用达巴万星Lot149570在5℃下的稳定性(冻干，甘露醇，pH3.5)

    试验                                                     时间(月)    0    3    6    9    12    18    24    36物理外观白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体HPLC测定97.399.8100.7100.2100.0100.299.3104.4组分分布(A₀+A₁)3.63.63.63.73.63.63.73.7B₀79.479.680.380.180.08.180.081.3后B₀^*12.812.311.311.611.611.711.610.6降解产物MAG0.60.60.70.60.70.70.70.7重构时间9045404540404166溶液外观澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液颗粒物质颗粒≥10μm------------------------颗粒≥25μm------------------------水分0.81.41.2nd1.11.61.51.3重构溶液的pH3.73.53.53.53.53.43.43.5无菌状态无菌---------无菌---无菌无菌

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

^*用展开HPLC法进行分析。达巴万星B₁和B₂不能用该方法分辨。

表12B.注射用达巴万星Lot442378在5℃下的稳定性(冻干，甘                      露醇，pH3.5)

    试验                                      时间(月)    0    3    6    9    12    18物理外观白色到乳白色到浅黄色粉末白色到乳白色到浅黄色粉末白色到乳白色到浅黄色粉末白色到乳白色到浅黄色粉末白色到乳白色到浅黄色粉末白色到乳白色到浅黄色粉末HPLC测定101.8102.9100.899.9101.499.4组分分布(A₀+A₁)2.52.52.52.52.52.5B₀85.785.585.685.385.385.5(B₁+B₂)5.55.85.65.76.25.7降解产物MAG1.71.81.61.71.71.9不确定的最多个体n.d.n.d.0.1n.d.n.d.n.d.总降解产物1.71.81.81.71.71.9重构时间754643433232溶液外观澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液颗粒物质颗粒≥10μm符合USP---------符合USP---颗粒≥25μm符合USP---------符合USP ---水分0.30.30.40.70.40.6重构溶液的pH3.43.43.43.23.43.3无菌状态无菌---------无菌---

n.d.未检测到

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

表13A.注射用达巴万星Lot 149570在25℃/60％RH下的稳定性(冻干，甘露醇，pH3.5)

    试验                                   时间(月)    0    1    3    6    9    12物理外观白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体HPLC测定97.399.498.3100.399.798.7组分分布(A₀+A₁)3.63.73.63.63.63.7B₀79.481.079.380.079.778.9后B₀^*12.810.612.111.110.911.6降解产物MAG0.60.81.11.31.81.8重构时间905045453040溶液外观澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液颗粒物质颗粒≥10μm------------------颗粒≥25μm------------------水分0.8nd1.61.4nd1.6重构溶液的pH3.73.63.63.53.53.5无菌状态无菌------------无菌

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

^*用展开HPLC法进行分析。达巴万星B₁和B₂不能用该方法分辨。

表13B.注射用达巴万星Lot 442378在25℃/60％RH下的稳定性(冻干，甘露醇，pH3.5)

    试验                                时间(月)    0    3    6    9    12    18物理外观白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体HPLC测定101.8103.9100.298.6100.798.0组分分布(A₀+A₁)2.52.52.42.52.42.5B₀85.785.085.584.484.383.9(B₁+B₂)5.55.85.45.76.15.6降解产物MAG1.72.32.42.82.93.5不确定的最多个体n.d.n.d.0.2n.d.n.d.0.1总降解产物1.72.32.52.82.93.6重构时间754538332531溶液外观澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液颗粒物质颗粒≥10μm符合USP---------符合USP---颗粒≥25μm符合USP---------符合USP---水分0.30.70.60.70.70.8重构溶液的pH3.43.43.43.33.43.4无菌状态无菌---------无菌---

n.d.未检测到

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

表13C.注射用达巴万星Lot 442378在30℃/65％RH下的稳定性(冻干，甘露醇，pH3.5)

    试验                              时间(月)    0    1    3    6    9    12物理外观白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体HPLC测定100.098.599.7100.095.396.8组分分布(A₀+A₁)2.52.42.42.42.42.4B₀86.385.684.784.383.283.0(B₁+B₂)5.55.55.75.96.35.6降解产物MAG1.72.12.53.03.54.2不确定的最多个体0.10.10.20.20.20.2总降解产物1.82.32.93.33.84.5重构时间455531274626溶液外观澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液颗粒物质颗粒≥10μm符合USP---------------颗粒≥25μm符合USP---------------水分0.50.70.90.70.90.9重构溶液的pH3.53.63.33.43.33.3无菌状态无菌---------------

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

表14A.注射用达巴万星Lot 149570在40℃/75％RH下的稳定性(冻干，甘露醇，pH3.5)

    试验                    时间(月)    0    1    6物理外观白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体HPLC 测定97.398.694.795.1组分分布(A₀+A₁)3.63.73.53.5B₀79.479.877.176.5后B₀^*12.810.511.910.7降解产物MAG0.62.03.75.5重构时间90554540溶液外观澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液颗粒物质颗粒≥10μm------------颗粒≥25μm------------水分0.8n.d.2.01.7重构溶液的pH3.73.53.63.5无菌状态无菌---------

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

^*用展开HPLC法进行分析。达巴万星B₁和B₂不能用该方法分辨。

表14B.注射用达巴万星Lot 442378在40℃/75％RH下的稳定性(冻干，甘露醇，pH3.5)

    试验                        时间(月)    0    1    3    6物理外观白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体白色到乳白色到浅黄色固体HPLC测定101.8101.598.691.8组分分布(A₀+A₁)2.52.42.42.2B₀85.784.282.080.6(B₁+B₂)5.55.85.65.2降解产物MAG1.73.25.36.6不确定的最多个体n.d.0.30.20.5总降解产物1.73.85.67.4重构时间75464641溶液外观澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液澄明到浅黄色溶液颗粒物质颗粒≥10μm符合USP---------颗粒≥25μm符合USP---------水分0.30.60.80.8重构溶液的pH3.43.43.43.4无菌状态无菌---------

n.d.未检测到

---在该时间点没有测试，按照稳定性实验方案

耐光性

[00264]还评价标记小瓶中注射用达巴万星(500mg小瓶)的耐光性。将10个标记小瓶放入耐光室，连同被铝箔包裹好的作为黑暗对照的10个标记小瓶。暴露试样不少于1.2兆勒小时，并且整体近紫外线辐射能不少于200瓦特小时/米²。评价样品的外观、溶液外观、pH、水分和HPLC测定。该评价的结果显示在表15中。

表15.500mg/小瓶药品的即时包装耐光性结果

     试验                 结果光暴露黑暗对照外观白色到乳白色固体白色到乳白色固体溶液外观浅黄色溶液浅黄色溶液测定(无水，游离碱)91.8％92.8％水分含量0.3％0.3％pH4.54.5重构时间(秒)4368组分分布(％AUC)-A₀0.7％0.7％-A₁1.7％1.8％-B₀86.0％86.2％-B₁4.2％4.3％-B₂1.9％2.0％相关物质(％AUC)-C₀0.3％0.3％-C₁0.1％0.1％-D₀0.2％0.2％-D₁0.3％0.3％-异B₀0.9％1.0％-MAG1.2％1.1％-三氯0.5％0.5％-RRT 0.850.1％n.d.总杂质(％AUC)5.4％5.0％

n.d.未检测到

[00265]光暴露样品和黑暗对照样品的比较显示，光暴露样品保持可比性，在效能、API组分水平和总杂质方面轻微变化。

[00266]光暴露样品证明了极低水平的RRT 0.85不确定杂质存在，该杂质在黑暗对照样品中检测不到。用HPLC/MS对该组分的评价表明，它是达巴万星B同系物的单-氯化衍生物。

[00267]基于这些结果，认为注射用达巴万星在其即时包装中是耐光的。

改良的功效与减少的副作用

[00268]如本文实施例所证明，每周一次以高剂量水平(即导致异常高和持久的血清水平)施用达巴万星显示出异常好的安全性曲线，其类似于或优于每天一次甚或每天2-4次施用较低剂量的常规抗生素的标准治疗所观察到的安全性曲线。可以比其它抗生素更低的频率施用异常高的剂量(即导致异常高和持久的血清水平)的达巴万星且不具有不良副作用，从而能够改良功效和患者依从性。

[00269]如实施例1中所讨论，以达巴万星进行治疗致使低的不良事件发生率。严重不良事件包括在任何剂量下发生的导致死亡、危及生命、导致住院或现有住院延长或持久的或显著的能力丧失或无力的任何不良药物经历。在实施例1中所述的II期试验中，90％的诸如腹泻、恶心、高血糖、肢体疼痛、呕吐和便秘的不良反应在严重程度上是轻度到中度。在实施例1的试验中使用达巴万星未导致与研究药物治疗相关的严重不良事件。

药盒

[00270]本发明还提供了用于细菌感染的治疗或预防方法中的药盒。药盒包括本发明药物组合物(例如包括至少一个单位剂量的达巴万星)与向健康护理提供者提供治疗或预防细菌感染的用法的相关信息的说明书。说明书可以印刷形式、或以诸如软盘、CD或DVD的电子介质形式、或以其中可获得所述说明书的网址形式提供。单位剂量的达巴万星经常包括当对个体施用时使得治疗或预防有效的达巴万星血浆水平在个体内维持至少5天的剂量。在某些实施方案中，药盒包括有待间隔至少5天、经常间隔约1周施用的两个单位剂量，经常包括比第二剂量高出约1.5到约3倍的第一剂量的达巴万星。经常包括作为无菌含水药物组合物或干粉(例如冻干)组合物的达巴万星。

[00271]提供了合适的包装。当用在本文中时，“包装”指的是通常用于系统的并且能够将适于对个体施用的达巴万星组合物保持在固定范围内的固体基质或材料。所述材料包括玻璃和塑料(例如聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯)瓶、小瓶、纸、塑料和塑料箔层压的封套及其类似物。如果使用电子束灭菌技术，那么包装应具有足够低的密度以允许对内容物灭菌。

[00272]药盒还可任选包括用于施用达巴万星的设备，例如用于静脉内给药的注射器或设备；和/或用于制备供给药用的组合物干粉(例如冻干)的无菌溶液，例如，诸如稀释剂，如5％右旋糖。

[00273]本发明的药盒除达巴万星之外还可包括非达巴万星抗生素或非达巴万星抗生素的混合物以如以上方法中所述与达巴万星一起使用。

[00274]在以下实施例中，下列缩略语具有下列含义。如果未对缩略语进行定义，那么其具有通常被接受的含义。

AcOH        ＝乙酸

AcONa       ＝乙酸钠

aq.         ＝含水

AST         ＝天冬氨酸转氨酶

ALT         ＝丙氨酸转氨酶

BV          ＝柱床体积

CV          ＝变异系数

d           ＝直径

D           ＝道尔顿

DCC         ＝二环己基碳二酰胺

            (dicyclohexylcarbodiammide)

DMEPA       ＝3-(二甲氨基)-丙胺

DMSO        ＝二甲基磺酰胺

eq          ＝当量

EU          ＝内毒素单位

g           ＝克

GC          ＝气相色谱

HCl         ＝盐酸

H₂O         ＝水

HOBT        ＝水合1-羟基苯并噻唑

HPLC        ＝高效液相色谱法

H₂SO₄        ＝硫酸

IPA         ＝异丙胺

IU          ＝国际单位

KF          ＝氟化钾

Kg          ＝千克

L           ＝升

LC/MS/MS    ＝液相色谱/质谱/质谱

LDH         ＝乳酸脱氢酶

LSC         ＝液体闪烁计数

m³          ＝立方米

MeOH        ＝甲醇

mg          ＝毫克

mL          ＝毫升

mol         ＝摩尔

MW          ＝分子量

N           ＝正常

NaOH        ＝氢氧化钠

NMP         ＝N-甲基-2-吡咯烷酮

QTD         ＝定量组织分布

Rt     ＝保留时间

sd     ＝标准偏差

TEA    ＝三乙胺

[00275]下列实施例旨在说明本发明，但不打算限制本发明。

实施例

实施例1.每周一次的达巴万星在深部皮肤和软组织感染中的功效和安全性

[00276]此随机的设对照研究评估两个达巴万星给药方案的安全性和功效。将涉及深层皮肤结构或需要外科手术干预的皮肤和软组织感染(SSTI)成年患者随机分成三组：第1研究小组：在第1天通过静脉内注射(IV)接受1100mg达巴万星；第2研究小组：在第1天通过IV接受1g达巴万星，并在第8天通过IV接受500mg达巴万星；第3研究小组：接受“标准护理”(standard of care)。评价临床与微生物反应和不良事件。

用于分析的人群

[00277]有62名患者随机分入研究中；所有患者均接受至少一个剂量的研究药物。评估4组研究人群的安全性和功效并定义如下：意向治疗型(ITT)人群包括接受至少一个剂量研究药物的所有患者(所有随机化的对象)。微生物意向治疗型(MITT)人群是在基线带有经培养证实的革兰氏阳性病原体的所有ITT患者。将临床可评估的人群定义为如下人群：1)满足所有研究进入标准，2)除了口服递减治疗(仅用于标准护理组)以外，在第4天后的革兰氏阳性感染的抗菌治疗中无变化，3)返回进行随访(FU)评估访视(除非治疗失败)，和4)不接受非协议认可的伴随抗菌剂(除非治疗失败)。微生物学可评估的人群是在基线带有经培养证实的革兰氏阳性病原体的临床上可评估的患者亚组。

[00278]研究人群示于表16中。

表16.用于达巴万星SSTI治疗的研究人群

        人群  第1研究小组  达巴万星1100mg  第1天   第2研究小组   达巴万星1000mg   第1天   500mg第8天   第3研究小组   “标准护理”随机ITT    20    21    21治疗    20(100％)    21(100％)    21(100％)完成研究    18/20(90％)    20/21(95.2％)    21/21(100％)EOT时的临床可评估    16/20(80％)    17/21(81％)    21/21(100％)FU时的临床可评估    13/20(65％)    17/21(81％)    21/21(100％)MITT    14/20(70％)    13/21(61.9％)    14/21(66.7％)EOT时的微生物可评估    13/20(65％)    11/21(52.4％)    14/21(66.7％)FU时的微生物可评估    11/20(55％)    11/21(52.4％)    14/21(66.7％)

ITT-意向治疗型

MITT-具有经培养证实的革兰氏阳性感染的ITT人群亚组

EOT-治疗结束

FU-随访

[00279]对象的平均年龄是50-55岁(范围在18-86岁)。治疗分组之间的年龄无明显差异。治疗分组之间的性别存在差异，但整个研究登记了相等数目的男性与女性。患者人群主要是白种人。对于ITT与临床上可评估的人群而言这些结果是一致的。

[00280]登记了62名患者，在第1研究小组中有20名并且第2研究小组和第3研究小组中各有21名。标准护理的最常见的对比物是克林霉素、头孢曲松、万古霉素和头孢唑啉。第3研究小组的平均治疗持续时间是15天。

基线病原体和敏感性

[00281]在62名ITT患者中，66％(14名用单剂量达巴万星，13名用两剂量达巴万星，14名用标准护理)带有分离出的治疗前革兰氏阳性病原体(MITT人群)。最常见的病原体是金黄色葡萄球菌。基线病原体的分布示于表17中。

表17.MITT人群的基线革兰氏阳性病原体和达巴万星MIC范围

带有病原体的人数(MIC)单剂量达巴万星(1100mg)(N＝14)两剂量达巴万星(1000/500mg(N＝13)标准护理方案(N＝14)所有金黄色葡萄球菌13(0.12)11(0.12)10(0.016-0.25)甲氧西林敏感的768甲氧西林耐药的652B群链球菌02(0.016)2(0.016)酿脓链球菌01(0.016)1(0.016)混杂的链球菌与不可分型的菌株3(0.016)2(0.016)4(0.016)

临床和微生物反应

[00282]通过评定患者的临床反应与经证明或假定的微生物反应来判定三个治疗方案的有效性。主要的功效终点是临床上可评估的人群在后续回访时的临床反应。EOT与FU访视的临床反应均分类为成功(治愈或改善)或失败(包括不确定结果)。归类为成功的患者必须未接受用于其感染的额外的全身性抗菌治疗。失败被定义为一种或多种SSTI的一种或多种局部或全身体征与症状存留，使得需要新的或额外的全身性抗菌剂以用于SSTI。

[00283]在带有经微生物学证明的SSTI(即至少一种经鉴定的基线病原体)的患者亚组中评定作为次要的功效变量的微生物结果。评定对在基线鉴定的各革兰氏阳性病原体的微生物反应(即根除、推测根除、存留、推测存留)。对于未进行后续培养的患者而言，以临床反应为基础推测基线病原体的微生物反应。EOT与FU访视时患者的微生物反应分级为成功(即所有革兰氏阳性生物体被根除或推测根除)或失败(即至少一种革兰氏阳性生物体存留或推测存留，多种病原体部分根除)。在EOT与FU访视时均评定定殖与重叠感染。在FU回访时患者的细菌学反应也可包括复发。

临床功效

[00284]临床成功率显示在表18中。在临床上可评估的人群中，单剂量达巴万星组中的61.5％患者、两剂量达巴万星组中的94.1％患者和标准护理组中的76.2％患者在FU评定时被归类为成功。在分类为在基线具有深部或复杂SSTI的那些患者的试探性子分析中，相比于各自是58.3％与73.7％的单剂量达巴万星治疗与标准护理治疗，两剂量达巴万星治疗也提供了较高的临床成功率(93.8％)。

[00285]在接受两剂量达巴万星治疗后始终倾向于具有更有利的反应的支持性ITT与微生物学上可评估的人群中，在EOT与FU评定中发现了类似的成功率(表17)。就MITT人群而言，具有耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的患者在FU评定时单剂量达巴万星的临床成功率是50％(3/6)，两剂量达巴万星是80％(4/5)，并且以标准护理方案治疗的患者是50％(1/2)。

表18.分析人群与治疗组的临床成功率

         人群  单剂量(1100  mg)达巴万星    两剂量    (1000/500mg)达    巴万星    标准护理方案EOT时的ITT  15/20(75.0)    19/21(90.5)    17/21(81.0)FU时的ITT  12/20(60.0)    19/21(90.5)    16/21(76.2)EOT时的MITT  10/14(71.4)    12/13(92.3)    10/14(71.4)FU时的MITT  77/14(50.0)    12/13(92.3)    9/14(64.3)EOT时的临床可评估  13/16(61.5)    16/17(94.1)    17/21(81.0)FU时的临床可评估  8/13(61.5)    16/17(94.1)    16/21(76.2)EOT时的微生物学可评估  10/13(76.9)    10/11(90.9)    10/14(71.4)FU时的微生物学可评估  6/11(54.5)    10/11(90.9)    9/14(64.3)

微生物学功效

[00286]关于不同病原体，不同治疗方案的成功率显示在表19中。就微生物学可评估的人群而言，在FU评定时所有生物体的根除/推测根除率对单剂量达巴万星是58.3％(7/12)，就两剂量达巴万星而言是92.3％(12/13)，并且就标准护理组中的患者而言是70.6％(12/17)。就存留的分离株而言，达巴万星MIC无变化。在FU时，两剂量达巴万星组的金黄色葡萄球菌的根除率(90％)与单剂量达巴万星(50％)和标准护理(60％)治疗相比较高。对MITT人群观察到了类似发现；两剂量达巴万星根除80％的MRSA分离株(表19)。

表19.在FU评定时微生物ITT人群的病原体成功率

单剂量(1100mg)达巴万星两剂量(1000/500mg)达巴万星标准护理方案全部生物体7/16(43.8％)14/16(87.5％)12/17(70.6％)全部金黄色葡萄球菌5/13(38％)9/11(82％)6/10(60％)甲氧西林敏感的2/7(29％)5/6(83％)5/8(63％)耐甲氧西林的3/6(50％)4/5(80％)1/2(50％)混杂的链球菌2/3(67％)4/4(100％)5/7(71％)

[00287]就微生物学可评估和MITT人群而言，在EOT与FU时的微生物学成功率总结于表20中。在以两剂量达巴万星和标准护理方案治疗的患者的两次访视中均报导了可相比的微生物学成功率(大约64％到77％)，而那些给予单剂量达巴万星的具有较低的成功率(＜40％)。微生物学上可评估的人群中在EOT/FU时微生物学成功率与临床反应发现类似：就单剂量达巴万星而言是38.5％/27.3％，就两剂量达巴万星而言是72.7％/72.7％，并且就标准护理治疗而言是71.4％/64.3％。观察到MITT人群的类似发现(数据未显示)。

表20.微生物学成功率

单剂量(1100mg)达巴万星两剂量(1000/500mg)达巴万星标准护理方案MITT人群EOT5/14(35.7)10/13(76.9)10/14(71.4)FU3/14(21.4)9/13(69.2)9/14(64.3)微生物学可评估的人群EOT5/13(38.5)8/11(72.7)10/14(71.4)FU3/11(27.3)8/11(72.7)9/14(64.3)

药代动力学分析

[00288]就随机分入达巴万星治疗组的患者而言，在第8天获得5ml血液以测定达巴万星血浆浓度。对于在第8天随机接受500mg达巴万星剂量的患者而言，在即将施用第二剂量前获得血液。就随机分入单剂量达巴万星组的患者而言在第10天与第24天获得另外的5ml血样，并且就接受两剂量达巴万星的患者而言在第20天与第34天获得另外的5ml血样。

[00289]使用经验证的液相色谱法与质谱分光光度计法测定达巴万星血浆浓度。对血浆而言，定量的下限是500ng/ml。

[00290]在单剂量方案中于研究第8、10和24天收集的达巴万星平均浓度分别是31.1±7.1、25.2±4.8和10.2±3.5mg/l(平均值±SD)。接受两剂量方案的达巴万星浓度在研究第8(第二剂量之前)、20和34天分别是30.4±8.2、21.2±10.0和9.0±4.4mg/l。如所预期的，所有患者在接受第一剂量后第一周内均具有高于20mg/l的达巴万星浓度，在第8天以静脉内的额外500mg剂量使高于20mg/l的水平又维持了一周。最小杀菌浓度通常是约4-10mg/l。

安全性评估

[00291]通过监测不良事件(AE)对接受至少一个剂量的研究药物的各患者(ITT人群)评估药物安全性，所述不良事件包括异常的临床实验室测试结果与生命体征。由研究者根据AE的严重程度将AE分级(轻度、中度、严重、危及生命)，并以与研究药物的关系分级(不相关、不太可能相关、可能相关或很可能相关)。

[00292]AE数据的总结呈现在表21中。认为大部分不良反应(90％)在严重程度上是轻度到中度。所有严重的不良反应(5名患者中有8起事件)均与研究药物治疗无关。报导有至少一次治疗紧急AE的所有患者(19名单剂量达巴万星，16名两剂量达巴万星，21名标准护理)中大约59％经历了由研究者分类为与研究药物可能或很可能相关的事件。具体而言，在11名(55％)单剂量达巴万星、10名(48％)两剂量达巴万星和12名(57％)标准护理患者中报导了与药物相关的AE。在达巴万星与标准护理治疗组中最常报导的药物相关AE是腹泻和恶心。不同治疗组观察到的AE类型的总结呈现在表22中。

[00293]没有一个经达巴万星治疗的患者由于AE而过早地中断治疗。标准护理方案的21名患者中有3名(14％)由于AE而过早地中断治疗，包括1名患者在第1天出现很可能与药物相关的荨麻疹，和2名患者患有与研究药物无关的AE(重叠感染铜绿假单孢菌和升高的万古霉素谷水平)。

表21.不良事件(AE)数据的总结

 单剂量达巴万 星(N＝20)两剂量达巴万星(N＝21)标准护理(N＝21)≥1AE 95％76.2％100％％严重AE 15％9.5％4.8％≥1可能/很可能与治疗相关的AE 55％48％57％导致研究用药中断的AE 0014.3％≥1严重AE 2(10％)2(9.5％)1(4.8％)

表22.最常见的不良事件

单剂量达巴万星(N＝20)两剂量达巴万星(N＝21)标准护理(N＝21)腹泻20％9.5％28.6％恶心10％28.6％9.5％高血糖5％14.3％19％肢体疼痛10％9.5％9.5％呕吐10％14.3％4.8％便秘5％4.8％14.3％

讨论

[00294]该开放标记的随机II期试验显示，达巴万星可有效治疗具有SSTI的成人。大部分登记过的患者具有深部或复杂感染(＞90％)和需要外科手术干预的感染(～70％)，而大约45％患有潜在糖尿病。

[00295]两个每周一次的达巴万星剂量在数字方面具有比单剂量达巴万星或标准护理方案更高的临床反应率。来自ITT与临床上可评估的人群的数据表明，连续两个每周一次注射达巴万星剂量(每周一次，1000mg，500mg)在SSTI治疗上很有效。标准护理组治疗平均持续13天。在随访中，相比于提供标准护理方案的患者中的76％和接受单剂量达巴万星的患者中的61.5％，认为以两剂量达巴万星治疗的临床可评估的患者中的94％是临床成功的。

[00296]金黄色葡萄球菌是在基线最常分离出的生物体。在该试验中，大约83％的患者感染了金黄色葡萄球菌并且在所有金黄色葡萄球菌中38％是MRSA。大多数感染(80％)是由单一病原体引起。达巴万星抗革兰氏阳性分离株(包括MRSA)的MIC在0.016到0.25mg/L范围内。

[00297]临床可评估的人群的微生物学成功率平与临床反应成功率类似。就合并的所有生物体而言，相比于单剂量达巴万星治疗(58％)和标准护理治疗(71％)，以两个剂量每周一次达巴万星的方案进行治疗在治疗2周后的评定时可提供较高的根除率(92％)。总而言之，分别在90％、50％和60％的患者中观察到了金黄色葡萄球菌根除率。就MITT人群而言，对比于单剂量达巴万星治疗与标准护理治疗的50％，两剂量达巴万星方案的MRSA根除率是80％。

[00298]在单剂量与两剂量每周一次的治疗期结束时(分别是第10天或第20天)获得的达巴万星浓度相类似，表明接受第二个每周剂量后药物蓄积很少。观察到的两给药方案的较高临床成功率表明时间依赖性杀灭效应，其中以间隔1周的两个达巴万星剂量提供持续的药物水平或药物暴露。在每周给药间隔末期测量的达巴万星血浆水平大体上高于所报导的对引起大部分SSTI的病原体的MIC₉₀(＜0.03-0.5mg/L)，包括该试验中所发现的病原体。所述水平也高于4到10mg/l的最小杀菌浓度。

[00299]达巴万星给药方案与标准护理组的总体不良反应率类似。胃肠道药物相关的不良事件(即腹泻与恶心)在三个治疗组中最经常地有所报导。大部分所述事件是轻度和自限性的。没有一个用达巴万星治疗的患者由于不良反应而早期就从研究退出，也未报导任何可归因于糖肽的严重不良事件，但标准护理组中有14％由于不良效应而退出。新的给药方案和标准护理相比因此具有减少的不良副作用。来自该试验的数据未发现达巴万星诱导任何程度的临床上显著的肝毒性或肾脏毒性的证据。

[00300]两剂量达巴万星给药方案似乎对于治疗具有复杂SSTI的患者很有效。在两个剂量下达巴万星在该临床试验中均被很好地耐受，同时具有与标准护理组类似的不良事件谱。

实施例2.每周一次达巴万星在治疗导管相关的血流感染(CR-BSI)中的功效和安全性

[00301]该项研究评价的是与标准治疗护理万古霉素相比，每周一次达巴万星给药方案在治疗由于革兰氏阳性细菌病原体导致的成人导管相关的血流感染(CR-BSI)中的功效和安全性。

方法

[00302]在该开放标记的、比较的、多中心研究中，将符合入选/排除标准的由于可疑或已知革兰氏阳性病原体而导致的CR-BSI患者随机分入两个治疗小组之一。在每周达巴万星疗法中，每周一次施用达巴万星，在万古霉素疗法中，每天施用对比物(万古霉素)。被金黄色葡萄球菌感染的患者需要除去导管；由研究者慎重考虑是否要对凝固酶-阴性的葡萄球菌(CoNS)感染患者处理导管。功效在临床上是根据临床体征和CR-BSI症状的改善或消退，保证没有另外的抗菌药物，且在微生物学上基于根除或存在基线病原体或其它病原体。还评价安全性和达巴万星血浆浓度。

用于分析的人群

[00303]计划大约80名患者(第1和第3治疗小组各40名)；分析67名患者(33名每周一次施用达巴万星，34名施用万古霉素)。每天施用达巴万星的7名(7)患者只包括在安全性分析中。随机分配75名(75)患者，且74名患者分布在美国的13个地方接受治疗；64名患者完成了该研究。在各个研究小组中，人口统计学特征一般是相似的。每周一次施用达巴万星患者的平均年龄为54岁(范围是20-78岁)，施用万古霉素的是57岁(范围是19-85岁)。男性和女性总体平均分配；在每周一次达巴万星小组中男性稍多，在万古霉素小组中女性稍多。大部分患者都是白种人(＞65％)，被分类为很可能患有CR-BSI，且有非埋植导管。对于微生物学ITT人群来说，两个治疗小组的最常见病原体是CoNS和金黄色葡萄球菌。在金黄色葡萄球菌分离株中，在第1和第3研究小组中分别有5/11(4 5.4％)和9/12(75.0％)被鉴定为耐甲氧西林(MRSA)。

诊断和入选的主要标准

[00304]被证明了的革兰氏阳性菌血症的患者入选，其中，证明了的革兰氏阳性菌血症被定义为至少一个血培养物是金黄色葡萄球菌阳性，或对所有其它生物体有至少两个血培养物是阳性(其中至少一个培养物来自经皮抽取的样品)。另外，还包括符合所有其它入选标准且还符合下列两个情况中每一个的患者：

1.至少两个下列菌血症体征：中心体温＞38.0℃或＜36.0℃，经直肠、经口腔(给测定的温度加上0.5℃)、鼓膜或经由中央导管测得；WBC计数＞12,000/mm³或＜4,000/mm³，或白细胞分类计数显示＞10％带型；心动过速(脉搏率＞100bpm)；呼吸急促(呼吸频率＞20次呼吸/分钟)；暂时性低血压(收缩压＜90mm Hg)；

2.除了导管以外没有菌血症临床表现的明显来源(可能在导管部位有局部体征和症状)。

治疗

[00305]被金黄色葡萄球菌感染的患者治疗持续14天，被所有其它病原体感染的患者治疗持续7-14天。由于达巴万星半衰期长，研究药物治疗的持续时间假定为对每周一次达巴万星给予的每个剂量的达巴万星为7天。静脉内施用达巴万星，在第1天是1000mg负荷剂量，在第8天是500mg剂量。静脉内施用万古霉素，每12小时施用1000mg剂量(或根据药物水平调节剂量)。

评价标准

[00306]根据临床和微生物学反应评价功效。在微生物学意向治疗型(ITT)人群中，主要结果参数是在治愈测试(TOC)访视时的总体反应。通过收集和分析不良事件(AE)、临床实验室检验、体格检查、生命体征和ECG数据评价安全性。在最多7个时机测定达巴万星血浆浓度(在第1天的第一剂量之前和之后，在第4±2天、在第8天的第二剂量之前和之后、治疗结束时(EOT)和在TOC时)。由于第2小组在研究过程中被排除，只描述那些患者的人口统计学数据和安全性数据；未评价功效。

统计方法

[00307]用描述统计学给出功效、安全性和达巴万星浓度数据。对于主要功效分析来说，还测定了95％置信区间，并且对于使用主要功效变量的预后因素分析来说，使用对数回归。

功效结果

[00308]对于主要功效分析-在TOC时在微生物学ITT人群中的总体反应来说，每周一次接受达巴万星的患者(87.0％，95％CI：73.2，100.0)比接受万古霉素的患者(50.0％，95％CI：31.5，68.5)具有更高的成功率。

[00309]对于次要功效分析来说，通过病原体、通过感染种类、通过基线时的导管状态和通过导管类型，在EOT和TOC时微生物学ITT和可评价人群中，达巴万星研究小组相对于万古霉素研究小组的总体成功、临床成功、及总体和临床成功是较高的。根据患者(By-patient)的微生物学成功在EOT时各治疗小组类似，但在TOC时达巴万星研究小组较高。对于CoNS来说，在EOT和TOC时，在达巴万星研究小组中，根据病原体(by-pathogen)的微生物学成功率是比较高的。到EOT时为止，两个研究小组导管部位的大部分体征和症状都消退了。

安全性结果

[00310]有71名患者(95.9％)报告不良事件(AE)。在各个研究小组中，报告AE的患者数目是类似的，尽管在达巴万星组中比在万古霉素组中报告了更多的AE。最常见的AE是腹泻、便秘、贫血和低血压。研究者认为大部分AE的强度为轻度到中度。认为与研究药物有关(可能的或很可能的)的不良事件平均地分布在各个研究小组中。达巴万星研究小组中的一名(1)患者(3％)存在导致达巴万星停药的不相关的、不严重的AE；没有AE导致撤出研究。万古霉素研究小组中的三名(3)患者(8.8％)存在导致对比物停药的AE；2件AE导致撤出研究。在各治疗组中，SAE的分布是类似的；认为达巴万星研究小组中没有SAE和万古霉素研究小组中有一次SAE与研究药物有关。在该研究中有5人死亡。导致死亡的所有AE都与研究药物无关。在任何研究小组中不存在临床有意义的实验室异常。几乎没有实验室值被报告成AE。没有一个是SAE或导致研究药物停药。

[00311]在所有治疗组中，舒张期血压增高是最共同的临床显著的异常变化。3/74名患者(4.1％，2名患者施用达巴万星，1名患者施用万古霉素)报告高血压为AE；只有1名患者(接受达巴万星)存在血压增高，作为被认为与研究药物有关的AE。达巴万星在心率、房室传导或室内传导方面没有表现出任何影响。对QTc值影响的平均差别是达巴万星组比万古霉素组大7毫秒。在药物治疗期间，治疗组之间的极端值频率没有观察到显著差别。

[00312]因此，达巴万星的初始IV剂量为1000mg，接着1周以后，第二IV剂量为500mg，这似乎有良好的耐受且对于由革兰氏阳性病原体(对万古霉素有较高的应答率)引起的CR-BSI的治疗非常有效。

实施例3.健康对象中的达巴万星药代动力学和肾排泄

[00313]此项研究的主要目的是为了表征达巴万星的药代动力学，并计算接受治疗剂量药物的健康对象的肾排泄程度。此为开放标记、非对比性研究。

研究药物治疗

[00314]将单个1000mg IV剂量的达巴万星经30分钟输注入18到65岁之间的健康男性或女性对象。

[00315]6名对象(1名女性和5名男性)入选，他们接受研究药物并完成研究的所有方面。3名对象为白种人，3名对象为美籍非洲人。平均年龄为29.8岁(从22岁到63岁)。平均高度为68.6英寸(从63英寸到75英寸)且平均体重为179.6磅(从140磅到244磅)。

药代动力学

[00316]在研究的第1、2、3、4、5、6、7、14、21、28和42天收集血液和尿(24小时收集)。将血样抽吸入肝素化的管中并进行离心。分离血浆，并于-20℃下冷冻储存直到检定时间。使用经验证的LC/MS/MS方法来检定血浆和尿样品中的达巴万星。尿和血浆定量检定的下限为500ng/mL。

[00317]使用WinNonlin软件(Pharsight Corportion)通过非房室法评估达巴万星药代动力学参数。峰浓度(C_max)值直接由观察的数据获得。使用线性梯形法则计算血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)。以剂量/AUC来计算清除率(CL)。通过log浓度对时间曲线的log-线性部分的线性回归来评估消除半衰期(t_1/2)。使用回归参数计算估计的分布体积(Vz)，同时由第一时刻曲线下面积(AUMC)乘以剂量且除以AUC来计算稳态下的分布体积(V_SS)。以尿排泄率的积分(AURC)来确定排泄于尿中的达巴万星累积量。以AURC/AUC的比率来计算CL_R或肾脏清除率：

CL_R＝AURC/AUC。

[00318]所有对象的达巴万星血浆浓度对时间的关系皆显示在图5中。药代动力学参数呈现在表23中。所有对象中的浓度是相似的。血浆峰值浓度约为300mg/L且在输注结束后立即达到。达巴万星显示大于10L的表观分布体积且因而认为其可在细胞外液中极好地分布。

[00319]达巴万星以9-12天的t_1/2缓慢地消除。总药物清除率为0.0431±0.0074L/hr。排泄于尿中的未变化药物部分估计为施用剂量的42％，且估计肾脏清除率为0.018L/h。在对象中所观察到的变异性很低且在所有药代动力学参数中的变异系数小于22％。

表23.药代动力学参数

  Cmax  mg/L  t_1/2  h  AUC  mg.h/L  V_z  L  CL  L/h  V_SS  L  AURC  mg    肾排泄    ％    CL_R    L/h平均SdCV％最小最大  301  65  21.6  243  394  257  21  8.1  227  282  23843  4526  19.0  19844  30100  16.0  3.1  19.5  11.7  19.6  0.0431  0.0074  17.1  0.0332  0.0504  11.5  2.13  18.6  8.58  13.9  419  27  6.4  379  448    41.9    2.7    6.4    37.9    44.8    0.0181    0.0036    20.1    0.0130    0.0226

安全性评估

[00320]记录不良事件并评估严重性及其与研究药物的关系。收集实验室数据(化学谱，CBC及分类，尿分析)，并评估自基线的变化与超出范围值。获得ECG、身体检查和生命体征，并评估自基线的变化。

[00321]达巴万星在此项研究中耐受性良好。在研究期间无对象死亡或严重不良事件的报导且没有由于AE而过早地从研究中退出的对象。

[00322]所有志愿者均报导出现了至少一起不良事件，所有的不良事件均为轻度。3名志愿者报导出现了可能与研究药物有关的不良事件：一对象出现升高的ALT(值46 IU/L，正常上限40 IU/L)；一对象出现以下所有的不良事件：嗜酸粒细胞增多(值0.5×10³/μL，正常上限0.4×10³/μL)，升高的LDH(值303 IU/L，正常上限90 IU/L)，升高的ALT(值54 IU/L，正常上限40 IU/L)，升高的AST(值42 IU/L，正常上限40 IU/L)；和一对象出现耳鸣。

[00323]没有发现基线后血液学、化学、生命体征和ECG结果的倾向。

讨论

[00324]单个1000mg IV剂量的达巴万星耐受良好。在单次经静脉内输注1000mg之后，大于45mg/l的达巴万星血浆浓度维持至少7天。此值高于已知的杀菌浓度(4-32mg/l)。此结果支持以每周一次的方案使用达巴万星。尿消除曲线表明肾脏排泄为重要的消除途径，大约40％在尿中排泄。此项发现与动物中的观察结果一致。由于肾脏并非唯一消除路线，对达巴万星的剂量调节在肾脏受损患者中可能不是必需的。

实施例4.肾损伤患者的达巴万星药代动力学

[00325]这些研究是开放标记的研究，进行这些研究以调查当对轻度、中度和重度肾损伤患者给药时，静脉内达巴万星的安全性和药代动力学。

研究药物治疗

[00326]年龄介于18到80岁之间的男性和女性患者适宜入选。患者必须在相对于性别、身高和体格的理想体重的-10％到+50％范围内。

药代动力学

[00327]在给药前至输注结束后至少2周时间内收集系列血样，并用经验证的LC-MS/MS法分析达巴万星。

[00328]非房室法评估达巴万星药代动力学参数。从观察到的数据直接获得峰浓度(C_max)。使用线性梯形法计算血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)。

[00329]具有健康肾功能的患者和具有最严重肾损伤的患者(重度RI)的药代动力学参数示于表24中。

表24.药代动力学参数

                                   给药方案药代动力学参数1000mg 1120mg 1000mg+ 500mg500mg重度RI^1000mg重度RI^*AUC(mg.h/L)24453+/-3711 25790+/-2447 33000｀24376+/-6615～48000｀AUC7(cm.h/L)13412+/-2120 13644+/-1305 12000｀6860+/-1613～14000｀AUC14(mg.h/L)17737+/-2325 20207+/-2122 23000｀10986+/-2817～22000｀AUC42(mg.h/L)23137+/-3326 33000｀～38000｀Cmax(mg/L)340+/-68 325+/-41 300｀137+/-22～300｀C7天(mg/L)40.9+/-5.2^@55.4+/-8.1 40｀～30-40～57｀C14天(mg/L)21.3+/-2.5^@22.8+/-1.9 40｀～40｀

^初步临床数据

*使用从曲线直接引用或外推的参数估计

｀基于模拟数据，或根据另一项研究推断；不直接引用在摘要中

AUC＝通过血浆浓度-时间曲线下面积估计的药物接触；

AUC7＝给药后7天或在整个治疗期间的药物接触；

AUC14＝给药后14天或在整个治疗期间的药物接触；

AUC42＝给药后42天或在整个治疗期间的药物接触；

C_max＝血浆中观察到的药物浓度的最大值；

C7＝在给药后7天、在另一个可能剂量给药前的药物浓度；

C14＝在给药后14天、在另一个可能剂量给药前的药物浓度；

讨论

[00330]对于重度肾损伤患者来说，给患者施用单剂量500或1000mg达巴万星。如表24中显而易见的是，在14天以后，施用了1000mg单剂量的重度肾损伤患者具有大约22000的AUC14(mg.h/L)，这个值出人意料地与施用1000mg+500mg两剂量给药方案的肾功能正常患者(AUC14mg.h/L为23000)极其类似。

[00331]对于轻度肾功能不全的患者来说，不需要进行达巴万星剂量调整。达巴万星浓度和药代动力学参数在轻度肾损伤和肾功能正常患者中类似。另外，达巴万星在正常肾功能患者或轻度肾功能受损患者中耐受良好。参见Dowell，J.等人在2003 ECCMID Meeting，Glasgow上发表的″Dalbavencin Dosage Adjustments Not Requiredfor Patients with Mild Renal Impairment″(Clinical Microbiologyand Infection，第9卷(增刊1)第291页；2003)，和Stogniew，M.等人在2003 ECCMID Meeting，Glasgow上发表的″PharmacokineticAttributes of Dalbavencin：Well Distributed and CompletelyEliminated with Dual Routes of Elimination″(ClinicalMicrobiology and Infection，第9卷(增刊1)第291-292页；2003)，这两篇文献都全文特别引入作为参考。

实施例5.肾损伤和末期肾病

[00332]达巴万星消除的主要途径是完整达巴万星和OH-达巴万星排泄到尿中，很有可能该药物用于各种程度肾损伤的患者。由于这个原因，在临床研究VER001-3、VER001-11和VER001-13中检查达巴万星在有各种程度肾损伤的患者体内的安全性和药代动力学。

[00333]当确定检测剂量(70mg)相对于为临床研究建议的较大的每周剂量太低时，临床研究VER001-3就早早地结束了(5名患者入选；3名患者接受了达巴万星)。临床研究VER001-13检查的是轻度和中度肾损伤的患者，临床研究VER001-11检查的是重度肾损伤患者和末期肾病(ESRD)患者。在所有研究中都包括匹配的对照患者。肾损伤用估计肌酸酐清除率来定义：轻度＝51-79mL/min，中度＝31-50mL/min，和重度≤30mL/min。整个研究过程中ESRD患者依赖于透析(每周3次)。在轻度和中度肾损伤患者中检查1000mg IV单剂量达巴万星，在ESRD患者中研究500mg剂量的达巴万星，在重度肾损伤患者中研究500和1000mg单剂量。

[00334]在这些肾损伤研究的每一个中，达巴万星都是耐受良好的。在各个研究组中观察到了报告不良事件的患者类似的百分数。所报告的不良事件大多数在严重程度上是轻度或中度，并且与研究药物不相关。在接受达巴万星的任何研究患者中不存在临床有意义的实验室混乱。

[00335]在临床研究VER001-13中，在60天的取样间隔内，达巴万星对肾功能正常患者和轻度肾损伤患者的给药导致了可比较的浓度-时间曲线。在整个相对治疗期中，给药后7天，在肾功能正常患者和轻度或中度肾损伤患者之间，浓度-时间曲线是可比较的。超过第14天，当浓度相对较低，且低于40mg/L时，在中度肾损伤患者中观察到了浓度的少量增加。这些患者施用1000mg达巴万星以后，他们的达巴万星血浆浓度-时间曲线显示在图18中。达巴万星药代动力学参数显示在表25中。对于轻度或中度肾损伤(CL_CR＞30mL/min)患者来说，不需要调节剂量。这些研究的结果与在群体药代动力学分析中研究的患者(CL_CR＞50mL/min)是一致的。

[00336]在临床研究VER001-11中，将达巴万星向肾功能正常患者、重度肾损伤患者和ESRD患者给药。在该研究中观察到的达巴万星浓度-时间曲线显示在图19中。在头12个小时，在肾功能正常患者以及重度肾损伤或ESRD患者之间，浓度是类似的，但在重度肾损伤患者中观察到了小的且逐渐增大的差异。在给药以后第一周，浓度增加≤40％，在曲线的剩余部分中，区别继续增大。将ESRD患者分成在第一次透析期之前或之后接受达巴万星的患者。在这两个亚组之间没有观察到浓度曲线的区别。然而，ESRD患者的浓度类似于肾功能正常患者，这表明由于有规律的定期透析(3次/周)代偿了肾功能不全。与该药物透析水平相应的透析液中的水平太小而无法测量。

[00337]将重度肾损伤患者和ESRD患者中的达巴万星药代动力学参数(VER001-11)与轻度或中度肾损伤患者(VER001-13)在表25中比较。在重度肾损伤患者中研究500和1000mg单剂量；浓度和暴露与剂量比例一致(图20，表25)。在相对治疗期中个体药物暴露(AUC_0-7天)通常跨越个体CL_CR而一致，只在重度肾损伤患者中观察到暴露少量增加(图21)。当检查整个浓度-时间曲线时，暴露的区别要大得多。在重度肾损伤患者中，向无限大外推的血浆浓度-时间曲线下面积(AUCo-inf)增加了97％。ESRD患者的AUCo-inf只有45％增加，这反映了有规律的定期透析部分代偿了肾功能不全。

[00338]根据药代动力学参数和基于数据的模拟，推荐对重度肾损伤患者调节剂量。剂量调节的目的在于使两剂量相对治疗期过程中(14天)的浓度和暴露匹配，同时将总体药物暴露最小化。在重度肾损伤患者中检查总共9个模拟给药方案。这些模拟的结果总结在图22中，该图显示了在相对治疗期过程中的暴露与总体暴露的比较。750mg达巴万星剂量，一周后接着250mg达巴万星，是对CL_cr＜30mL/min患者的推荐剂量调节。该给药方案维持浓度大于20mg/L，与肾功能正常患者观察到的治疗暴露相匹配，并将总体暴露最小化。图23显示出了模拟下列情况的达巴万星浓度-时间曲线：i)接受1000mg(第1天)+500mg(第8天)的肾功能正常患者，ii)接受1000mg(第1天)+500mg(第8天)的重度肾损伤患者，和iii)接受750mg(第1天)+250mg(第8天)的推荐调节剂量的重度肾损伤患者。接受有规律透析疗法(每周2到3次)的患者通过透析对药物的清除有一些代偿，不需要调节剂量。

表25.健康患者和肾损伤患者遵循单剂量达巴万星给药的达巴万星的药代动力学参数

平均值(±SD)轻度肾损伤(N＝6)中度肾损伤(N＝6)正常肾功能(N＝9)重度肾损伤(N＝6)重度肾损伤(N＝4)ESRD透析前(N＝3)ESRD透析(N＝3)正常肾功能(N＝6)正常肾功能(N＝3)研究VER001-13VER001-13VER001-13VER001-11VER001-11VER001-11VER001-11VER001-11VER001-2剂量mg)10001000100050010005005005001120C_max(mg/L)266.8(42.3)330.7(55.7)248.8(33.0)136.5(21.6)315.3(89.7)140.7(26.4)145.8(71.5)137.3(39.5)325(41)AUC_0-7天(mg.h/L)9714(1406)11050(2005)8992(1362)6077(1392)10653(1474)6069(1768)4969(1153) 5245(1661)13644(1305)AUC_0-14天(mg.h/L)15333(1884)18060(3065)13765(1986)10412(2658)18698(1780)10620(2881)8500(2297)7971(2422)20207(2122)AUCo-infmg.h/L)27047(4084)37665(7123)24561(5252)24074(6613)44497(11483)19772(5065)15587(6050)12219(3298)25790(2447)CL(L/h)0.0376(0.0048)0.0273(0.0045)0.0422(0.0079)0.0222(0.0064)0.0238(0.0068)0.0264(0.0063)0.0350(0.0113)0.0429(0.0092)0.0437(0.004)V_SS(L)16.5(3.3)14.7(2.1)18.5(3.6)13.2(2.9)14.2(0.8)12.8(3.4)14.6(3.2)15.0(4.2) 8.49(1.05)T_1/2(h)389(59)432(43)417(108)454(102)469(103)376(63)347(78)333(91)149(3.6)

实施例6.肝损伤

[00339]达巴万星既通过肾脏途径又通过非肾脏途径消除，且达巴万星将很有可能用于各种程度肝损伤的患者。在临床研究VER001-12中检查有各种程度肝损伤的患者中的达巴万星安全性和药代动力学。该研究包括有轻度、中度或重度肝损伤的其它方面健康的患者(Child-Pugh评分分别是5到6分，7到9分，和10到15分)，并匹配正常肝功能的对照患者。在第1天给患者施用单个1000mg IV剂量的达巴万星，接着在第8天施用500mg IV剂量的达巴万星。

[00340]达巴万星浓度和暴露不随肝损伤程度增加而增加(图24)。达巴万星向正常肝功能患者给药和向轻度肝损伤患者给药导致了在60天取样间隔内可比较的浓度-时间曲线。达巴万星向中度肝损伤患者和向重度肝损伤患者给药导致了当与正常肝功能患者相比时，观察到的浓度些微降低。在所有组中，该药物都是耐受良好的。

[00341]达巴万星对正常肝功能患者和轻度肝损伤患者的暴露是可比得上的(表26)。对于中度肝损伤患者和重度肝损伤患者来说，达巴万星暴露减少和CL增加的趋势是显而易见的。总的说来，药代动力学参数个体之间的变异性是低的，通常低于30％，尽管达巴万星药代动力学参数在较高肝损伤组和较低肝损伤组之间在统计学上不同，然而，暴露参数的范围有显著的重叠(图25)。

[00342]达巴万星药代动力学参数的改变似乎受药物分布容积的影响。分布容积以与CL和AUC相同的正比或反比方式增加。药物末期消除半衰期事实上在各个组之间没有变化。中度和重度肝损伤患者(他们有显著更多的腹水和水肿)有更大的药物分布容积，随后有略微较低的药物暴露。

[00343]各组之间曲线的浓度有重叠，在14天的预期治疗期内，所有组的平均浓度保持高于20mg/L。各组之间的药物暴露也有重叠(图25)。即使平均暴露降低，重度肝损伤患者在整个相对治疗期(14天)的药物暴露仍超过了治疗所需的参数。对于任何程度肝损伤患者来说，不需要调节达巴万星剂量。

表26.健康患者和肝损伤患者遵循第1天1000mg达巴万星和

第8天500mg达巴万星给药的达巴万星药代动力学参数

平均值(±SD)轻度肝损伤(N＝6)中度肝损伤(N＝6)重度肝损伤(N＝5)正常肝功能(N＝9)C_max1(mg/L)331.7(80.6)227.2(37.5)199.0(30.4)278.3(52.6)C_max2(mg/L)177.0(62.4)122.7(27.2)118.9(23.9)166.3(42.9)AUC_0-8天(mg.h/L)11146(3478)7710(1099)7561(1540)10577(2493)AUC_0-15天(mg.h/L)21158(5808)14826(1925)14112(2911)20473(4883)AUCo-inf(mg.h/L)33117(6479)23628(3527)21639(5940)33851(8184)CL(L/h)0.0466(0.0084)0.0647(0.0098)0.0736(0.0202)0.0466(0.0110)V_SS18.1(5.2)24.4(3.0)25.2(4.0)18.3(3.7)T_1/2(h)323(27)320(24)322(68)321(24)

实施例7.使用等温滴定微量热法测量达巴万星的蛋白结合

[00344]使用Microcal VP-ITC仪在20mM磷酸盐，150mM NaCl，25和37℃下，在pH7.4通过等温滴定微量热法(ITC)测量达巴万星与蛋白的结合。在标准实验中，将25×10μl蛋白(～150μM)注入含有达巴万星溶液(～5μM)的热量计单元(calorimeter cell)中。通过测量280nm的吸光度来测定蛋白和达巴万星的实际浓度。对照实验包括将蛋白注入缓冲液中(达巴万星不存在)以说明在相同条件下蛋白稀释所产生的热。为了进行对比，使用替考拉宁来进行类似的具有某些必要修改的实验。

[00345]用以下各蛋白来进行达巴万星实验：人白蛋白、狗白蛋白、大鼠白蛋白、牛白蛋白和人α-糖蛋白。用人白蛋白和α-糖蛋白来研究替考拉宁。在两种不同温度下结合亲和性的对比显示于表27中。

表27.表观结合亲和性的对比(Ka，×10⁵M^-1)

    25℃    37℃  达巴万星  人白蛋白    1.35(±0.2)    1.33(±0.15)  大鼠白蛋白    3.1(±0.5)    2.8(±1.8)  狗白蛋白    0.62(±0.09)    0.50(±0.13)  牛白蛋白    1.38(±0.14)  α一糖蛋白    1.84(±0.36)    4.8(±2.3)  替考拉宁  人白蛋白    0.96(± 0.08)  α一糖蛋白    0.07(±0.01)

所引用的±误差为由拟合常规所获得的标准偏差。

[00346]在对稀释的热进行校正之后，通过以标准MicrocalORIGIN软件包使用简单的单位点结合模型的非线性回归分析整合热效应。整合各次注射的原始数据(μcal/sec)经过加法得到总热效应，接着除以注射物量以得到kcal/mole注射物。相同的整合应用于对照稀释效应，且从实际滴定数据减去它。这提供了结合曲线的微分，其中结合程度与总释放(或吸收)热量成比例。接着就各种标准结合模型通过非线性回归法来分析它。最简单的模型假设简单的非竞争性结合平衡，且给出三个参数：

Ka(＝1/K_diss)为结合关联(解离常数)

ΔH＝结合的焓(与结合有关信号的大小)

N＝结合位点的数目(假设结合模型为正确的)

[00347]假设是非竞争性结合，N为使样品中所有可利用的结合位点饱和而需要的注射物的摩尔(相对)数。就达巴万星实验而言，达巴万星为“样品”，而蛋白(HSA等)为“注射物”。所述的初步结果表明结合为相对弱的且由于达巴万星较差的溶解性，要清楚测定结合化学计量(N)十分困难。然而，如图6所示，在所有状况下，数据与N＜1极好地拟合(意即小于1∶1蛋白∶达巴万星)。因此，N＝0.5的值意味着仅需要一半摩尔数的蛋白去结合所有达巴万星，正如所预期的。换句话说，每个蛋白表观结合两个达巴万星分子。达巴万星可能形成与蛋白1∶1结合的二聚体。结合化学计量建模结果表明两个达巴万星分子结合到一个蛋白分子，而替考拉宁与达巴万星不同，它呈现出1∶1的结合。

[00348]假设人血清白蛋白(6×10^-4M)和α-糖肽(1.5×1^-5M)的生理浓度，表28表示抗生素浓度在1-500μM范围内所计算出的结合百分数。为了使其与临床情况相关，人的达巴万星峰值浓度大约为300mg/L或165μM。

表28.经计算的替考拉宁和达巴万星与血浆蛋白的结合百分数

抗生素浓度(μM)达巴万星 替考拉宁人白蛋白1 98.8 98.310 98.8 98.3100 98.7 98.0165 98.6 ND250 98.5 ND500 98.0 ND人α-糖蛋白1 73.0 9.610 68.2 9.1100 26.2 6.0165 16.9 ND250 11.4 ND500 5.9 ND

ND＝未进行

[00349]在所述实验中，达巴万星结合到人血清白蛋白的量超过98％。结合分数在选定的达巴万星浓度范围即1-500μM内相当恒定。此范围涵盖了人的治疗浓度。达巴万星结合到α-糖蛋白的百分数远高于替考拉宁。达巴万星证实了对不同来源血浆蛋白的大容量和低亲和性，在来自被测试的所有种类的蛋白中有相似的Ka值。所述结果有助于解释达巴万星的某些独特的药代动力学特征。2∶1达巴万星∶蛋白复合物的结合和形成也解释了延长的半衰期和表观分布体积，它接近于细胞外水体积。低亲和性有助于解释观察到的体内活性，其大大超过了对游离分数接近1％的化合物所预期的活性。对血浆蛋白的大容量有助于解释虽然在生理pH值下化合物溶解性较差但却达到了相对高的血浆浓度。

实施例8.大鼠中达巴万星的药代动力学特质和组织分布

[00350]在施用单次IV输注20mg/kg[³H]-达巴万星的大鼠中进行两项研究。在给药后70天内收集排泄物和多于40个不同组织，且测定源自药物的放射性的组织分布和药代动力学。

[00351]将HPLC-纯化的[³H]-达巴万星用于所述研究中。经由氚交换产生放射性同位素标记的药物且通过HPLC将其纯化。

大鼠质量平衡研究

[00352]在向雄性大鼠单次静脉内(IV)输注达巴万星之后进行质量平衡研究以确定达巴万星的排泄模式。

[00353]15只雄性Sprague-Dawley大鼠接受单个IV剂量的³H-达巴万星(20mg/kg，100μCi/大鼠)。在给药之后，到给药后14、36和70天(3只大鼠/最终收集时间)以24小时间隔收集尿和粪便。也收集水和甲醇笼清洗物。在收集期结束时分析畜体。通过液体闪烁计数(LSC)分析所有样品的总放射性含量。

[00354]在向大鼠经静脉内施用³H-达巴万星之后，源自药物的放射性在尿(～2/3排泄的放射性)和粪便(～1/3排泄的放射性)中消除。第一周之内在尿和粪便中消除所施用的放射性的大约一半，其与大约一周的血浆t^1/2一致。在给药后的第70天，仅4.5％的剂量留在畜体中。在笼冲洗物中回收的放射性可忽略。实际上对研究期间所有施用的放射性都有说明(尿、粪便、畜体、笼冲洗物和氚交换)。

大鼠定量组织分布(QTD)研究

[00355]在达巴万星单次IV输注入雄性大鼠之后进行定量组织分布研究以评估达巴万星的组织分布。

[00356]41只雄性Sprague-Dawley大鼠接受³H-达巴万星的单次IV输注(20mg/Kg，50μCi/大鼠)。在给药后第12、24、48、72、96、120、144、168、336、840、1176和1680小时对大鼠(每个时间点3只)施行安乐死以收集血液、血浆和组织(包括畜体)。通过LSC分析所有样品。

[00357]确定包括肾、肝、脾、血液、血浆、肺和皮肤在内的多于40个组织的浓度-时间曲线。包括皮肤在内的组织中源自药物的放射性的浓度和t_1/2值与在血浆中所观察到的相当。发现在注入后12小时内达巴万星快速且广泛地分布于所有组织中，且同时组织中具有可计量浓度的源自药物的放射性。在给药后24h内大多数组织达到最大浓度(C_max)。5天后在任何单个组织中回收的放射性＜剂量的5％。到给药后第70天，仅畜体保持＞1％(2.34％)施用的放射性。因此，达巴万星不在任何单个组织、器官和血液细胞组分中蓄聚。在此健康动物模型中CNS中的放射性浓度较低但可检测。发现达巴万星透过皮肤且伴随等于或高于血浆中浓度的源自药物的放射性浓度。随着时间源自药物的放射性的血液与血浆比率维持相对恒定且＜1。

[00358]作为QTD研究的一部分，在给药后的384h(16天)中收集来自胆管插管大鼠(4只动物)的胆汁样品。给药后经过384h几乎11％的剂量在胆汁中回收。这代表了在粪便中发现的大多数源自药物的放射性。

实施例9.达巴万星的药效活性

[00359]抗菌疗法的目的是在感染部位提供活性浓度足够的时间，以根除侵入的病原体。在体外评价抗菌活性的主要方法是测定最小抑菌浓度和最小杀菌浓度(MIC和MBC)。然而，这些参数只测量规定培养期的净效应，并不表征抗菌活性的时间过程。MBC不测定通过增加药物浓度是否可以增强杀菌活性的等级和范围。此外，MIC测定并不测量停药后是否持续对细菌存在抑制作用。

[00360]增加数量的研究提出，杀菌活性率、它对浓度或暴露时间的依赖性、以及后效作用的存在与否更清楚地描述了抗菌活性的时间过程，并且对于确定最佳给药方案来说是重要的药效参数。例如，β-内酰胺类抗生素杀菌显示出了很低的浓度依赖性，且杀菌程度主要是由于暴露的持续时间。另外，β-内酰胺类产生短的或不存在对革兰氏阴性杆菌的后效作用(PAE)。因此，人们可以预期，维持药物水平高于MIC足够时间的给药方案将具有最佳效力。在多个动物模型中已经证明了这一点。另一方面，氟喹诺酮类具有浓度依赖性杀菌作用，并产生延长的体内后效作用。人们可以预期，药物的量，而不是给药频率，将是这些药物效力的重要决定因素。在多个动物模型中也已经证明了这一点。更重要的是，对于β-内酰胺类和氟喹诺酮类效力所必需的药代动力学/药效学参数的大小在动物感染模型和人类感染中是相似的。

[00361]设计下列研究来表征达巴万星的体内药效学特征。在中性粒细胞减少小鼠的实验性股感染模型中，测定给药方案对达巴万星体内效力的影响。也进行研究以调查：[1]何种药代动力学参数(峰血清水平、浓度对时间曲线下面积(AUC)、超过MIC的血清水平持续时间)最好地预测达巴万星的效力，和[2]在常见革兰氏阳性菌包括耐青霉素的肺炎球菌和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌之中，效力所需的PK/PD参数大小是否相似。最后，在股感染模型和肺炎感染模型中测量感染部位对达巴万星对抗肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的活性的影响。

研究生物体和达巴万星的MIC

[00362]将研究生物体和它们对达巴万星的MIC列于表29中。用标准NCCLS微量稀释法技术在MHB中测定MIC。用3％溶解的马血补充MHB，用于对肺炎链球菌的MIC测定。所有的MIC都进行至少一式两份。

表29.达巴万星对抗肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌菌株的体外活性

生物体达巴万星MIC/MBC(mg/L)青霉素MIC(mg/L)甲氧西林MIC(mg/L)肺炎链球菌菌株11990.0041.0-12930.0042.0-13250.0082.0-13290.0082.0-108130.030.008-金黄色葡萄球菌菌株259230.12/0.50-0.12335910.12/0.25-＞8.0310050.06/0.25-0.12MRSA0.12/0.25-＞8.0Smith0.06/0.50-0.123071090.06/0.12-＞8.0

[00363]利用5种肺炎球菌和6种葡萄球菌生物体。对肺炎球菌的达巴万星MIC范围是0.004-0.03mg/L。对金黄色葡萄球菌分离株的MIC范围比对肺炎球菌的MIC范围更窄和更高，是0.06-0.12mg/L。

药代动力学

[00364]在股-感染的中性粒细胞减少的Swiss ICR小鼠中，达巴万星的血浆药代动力学显示在图44中。注射环磷酰胺：在研究之前4天150mg/kg，研究之前1天100mg/kg和在开始感染之后每48h注射100mg/kg，直至研究结束，由此产生在该研究和所有其它研究中的中性粒细胞减少症。在研究的持续期中，中性粒细胞计数保持低于100/mm³。研究2.5、5、10、20、40和80mg/kg的剂量。通过腹腔内注射0.2ml体积来施用药物。给药后0.5、1、2、4、6、24、48、72和96小时，通过眶后抽吸从每组三只小鼠中取血到肝素抗凝测定用毛细管中。分离血浆，用枯草杆菌作为试验生物体，使用微生物学测定来测量达巴万星血浆浓度。到4-6h观察到峰值。用线性最小二乘法回归确定达巴万星半衰期。用梯形法从平均浓度计算AUC。在24、36、48、72、96h估算AUC，并将AUC外推到无穷大。将6-天AUC除以6计算24h AUC。达巴万星具有线性药代动力学。半衰期被延长，从7.6到13.1小时不同。

蛋白结合

[00365]通过比较肉汤、感染的小鼠血清、人血清、和白蛋白中达巴万星对两种金黄色葡萄球菌菌株的MIC，研究药物结合到血清和血清蛋白的影响(表30)。在肉汤中对两种菌株的MIC是0.12mg/L。95％小鼠血清中的MIC(算术)增加到32mg/L。小鼠血清超滤液中的MIC只增加到0.5mg/L，这意味着MIC的大部分区别在于蛋白结合。用人血清和白蛋白进行的类似的研究导致只增加到8mg/L。基于肉汤和小鼠血清之间的MIC区别，估计蛋白结合程度是99.6％。在随后的药效学分析中考虑该结合程度。估计人血清中的结合程度是96％。

表30.血清、血清超滤液和人白蛋白对达巴万星对抗所选的金黄色葡萄球菌菌株的体外活性的影响

生物体MIC肉汤MIC 95％小鼠血清MIC 95％人血清MIC 95％人白蛋白MIC 95％小鼠血清超滤液金黄色葡萄球菌菌株259230.12328.08.00.5MRSA0.12328.08.00.5

感染模型

[00366]在贯穿不同研究中，鼠股感染模型用于所有生物体。在该良好建立的模型中，在开始治疗以前2小时，将大约10⁶cfu的研究生物体注射到一只或两只股(以0.1ml)内。在随后的研究中，治疗开始时股内的生物体数量变化范围为10^7.15-7.59cfu/股。鼠肺部感染模型只用于肺炎链球菌或金黄色葡萄球菌的单一分离株。在该模型中，经由麻醉小鼠的鼻孔，通过鼻内接种50μl(大约10^8.5cfu/ml)感染小鼠。接种后2小时开始治疗，这时，小鼠具有10^2.4-7.6cfu/肺。

体内杀菌时间

[00367]单剂量达巴万星随着时间对体内杀灭肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌菌株的影响显示在图45和46中。各点代表4股的平均值。使用范围为16倍的5个剂量水平。在该研究中使用的对抗金黄色葡萄球菌的剂量水平范围是5-80mg/kg。在该研究中使用的对抗肺炎链球菌的剂量水平范围是0.625-10mg/kg。对这两个菌种的杀灭程度是很广泛的(＞2对数，用所研究的最高剂量)。然而，杀灭肺炎球菌分离株的程度和比率要大于葡萄球菌菌株。用两个最高剂量达巴万星进行的研究导致杀灭了金黄色葡萄球菌。在该研究中使用的对抗肺炎链球菌的5个剂量水平中的3个降低了受感染小鼠股内的生物体负荷将近4log。

给药方案研究

[00368]在这些研究中，改变剂量和给药间隔的多个给药方案以0.2ml体积经腹膜内对各组小鼠给药144h(6天)。所选的给药间隔是12、24、36和72小时。使用5种不同的剂量(2倍增加)。对抗金黄色葡萄球菌的研究利用总剂量(mg/kg/6天)水平范围是30-480mg/kg/6天。对抗肺炎链球菌的研究利用总剂量(mg/kg/6天)水平范围是0.6125-10mg/kg/6天。图47和48图解说明了在中性粒细胞减少症小鼠的股内，达巴万星以不同给药间隔对肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌菌株的剂量反应曲线。各点代表4只股的平均值。一般而言，增大的给药间隔导致剂量反应曲线稍微向左移，表明频率较低地施用大剂量的给药方案更有效。

[00369]也使用最大效应模型在数学上表征各个剂量反应曲线。该方法使用希尔方程，通过非线性回归估计最大效应(Emax)、获得50％Emax所需的剂量(P50)、和剂量反应关系斜率。然后从这些参数我们可以计算出经过144小时治疗期间产生净抑菌效果所需的剂量，以及产生生物体负荷1和2对数降低所必需的剂量。对于各个药物生物体组合以及不同给药方案的抑菌剂量和与1和2对数杀灭有关的剂量显示在表31中。

表31.在肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌感染模型中，对于四个不同给药间隔，达到净抑菌作用、1和2对数杀灭所需的达巴万星剂量。

  q 12hq 24h q 36h  q 72h  生物体  SD  ng/kg  (95％CI)1对数杀灭ng/kg(95％CI)  2对数杀灭  mg/kg  (95％CI)SDng/kg(95％CI)  1对数杀灭  ng/kg  (95％CI)  2对数杀灭  ng/kg  (95％CI) SD ng/kg (95％CI)  1对数杀灭  ng/kg  (95％CI)  2对数杀灭  ng/kg  (95％CI)  SD  ng/kg  (95％CI)  1对数杀灭  ng/kg  (95％CI)  2对数杀灭  ng/kg  (95％CI) SP10813  2.3  (1.9-2.7) 2.8(2.3-3.3)  3.5  (2.8-4.2)1.34(1.14-1.57)  1.54  (1.34-1.74)  1.75  (1.47-2.03) 1.26 (1.16-1.36)  1.53  (1.41-1.65)  1.81  (1.67-1.95)  0.71  (.64-1.88)  0.77  (.59-1.95)  0.82  (.62-1.02) SA29213  80  (8-152) -   -26(-39-91)  267  (-400-934)  - 15 (-14-44)  36  (-34-106)  122  (-117-361)  10  (18-38)  31  (-55-117)  128  (-230-486)

剂量表示成经过6天时间的总剂量(mg/kg)

[00370]在对抗肺炎链球菌的研究中，将剂量方案从12提高到36小时没有导致与三种微生物学端点有关的剂量的显著改变。然而，以72h给药间隔的效力需要较少的药物。在对抗金黄色葡萄球菌的研究中观察到了类似的关系。对金黄色葡萄球菌产生1和2对数杀灭的唯一给药方案是36和72h间隔。

与效力相关的药效学参数

[00371]对于所研究的每一个给药方案来说，通过将144小时治疗结束时股内的细菌数目与下列参数相关联，我们确定哪一个PK/PD参数与效力最相关：[1]峰值/MIC之比，[2]AUC/MIC之比，和[3]血清水平超过MIC的给药间隔百分数。从最接近的研究剂量的值推断没有特别研究的那些剂量的PK/PD参数值。对于肺炎链球菌来说，log cfu每只股和峰值/MIC之比，24-小时AUC/MIC之比和血清水平超过MIC的时间百分数之间的关系在图49中说明，对于金黄色葡萄球菌来说，在图50中说明。每个点代表四只股的平均值。对于这两种生物体来说，对24-hr AUC/MIC和峰值/MIC之比观察到了强烈关联。然而，24hAUC/MIC之比数据的回归导致了最强关联。也通过上述同样的最大剂量反应模型分析这些图中列出的数据，除了不同的PK/PD参数用于代替剂量之外。R²代表对效能和各PK/PD参数之间的关系观察到的决定系数。决定系数(或R²)代表细菌数变异百分数，它可以归因于各PK/PD参数，且对于AUC/MIC和C_max/MIC都很高。

PK/PD参数大小或靶

[00372]为了确定抑菌作用所需的AUC/MIC对多个病原体是否类似，我们研究了治疗6天以后，达巴万星对抗5种肺炎链球菌菌株和6种金黄色葡萄球菌菌株的24-和72-小时给药方案的体内活性。达巴万星对抗这些不同菌株的剂量反应曲线显示在图51和52中。在图51和52中，剂量用经过6天研究期间的游离药物平均24h AUC/MIC之比来表示。一般而言，所有菌株的剂量反应曲线的形状是相似的。剂量反应曲线的定位与生物体的MIC有关。然而，二对肺炎球菌生物体的剂量反应曲线稍微向左移。该曲线的位移说明了对抗肺炎球菌比对抗葡萄球菌的效力需要较少的药物。抑菌剂量、1对数和2对数杀灭、以及相关的游离药物24-hr AUC/MIC和C_max/MIC显示在表32中。对于大多数菌株来说，细菌杀灭程度相对类似。在6天的研究中，所有菌株都表现出了超过4log₁₀的cfu下降。

表32.达巴万星对抗肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的效力。

    生物体 MIC/MBC (mg，L)                  抑菌作用             1对数杀灭             2对数杀灭    q 24h方    案mg/kg24b  f24AUC/  MICf24AUC/MBC mg/kg 24b    f24AUC/    MICf24AUC/MBC   mg/kg   24bf24AUC/MICf24AUC/MBC    SP119    9 0.0040.40  16.0 0.49    19.4   0.5722.7    SP129    3 0.0040.44  17.4 0.55    21.7   0.6525.9    SP132    5 0.0081.46  29.0 1.6    31.8   1.7334.5    SP132    9 0.0080.90  18.0 1.18    23.5   1.4526.7    SP108    13 0.031.34  7.5 1.54    8.7   1.759.9    平均值±    SD0.91±0.44  17.6±6.9 1.1± 0.47    21±7.4   1.23±0.5   224.3±8.2    SA259    23 0.12/0.2542.7  21652 51.2    25060   6028969.3    SA335    91 0.12/0.2522.3  96.246 27.7    1.2158.3   33.515774.3    SA310    05 0.06/0.1249.3  483242 -    --   ---    MRSA 0.06/0.2537.7  37490 45.3    452109   53.5519125    SA    Smith 0.12/0.2533.5  15675 50.7    248119   73.5361173    平均值±    SD37.1±9.1  265±143101±72 43.7± 9.5    268±11986.6±27.6   55±14332±131110±42    q 72h方    案mg/kg/72h    SP132    5  0.0080.83  6.0 0.99    8.8   1.1617.6    SP129    3  0.0041.01  14.1 1.28    18   1.6823.8

    SP119    9 0.0040.72 10.3  0.85 12.1 0.99  35.3    SP139    6 0.0080.52 4.0  0.61 4.3 0.69  4.8    SP10    813 0.030.71 1.4  0.77 1.6 0.82  1.6    平均值±    SD0.77±0.18 7.2±4.5  0.93±0.  24 9.0±5.8 1.13±0. 36  16.6±12.3    SA25    923 0.12/0.50160 274 66  185 317  76.1 214  367  88.1    SA33    591 0.12/0.2574 123 59  93 160  76.6 114  195  94    MRS    A 0.06/0.2543 147 35.3  62 202  48.8 85  292  70    SA    Smith 0.12/0.2559 96 46.1  95 163  78.0 148  254  22    SA30    7109 0.06/0.5031 94 11.3  34 108  12.9 37  121  14.6    SA31    005 0.06/0.1267.7 223 112  94.6 325  163 127  364  2l.7    平均值±    SD72±41 160±67 55±31  94±46 213±8.14  75.9±45.  2 120±54  266±88  101±61

[00373]对于利用每24h给药的达巴万星方案来说，与对抗肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌抑菌作用有关的游离药物24h AUC/MIC值分别是17.6±6.9和265±143。剂量反应曲线是陡峭的，且与1和2对数杀灭相关的24h AUC/MIC值不明显较高。如剂量反应曲线所示，根据24h AUC/MIC，对抗肺炎球菌的疗法需要12-23倍更少的药物。对于金黄色葡萄球菌来说，MBC比MIC高2-4倍。如果考虑到金黄色葡萄球菌的AUC/MBc，所述值仅比肺炎链球菌高4-8倍。

[00374]对于利用较低给药频率(每72h)的给药方案来说，与对抗肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌抑菌作用有关的游离药物24hAUC/MIC值分别是7.2±4.5和160±67。对于更大间隔的给药方案来说，达到三个体内微生物学端点(抑茵剂量、1和2对数杀灭)所必需的PK/PD大小是较低的。当每72h施用达巴万星时，与不同端点有关的24h AUC/MIC值比每24h给药时低1.3-2.4倍。

[00375]肺炎链球菌的青霉素耐药和金黄色葡萄球菌的甲氧西林耐药不影响达巴万星效能所需的24h AUC/MIC。

中性粒细胞对达巴万星活性的影响

[00376]为了确定中性粒细胞对达巴万星活性的影响，我们在感染了肺炎链球菌的正常小鼠和中性粒细胞减少小鼠中比较24小时给药的剂量反应曲线。随后的剂量反应曲线显示在图53中。每个点代表4只股的平均值。使用希尔方程，从通过非线性回归估计的参数计算抑菌剂量和与1和2对数杀灭相关的剂量。在正常小鼠和中性粒细胞减少小鼠中达到这些端点所需的剂量(mg/kg/6天)显示在表33中。中性粒细胞的存在导致效力所需的剂量降低了1.7到2.1倍。然而，这些差异不是统计学显著的。

表33.中性粒细胞对达巴万星对抗肺炎链球菌的体内效力的影响。

SD mg/kg(95％CI)1对数杀灭mg/kg(95％CI)2对数杀灭mg/kg(95％CI)正常的2.03(1.99-2.07)2.35(2.26-2.44)2.66(2.56-2.76)中性粒细胞减少的4.13(0.23-8.0)4.38(0.28-8.50)4.62(0.32-8.90)

感染部位对达巴万星活性的影响

[00377]为了确定感染部位对达巴万星活性的影响，我们在股感染模型和肺部感染模型中比较了24小时给药的剂量反应曲线(图54)。在这些模型中都使用肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌。在利用肺炎链球菌的两种模型中，剂量反应曲线几乎相同。在类似的对抗金黄色葡萄球菌的研究中，肺部模型中的剂量反应曲线向左移，这意味着在该感染部位的效力需要较少的药物。然而，在葡萄球菌的研究中，置信区间很大，且这些差异并不显著。

结论

[00378]以上研究已经表征了达巴万星对抗多种病原体的体内药效活性。这些可以总结如下：

-在股和肺部感染模型中，达巴万星对肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌都产生了体内杀菌活性。

-达巴万星的效力是剂量依赖性的。

-剂量依赖性PK/PD参数-24h AUC/MIC和C_max/MIC都与达巴万星体内活性强烈关联。剂量响应数据与24h AUC/MIC参数的回归导致了最高的决定系数。在这些模型中，最大给药间隔疗法更有效。

-在所研究物种内的菌株之间，与微生物学作用相关的24hAUC/MIC值是相似的。肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的β-内酰胺耐药性不影响达巴万星的体内活性。

-对抗肺炎链球菌的效力比对抗金黄色葡萄球菌的效力需要较低的24h AUC/MIC值。这可部分用MIC和MBC的物种差异来解释。

-对抗肺炎链球菌的效力，无论是否基于净抑菌作用，在这些感染模型中经过6天的治疗，1和2对数杀灭需要游离药物AUC/MIC将近100。对抗金黄色葡萄球菌的效力，基于同样的作用，经过6天需要游离药物AUC/MIC将近1000。

-中性粒细胞减少症对达巴万星体内活性的影响极小。

实施例10.通过HPLC-MS/MS来定量确定血浆中的达巴万星

[00379]如下所述，开发HPLC-MS/MS方法来定量测量血浆中的达巴万星。

达巴万星校准和质量控制标准的制备

[00380]在通过将达巴万星溶解于去离子水中以制备1000μg/ml溶液来制备达巴万星储备溶液之后，在去离子水中进行连续稀释以制备500、50和10μg/ml溶液。

[00381]通过以如上所述制备的1000μg/ml达巴万星储备溶液使人血浆形成峰值来制备100、60和40μg/ml达巴万星浓度的校准标准。通过以适当体积500μg/ml达巴万星的储备溶液使人血浆形成峰值来制备20和10μg/ml浓度的校准标准，和通过以适当体积10μg/ml储备溶液使人血浆形成峰值来制备0.5μg/ml的校准标准。

[00382]通过以适当体积如上所述制备的1000μg/ml达巴万星的储备溶液使人血浆形成峰值制备90和30μg/ml达巴万星的质量控制标准。通过以适当体积50μg/ml溶液使人血浆形成峰值来制备1.5μg/ml的质量控制标准。

内标工作溶液的制备

[00383]30μg/ml内标工作溶液BI-K0098为A-40926的二乙基-氨基-丙基-氨基衍生物，其是由如下操作来制备。将大约10mgBI-K0098溶解于大约10ml流动相A(80％的10mM甲酸铵/甲酸，pH3(v/v)，10％乙腈(v/v)和10％2-丙醇(v/v))中以得到1000μg/ml内标储备溶液。接着以流动相A将储备溶液(300μl)稀释到体积10ml以得到30μg/ml内标溶液。

分析样品的制备

[00384]如下所述制备用于定量测定血浆中达巴万星浓度的样品。将100μl的内标工作标准溶液添加到50μl如上所制备的校准或质量控制标准液中并混合。允许混合物在室温下平衡5分钟，随后添加250μl乙腈。接着将混合物涡流10秒，随后在ALCmicro-centrifugette 4214上以约10,000rpm的转速离心1分钟。将上清液转移到清洁的试管中且在Savant Speed-Vac系统中于约40℃下蒸发至干燥。接着将样品悬浮于150μl的流动相A中。

分析方法

[00385]将如上所述出于分析而制备的50μl样品注入Phenomenex Jupiter C18柱(50×2mm，C185μm 300A)中，  且以流动速率0.3ml/min在梯度HPLC条件下进行分析。梯度条件为：最初，80％流动相A/20％流动相B(20％10mM甲酸铵/甲酸，pH3(v/v)，40％乙腈(v/v)，40％2-丙醇(v/v))；1分钟，20％流动相A/80％流动相B；2分钟，20％流动相A/80％流动相B；2.5分钟，回到最初条件。

[00386]将HPLC系统偶联到PE SCIEX API-2000三倍四极质谱仪中，以阳性离子化模式操作涡轮离子喷雾。使用空气以产生离子源的喷雾。将探针温度设于500℃且以氮作为气帘气体。使用氮作为碰撞气体来利用多反应监测(MRM)。通过以下离子迁移来检测分析物：达巴万星为909.3Da→1429.3Da，且内标为923.3Da→1457.3Da(BI-K0098)。为了避免质谱仪受到污染，在层析操作开始的第1分钟和2.5分钟执行柱后分流。

[00387]将样品控制软件(Software Sample Control)1.4用于数据分析的获取且将MacQuan 1.6软件用于色谱图峰值的综合和统计数据评价。

校准曲线

[00388]通过检定校准标准来评估检定方法的线性以产生校准曲线。通过计算达巴万星与内标之间的峰面积比率确定血浆样品中达巴万星的浓度。

[00389]使用等式y＝A+Bx(1/x加权)构建在0.5-100μg达巴万星/ml人血浆的分析范围内达巴万星浓度的校准曲线，其中A表示曲线截距，B表示曲线斜率，x表示校准标准的达巴万星浓度(μg/ml)，且y表示达巴万星与内标的峰面积比。构建三个分离的校准曲线。结果显示达巴万星/内标面积比及达巴万星浓度在分析范围内呈线性变化。定量的下限(LLOQ)为0.5μg达巴万星/ml人血浆。校准曲线的斜率为可复现的且其相关系数大于0.9995。

血浆中达巴万星的稳定性

[00390]通过分析如上所制备的人血浆样品的三个复制质量控制标准来测定血浆样品中达巴万星的稳定性，所述人血浆样品为两种不同浓度，分别为1.5和90ug/ml。在三个周期的冻融处理之后可检测的达巴万星浓度为稳定的。室温下24小时后在处理样品中的达巴万星浓度为稳定的。未观察到关于时间零点样品的达巴万星浓度的降低。

实施例11.达巴万星质谱分析

[00391]调查溶液中达巴万星多聚体的性质且通过电喷雾离子质谱法(ESI-MS)确定对达巴万星多聚体与达巴万星单体的总体比率有影响的条件。

[00392]使用配备有TurboIonSpray来源、Triple Quadrupole分析器且在阳离子模式中操作的Applied Biosystem API III+质谱仪执行实验。优选条件列于如下表34中。

表34：用于Applied Biosystem API 111+质谱仪上达巴万星分析的仪器条件。

离子喷雾来源：  MS分析器：离子喷雾电压孔板电压气帘气体流量喷雾气体流量流体流量界面加热器扫描条件(Q1扫描)：步进(Step)停留时间5000V80V0.6L/min1.2L/min5μL/min60℃0.1amu1msec  界面盘电压  Q0路线偏移电压  Q1放置质量(park mass)  Q1解析度  Q1Δ质量(delta mass)  Q1路线偏移电压  透镜7电压  Q2路线偏移电压  Q3放置质量  Q3解析度  Q3Δ质量  Q3路线偏移电压  透镜9电压  法拉第(Faraday)盘电压  通道电子倍增器电压650V40V1000120.80.227V-50V-50V10001100-70V-250V-250V-3800V

达巴万星溶液

[00393]对含有0.1mg/ml溶于8∶2水∶异丙醇溶液的达巴万星的达巴万星溶液调整仪器参数。在溶液直接注射之后获得的溶液中光谱范围为500-2000amu的达巴万星。如图7中所示所得光谱表明达巴万星多聚体的存在。作为非限制性实施例，光谱的一个迹线可归因于B₀的均聚物，其作为(2nM+y(⁺3))离子种类存在，其中n为正整数，表示均聚物的多重性，举例而言，当多聚体为同型二聚体时，n＝1；且当多聚体为同型四聚体时，n＝2，M表示单体的质量，y＝n且⁺3表示加上的三个离子电荷。例如，当n＝1，y＝1且M＝B₀的质量时，提供B₀的同型二聚体。将此二聚体种类归属于质谱中(2M⁺3)离子迹线。

达巴万星浓度对达巴万星多聚体与单体的总体比率的影响

[00394]使用上述条件通过质谱学评价达巴万星浓度对多聚体与单体的总体比率的影响。通过直接注入浓度为20、40、60和80μg/mL的达巴万星溶液来获得光谱。据报导将主峰强度作为达巴万星浓度的函数且如图8所示测定达巴万星多聚体与单体的总体比率。

[00395]数据表明达巴万星多聚体与达巴万星单体的总体比率随着浓度增加而增加。此可有助于解释可施用于个体的药物的大负荷容量。多聚体作为单体贮库的作用可减少高浓度样品形成沉淀物的趋势且提高可施用于个体的浓度。多聚体的存在也可允许达巴万星的剂量快速地施用于个体。

[00396]例如，如图7所示，通过测定离子A与B峰强度之间的比率提供测定达巴万星多聚体与单体的总体比率的方法中的非限制性实例。以峰A强度除以峰B强度提供达巴万星多聚体与单体的总体比率的测量值。

pH对达巴万星多聚体与单体的总体比率的影响

[00397]在上述仪器条件和在以下溶液pH值：2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5下评价溶液pH值对达巴万星多聚体与单体的总体比率的影响。如图9所示在每个pH值下测定达巴万星多聚体与单体的总体比率且将pH值绘成线。确定达巴万星多聚体与单体的总体比率随着pH值的增加而增加。

[00398]不受理论限制，据信离子基团(例如，在第一达巴万星单体上的羧酸基团)通过与在第二达巴万星单体上相反电荷的离子(例如，叔氮基团)形成离子相互作用而有助于达巴万星多聚体的稳定。所述离子相互作用可受到pH值的影响。据信在较高pH值下达巴万星作为多聚体存在的增加的趋势表明离子间相互作用在多聚体稳定性中很重要。特别是，据信达巴万星多聚体在较低pH值下去稳定，估计可能是由于促成多聚体稳定性的离子相互作用的干扰，由于特定的官能基(例如，羧酸基团)可在较低pH值下质子化。

溶液离子强度对达巴万星多聚体与单体的总体比率的影响

[00399]通过质谱学确定溶液离子强度对达巴万星多聚体与单体的总体比率的影响。使用Ultramark 1621、咖啡碱和MRFA(L-蛋氨酰基-精氨酰基-苯基丙氨酰-精氨酸)在先前以电喷雾模式调整及校准的Finnigan LCQ^Deca离子阱仪器上获得电喷雾阳极模式的质谱。使用表35所列条件记录所有质谱。所要调查的样品参数列于表36中。

表35.MS条件

样品输入条件：毛细管温度(℃)：Sheat Gas(N₂，任意单位)：    200    40样品输入电压设置：极性：源电压(kV)：毛细管电压(V)：管子透镜偏移(V)：    阳极    4.70    34    -60

全扫描条件：扫描范围(amu)：微扫描数目：最长离子时间(ms)：    500-2000    3    200高分辨扫描条件：扫描范围(amu)：微扫描数目：最长离子时间(ms)：    1218-1228    5    50

表36.样品参数

样品μg/mL 溶剂 pH达巴万星100 COO^-NH₄⁺5mM 5100 COO^-NH₄⁺50mM 5100 COO^-NH₄⁺100mM 5

[00400]经由Harward注射泵以10μL/min的速度注入样品水溶液且获得如图10-12所示的质谱。

[00401]所获得的质谱表明达巴万星多聚体与单体的总体比率受到离子强度的影响。发现缓冲剂浓度的增加对应于多聚体质量迹线的降低及由此达巴万星多聚体到单体人群比率的降低。

[00402]如文中所述，据信离子相互作用在达巴万星多聚体稳定性中十分重要。增加的离子强度与多聚体质量迹线强度降低有关这一事实证实了离子相互作用在多聚体稳定性中的作用。然而，由于在较高离子强度下仍存在多聚体质量迹线，多聚体稳定可涉及另一个第二相互作用。

[00403]在不受任何理论限制的情况下，据信疏水相互作用在稳定达巴万星多聚体种类中十分重要。若所述非共价达巴万星多聚体的稳定性仅是由于离子相互作用，则希望离子强度的增加将导致多聚体质量种类的全部丧失。换言之，预期随着溶液离子强度的增加，稳定多聚体的离子相互作用将由于溶液中增加的离子总数受到破坏，其单体将更易于缔合。因此，溶液离子强度将使多聚体分解为单体组分且所得质谱将不含任何的多聚体质量迹线。然而，甚至在高溶液离子强度(例如，100mM甲酸铵)下，也可在质谱中侦测到达巴万星多聚体的存在。因此，认为达巴万星多聚体至少部分由于疏水性相互作用而稳定。

结构类似的化合物

[00404]据信达巴万星改良的功效至少部分是由于其形成多聚体的能力。认为即使结构非常类似的化合物也不具有所述的独特特征，通过质谱分析调查具有化学结构类似于达巴万星的化合物形成多聚体的能力。使用Ultramark 1621、咖啡碱和MRFA(L-蛋氨酰基-精氨酰基-苯基丙氨酰-精氨酸)在先前以电喷雾模式调整和校准的FinniganLCQDeca离子阱仪器上获得电喷雾阳极模式的质谱。使用表37所列条件记录所有质谱。所调查的样品参数列于表38中。经由Harward注射泵以10μL/min的速度注入样品水溶液且获得如图13和14所示的质谱。

表37.质谱条件

样品输入条件：毛细管温度(℃)：Sheat Gas(N₂，任意单位)：    200    40样品输入电压设置：极性：源电压(kV)：毛细管电压(V)：管子透镜偏移(V)：    阳极    4.70    34    -60全扫描条件：扫描范围(amu)：微扫描的数目：最长离子时间(ms)：    500-2000    3    200高分辨扫描条件：扫描范围(amu)：微扫描数目：最长离子时间(ms)：    1218-1228    5    50

表16.样品参数

样品μg/mL 溶剂pH替考拉宁50 H₂On.a.100 H₂On.a.

n.a.＝未调节

[00405]类似的糖肽抗生素(替考拉宁)在各种浓度溶液中不显示多聚体复合物。此结果支持结构类似化合物不能在溶液中形成多聚体种类的指示，且此现象可在达巴万星活性中发挥重要作用。

实施例12.蛋白-达巴万星复合物的基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱学

[00406]将10μl HSA，0.150mM与10μl达巴万星溶液(从0.075mM、0.15mM、0.3mM到1.5mM)混合且于37℃下温育60分钟。使用干燥小滴技术制备分析用的样品。在先前使用标准牛血清白蛋白调整和校准的BRUKER FLEX III、飞行时间质谱仪上获得质谱，获取及平均200个激光发射产生的质谱。基质：9份DHB-9(2，5-二羟基-苯甲酸)饱和于乙腈/H2O(50∶50)中，1份芥子酸饱和于乙腈/H2O(50∶50)中。将0.5μl样品溶液与0.5μl基质溶液混合且置于激光靶上。

[00407]达巴万星作为单体结合到蛋白(1HSA+1达巴万星)。以极高的达巴万星蛋白比(1∶2，1∶10)，可观察到含有2分子达巴万星/分子蛋白的复合物的存在。

实施例13.在人血清白蛋白存在下达巴万星结合到N，N′-二乙酰基-Lys-D-Ala-D-Ala的等温滴定热量测定法

[00408]25℃下在一定浓度范围的HSA(高达600μM)存在下通过等温滴定热量测定法(ITC)调查达巴万星与N，N′-二乙酰基-Lys-D-Ala-D-Ala的结合，所述物质为达巴万星细胞壁靶的肽类似物，在37℃下进行某些另外的测量。HSA增加达巴万星的溶解性且降低其与三肽配体的结合亲和性。将结果与万古霉素的结果进行比较。所观察的效应在相对低的HSA浓度下保持平稳，其与非竞争性结合模型一致，此模型允许配体结合到达巴万星(两者在溶液中呈游离态)和(更弱)结合到达巴万星-HSA复合物。

[00409]初步实验证实在血清蛋白存在时，达巴万星与万古霉素显示类似的结合曲线：两者均在结合到N，N’-二乙酰基-Lys-D-Ala-D-Ala上后放热，但没有证据表明结合到二肽(D-Ala-D-Ala)或Lys-D-Ala-D-乳酸盐。就达巴万星/三肽相互作用而言，数据与以K_diss＝1-10μM(取决于温度)进行的结合一致，类似于在相同条件下的万古霉素。在HSA存在下，达巴万星的溶解性显著增加且与三肽的结合亲和性以与抗生素与HSA竞争性或非竞争性结合一致的方式降低。设计此实施例中所述实验是为了：(a)比较不同温度下(25和37℃)和不同HSA浓度时达巴万星/三肽的测量值；(b)使用所述数据来构建结合模型以与观察到的数字相比较。

[00410]由Biosearch Italia提供达巴万星。其它试剂来自Sigma：盐酸万古霉素(Sigma V-2002，fw 1485.7)、N，N′-二乙酰基-Lys-D-Ala-D-Ala(Sigma D-9904，fw 372.4)、人白蛋白(HSA；SigmaA-3782；mw 69,366)。

[00411]在即将进行实验前将抗生素和肽溶于含有HSA的含水缓冲剂(20mM磷酸钠，150mM NaCl，pH 7.4)中伴随轻微搅拌。通过重量来测定肽浓度。使用摩尔消光系数ε＝12430(达巴万星，A₂₈₀^1％＝68.42)，ε280＝6690(万古霉素)通过重量或通过UV吸收率来测定达巴万星浓度。通过UV吸收率(HSA，ε₂₈₀＝37,700；A₂₈₀^1％＝5.44)测定HSA浓度。室温下使用Shimadzu UV-160A或UV-1601分光光度计在1cm通路长度石英比色杯中记录光谱，若需要给出0.1-1_范围的吸收率，则以缓冲剂定量稀释样品。

[00412]使用Microcal VP-ITC仪器于25℃和37℃下使用标准操作程序执行等温滴定热量测定法。参阅，例如，Wiseman等人，anal.Biochem.(1989)179，131-137；Cooper，等人，Philos.Trans.R.Soc.Lond.Ser.A-Math Phys.Eng Sci.(1993)345，23-35；Cooper，A，Isothermal Titration Microcalorimetry in C.Jones，B.Mulloyand A.H.Thomas(Eds.)，Microscopy，Optical Spectroscopy，andMacroscopic Techniques.Human a Press，Totowa，NJ，(1994)第137-150页；Cooper，A.，Microcalorimetry of Protein-proteinInteractions in J.E.Ladbury and B.Z.Chowdhry(Eds.)；Biocalorimetry：The Applications of Calorimetry in theBiological Sciences.Wiley，(1998)第103-111页；和Cooper，A.，Curr.Opin.Chem.Biol.(1999)3，557-563。在装载前将样品小心脱气以避免在热量计单元中形成气泡。每个实验通常包含将25×10μl肽溶液(≈1mM)注射到热量计单元中(体积≈1.4ml)含有抗生素溶液(≈20-100μM)。对照实验涉及在相同条件下将配体注入缓冲剂中以测定肽稀释的热量，且将所述值用于分析前原始结合数据的较正。在各温度下重复达巴万星/三肽结合实验若干次。使用标准Microcal ORIGIN软件分析ITC结合数据以测定结合位点(N)的表观数目、结合亲和性(K_ass＝1/K_diss)和结合焓(ΔH)。

表39

通过ITC假定简单的非协同结合模型来测定三肽结合到达巴万星和万古霉素的热力学数据：温度和HAS的效应。

    T    ℃    N    K_ass    M^-1    K_diss    μM    ΔH    kcal/mol  ΔS  eu    [HSA]    μM达巴万星    10    10    10    10    25    25    0.59    0.59    0.59    0.56    0.6    X    6.70E+0    5    9.20E+0    5    6.85E+0    5    6.24E+0    5    3.13E+0    5    3.30E+0    5    1.49    1.09    1.46    1.60    3.19    3.03    -10.26    -8.95    -10.30    -10.30    -10.10    -11.30  -9.60  -4.30  -9.60  -9.90  -8.90  -12.60    0    0    0    0    0    0

    25    25    25    25    25  X  X  0.57  0.74  0.54  3.20E+0  5  2.80E+0  5  3.03E+0  5  3.19E+0  5  3.93E+0  5  3.13  5  3.57  5  3.30  5  3.13  5  2.54  5    -11.70    -14.30    -12.60    -11.20    -12.90    -14.00    -23.00    -17.00    -12.50    -17.60    0    0    0    0    0    与HSA    25  0.37  1.18E+0  5  8.47    -26.40    -65.50    13.6    与HSA    25  0.35  1.18E+0  5  8.47    -27.80    -70.10    13.6    与HSA    25  0.68  3.50E+0  4  28.57    -20.00    -46.20    34.2    与HSA    25  0.83  2.76E+0  4  36.23    -16.90    -36.50    80.7    与HSA    25  1.38  3.49E+0  4  28.65    -18.60    -41.70    104    与HSA    25  0.9  3.10E+0  4  32.26    -21.05    -50.00    288    与HSA    25  1.242  2.84E+0  4  35.21    -19.50    -44.90    430    与HSA    25    37    37  0.86  0.82  0.6  2.18E+0  4  1.30E+0  5  1.10E+0  5  45.87  7.69  9.09    -15.00    -12.50    -17.40    -30.40    -16.80    -33.20    601    0    0    与HSA    37  0.179  1.25E+0  4  80.00    -98.60    -299.00    482    与HSA    37  0.5  9568  104.52    -26.60    -67.60    516    万古霉素    10    25    25  1.1  0.91  0.97  6.90E+0  5  3.40E+0  5  3.60E+0  5  1.45  2.94  2.78    -9.49    -10.70    -12.90    -6.80    -10.60    -17.80    0    0    0    与HSA    25  1.05  2.90E+0  5  3.45    -10.09    -8.80    513

[00413]在不存在HSA的情况下三肽与达巴万星的结合ITC实验给出就结合亲和力而言相一致的数据，其中在10、25和37℃下平均Kdiss分别处于1.4、3.1和8.4μM的区间内(表39)。结合是放热的。此处的浓度计算表明N在所述条件下更接近0.5。此与所述条件下每个达巴万星二聚体结合一个三肽分子相一致。所述结合亲和力和结合焓与在相同条件下对万古霉素所观察到的相当(表39，和D.McPhail，A.Cooper，J.them.Soc-Faraday Trans.(1997)93，2283-2289)。也注意到万古霉素在较高浓度下经历配体诱导的二聚作用。

[00414]尽管结合显然地放热更多，但向达巴万星混合物中添加HSA可降低三肽与达巴万星的表观结合亲和力(表39)。在25℃下对此的HSA浓度依赖性示于图15中。表观K_diss最初升高(渐弱)直到35μMHsA，对接近生理水平的较高HSA浓度(600μM)保持相对恒定。在高HSA浓度下的平稳水平(K_diss≈35μM)对应于比不存在HSA时要弱约10-12倍的结合亲和力。在37℃下观察类似降低。

[00415]HSA效应并不归因于与三肽的相互作用。在HSA存在下万古霉素与三肽的结合对照ITC实验给出与不存在HSA时所观察的结果相当的结果(参见表39)。此表明肽或紧密相关的抗生素万古霉素均不与溶液中的HSA相互作用。可以推出HSA对达巴万星/三肽相互作用的任何效应均必须归因于HSA与达巴万星的相互作用。

[00416]尽管不希望受缚于理论，但以上数据与非竞争性结合模型相一致。此模型假设三肽配体(L)可与游离状态的达巴万星(D)和达巴万星-HSA复合物中的达巴万星(D)相结合(可能以不同亲和性)。

D+L_DL；K_L＝[D][L]/[DL]

D+HSA_D.HSA；K_HSA＝[D][HSA]/[D.HSA]

D.HSA+L_LD.HSA；K_LDHSA＝[D.HSA][L]/[LD.HSA]

表观(所观察到的)配体结合解离常数(非竞争性)

K_app.L＝[总D][L]/[总DL复合物]

＝([D]+[D.HSA])[L]/([DL]+[LD.HSA])

＝K_L.{1+[HSA]/K_HSA}/{1+[HSA].K_L/K_HSA·K_LDHSA}

[00417]这显示出了K_app，L对游离HSA浓度的双曲线依赖性，

其与所观察的数据很好地符合(图15)。在高[HSA]下此达到渐近

(平稳)值。

K_app.L＝K_LDHSA(对于大[HSA])

[00418]这表明相比于游离达巴万星的3μM(25℃图)，当达巴万星结合于HSA上时其对三肽的结合亲和力是约35μM。

[00419]可依据达巴万星在与肽或蛋白的相互作用中是否充当单体或二聚体来表明其它机制。直接比较达巴万星与万古霉素(其显示在所述低浓度下明确的1∶1结合)显示在较低摩尔比(较低N)下达巴万星的结合完全(图16)。此与2∶1达巴万星∶肽复合物相一致。

[00420]然而，在HSA存在下表观N值增加(表39)并且可与1∶1复合作用更加一致。尽管不希望受缚于理论，图17中所示的模型与所述观察相一致，所述模型显示达巴万星单体和二聚体与三肽配体和HSA的可能相互作用。图17A描绘呈溶液中单体-二聚体均衡态(主要作为二聚体)的达巴万星，但作为单体结合于HSA的两个独立位点上。此与由ITC对血清蛋白结合达巴万星所观察到的N＝0.5值相一致(实施例3)。图17B描绘配体于溶液中结合于达巴万星二聚体上，并且(更弱地)结合于与HSA相连接的达巴万星单体上。此与达巴万星以可变的表观化学计量与三肽和HSA的非竞争性结合相一致。

[00421]总而言之，此实施例显示HSA以与非竞争性机制相一致的方式降低达巴万星对三肽配体的结合亲和力，并且与HSA结合的达巴万星保留其结合三肽配体的能力，虽然亲和力降低。所述结果也与其中达巴万星呈溶液中单体-多聚体均衡态(主要是多聚体)的模型相一致，其中多聚体对肽配体具有很强的亲和力。游离的及与血清白蛋白结合的达巴万星单体也可以降低亲和力与肽结合。

实施例13.A-40926与达巴万星的制备

制备A-40926

[00422]通过发酵所产生的天然糖肽A-40926是制备达巴万星的起始材料。其是作为A-40926与其乙酰基衍生物的混合物由Nonomuriasp ATCC 39727产生(参见美国专利第4,935,238与B.Golstain等人.Antimicrobial Agent and Chemotherapy，Dec.1987，第1961-1966页)。首先将乙酰基衍生物脱乙酰化成A-40926。脱乙酰化作用之后通过如下所述的聚酰胺柱层析将A-40926纯化。下列描述代表当前生产方法。此处所报导的量是工业制备中通常所运作的量的约1/4。

A-40926的脱酰化

[00423]在搅拌同时以NaOH 30％调节10m³含有总共约1g/LA-40926及其乙酰基衍生物的发酵肉汤(23℃)处于pH11.4。持续搅拌6小时，接着将温度降至15℃并微过滤肉汤(具有0.1μ的0.12m²陶瓷膜的Koch Protosep IV微过滤器)。在微过滤期间将水连续添加至滞留物中以在过程结束时获得20-25m³的渗出液与4.5-5m³的滞留物(起始值的一半)。

[00424]通过HPLC分析含有A-40926的渗出液。当脱乙酰化作用完成时，以30％硫酸调节渗出液溶液的pH处于pH7(储存于20℃下)。在此实施例中，获得25m³含有6.62kg A-40926(268mg/L)的经过滤肉汤。脱乙酰化产率是66.2％。如果微过滤过程进行更长时间并且此过程中所用的萃取体积更高，则产率可增加至90％。

在聚酰胺柱上纯化A-40926

[00425]萃取后将经过滤肉汤中所含的A-40926于如下所述的聚酰胺柱上纯化。此描述中所报导的量是工业制备中通常所运作的量的约1/10并且代表当前生产方法。

[00426]将500L聚酰胺树脂SC6(得自Macherey Nagel)悬浮于软化水中并装载至柱中。接着通过以至少2BV(柱床体积)的缓冲溶液洗提柱来调节树脂处于pH6-6.5，所述缓冲溶液是通过将4kg碳酸钠溶解于800L水中并以乙酸调节所得溶液的pH来制备。

[00427]将A-40926经过滤肉汤(9000L；检定率0.275mg/L；A-40926 2475g；pH6±0.2；温度10±3℃)以每升树脂约5g活性的比率(通常使用5-8g/L的活性/树脂比率)装载至柱中。以下列溶液洗涤柱：3BV(1500L)处于pH 6的溶液，其是通过将7.5kg碳酸钠溶解于1500L软化水中并以乙酸调节pH来制备；4BV(2000L)处于pH8的溶液，其是通过将10kg碳酸钠溶解于2000L软化水中并以乙酸调节pH来制备；1.5BV(750L)处于pH9的溶液，其是通过将4kg碳酸钠溶解于750L软化水中并以乙酸调节pH来制备。

[00428]通过以4BV(2000L)处于pH10的缓冲溶液洗提自柱回收A-40926，所述缓冲溶液是通过将10kg碳酸钠溶解于2000L软化水中并以乙酸调节pH来制备。收集含有经纯化A-40926的部分(A-40926浓度大于0.5g/L并且主要组分(B₀+B₁)的HPLC面积％大于80％)，以1N HCl中和并通过HPLC进行分析。获得约2000L的最终透明溶液。

[00429]以1.5 BV的异丙醇/5％NaOH的1∶1混合物将用于纯化的树脂再生，随后以5BV软化水洗涤。

A-40926浓缩

[00430]使来自柱的溶液经受若干轮稀释/浓缩步骤以消除溶液大多数的无机盐。使用切割为250D的薄膜通过纳米过滤将溶液浓缩至80L，以80L的软化水来稀释，且于起始柱(80L)处通过纳米过滤重新浓缩。将此项操作重复至少5次。以23％HCl调节最终溶液的pH值(80L，pH7.5)至6.3。接着以80L的丙酮稀释溶液，且以23％HCl再次调节其pH值至pH2.6。

脱色

[00431]搅拌中将680g木炭PA 200C(～0.3g/g A-40926)加至以上步骤获得的溶液(160L)中。室温下继续搅拌至少30分钟，接着添加约0.5-0.6Kg助滤剂(DIF-BO)。经过滤筒过滤混合物。将所获得的澄清溶液于真空中(45℃)浓缩以使丙酮低于10％。最终体积为约100L。接着以含水NaOH调节pH值为6.7且使用常用的纳米过滤继续浓缩步骤直至A-40926浓度约为100g/L。获得20L浓溶液(A-409261884g，94.2g/L)。

沉淀和干燥

[00432]在搅拌的同时以20L丙酮稀释先前溶液，并且以10％HCl调节其pH值维持5.1。向此溶液添加额外的5倍体积丙酮(100L)以完成A-40926沉淀作用。如果此时含水量＜15％，则添加额外的丙酮。2小时后将悬浮液离心并以3×10L新鲜丙酮洗涤固体。分析母液并在确定不存在产物后将母液排出。

[00433]在静态干燥器中于30-35℃和减压下干燥固体A-40926直至残余丙酮低于2％并且水少于10％。接着经50目筛网将产物筛滤，获得2.08kg经纯化A-40926(HPLC检定率81.4％；水6.2％；硫酸化灰份4.8％)。起始自装载于柱上的活性的产率是68.4％。

合成达巴万星

[00434]通过Malabarba与Donadio(1999)，Drugs of theFuture，24(8)：839-846中所述的三步骤合成自天然糖肽A-40926制备达巴万星(BI-397)。特定言之，A-40926首先经受酯化步骤以制造MA，其接着经受酰胺化步骤以制造MA-A-1。最终的水解步骤接着将MA-A-1转化成达巴万星。

酯化步骤(步骤1)

[00435]下列描述代表使用中的当前方法。

制备H₂SO₄96％/MeOH(溶液A)

[00436]在配备有机械搅拌器与温度计的15L圆底烧瓶中，将2.28L H₂SO₄96％(每千克A-40926粉末对应～300mL H₂SO₄96％)逐滴添加至7.9L MeOH中。使用外置冰浴维持温度介于0与5℃之间。

反应过程

[00437]在140L搪玻璃反应器中将起始材料A-40926(7.6kg；批号019，检定率85.09％；活性6.46kg；3.73 mol)悬浮于MeOH(46L)中，并在0℃±2℃下冷却所得悬浮液。在此温度下以先前所制备的溶液A(H2SO4/MeOH)处理悬浮液。将所得溶液在0℃下搅拌22-26小时，同时每隔两小时通过HPLC分析来监测反应(以1∶1乙腈/水混合物将反应等分试样稀释100倍)。当以HPLC面积％计算、残余A-40926少于5％并且二酯不超过10％时认为酯化作用完成。

酯(MA)分离

[00438]当反应完成时，在-5℃(+/-2℃)下冷却混合物并在保持温度低于5℃的情况下以相同体积的冷水(54L)稀释。通过缓慢添加10.2L三乙胺(TEA)调节溶液pH在5.5(+/-0.2)，藉此沉淀产物(MA)。在0-2℃下持续搅拌额外1小时，接着离心所获得的固体，以水(每千克A-40926对应10L)洗涤并最终以先前在10-15℃下冷却的MeOH(每千克起始A-40926对应3L MeOH)洗涤。在自MA中移除硫酸盐之前以水洗涤。

[00439]分别分析母液与洗液并且如果含有少于1-2％的活性则将其排出。在真空(50mmHg)中于35-40℃(外部温度)下干燥产物直至残余水少于10％。获得7.6kg呈浅褐色粉末的MA(5.63kg活性，3.23mol)。

[00440]分析显示下列HPLC面积％的值：MA 89.8。

[00441]A-40926 3.2、二酯衍生物5.9。HPLC检定率是74.2％，活性5.637kg；3.23mol；产率＝86.5％。该物质不经进一步纯化即用于下一步骤中。

酰胺化步骤(步骤2)

[00442]下列描述代表了当前生产方法。

制备DMSO/HCl混合物(溶液B)

[00443]将DMSO(1.6L)置于配备有机械搅拌器与温度计的10L圆底烧瓶中，并以低于10℃的冰浴冷却。接着在保持混合物温度低于25℃的情况下于搅拌同时缓慢添加HCl 37％(1L)。

酰胺化过程(生产MA-A-1)

[00444]在室温下于搅拌同时将起始材料MA 5.95kg(检定率76.3％，KF 8.9％；2.68 mol)缓慢溶解于19.2L的1∶1 DMSO/MeOH混合物(每千克MA粉末对应～1.6L DMSO与1.6L MeOH)中。搅拌1小时后将709mL的3-(二甲基胺基)-丙胺(DMEPA，MW 102.1；密度＝0.812g/mL；5.63 mol；每摩尔起始MA对应1.96mol)与325g的1-羟基苯并三唑水合物(HOBTH20；MW 153.1；2.04mol；每摩尔起始MA对应0.71mol)添加至反应混合物中。持续搅拌直至获得完全溶液，接着通过缓慢添加约2.0L溶液B(DMSO/HCl)调节混合物处于pH3-3.1(以水将反应等分试样稀释10倍后进行测量)。

[00445]在10分钟内将二环己基碳二酰胺(DCC)溶液(通过将1.03kg DCC(4.99mol；MW 206.3；每摩尔MA对应1.74mol)溶解于4.1L的1∶1DMSO/MeOH混合物中来制备)添加至经搅拌反应混合物中。持续搅拌5小时，接着将额外的51.5g固体DCC(0.25mol)添加至反应混合物中直至残余MA降低至低于5％，同时维持异脲水平低于4-5％。异脲是由达巴万星与过量DCC进一步反应所产生的一组副产物。

[00446]通常在额外2小时后(总共7小时)反应完成。在结束时以水(60L)稀释混合物以降低DMSO浓度至15％(v/v)并以HCl 1N(0.85L)调节至pH2.3，以除去任何残余的DCC。

将MA-A-1水解成达巴万星(步骤3)

[00447]30分钟后以15％NaOH(8L)调节混合物处于pH12.0-12.1。持续搅拌4小时，同时通过少量添加NaOH 15％维持混合物处在该pH。此后以HPLC面积％计算的残余MA-A-1少于0.2％。

[00448]接着在pH3.0时以1N HCl(19L)酸化混合物，并过滤悬浮液以移除所形成的二环己基脲。在过滤器上以软化水(2×20L)洗涤固体滤饼。将洗液与滤液收集在一起从而获得透明溶液，通过HPLC对其进行分析。获得152.8L含有21.74g/L达巴万星的溶液(总活性3322g；1.828mol，产率＝68.2％)。

纯化达巴万星

[00449]下列描述代表了当前的生产方法。

[00450]将获得自水解步骤并含有3322g达巴万星活性的152.8L溶液分成两份，并在含有400L聚酰胺的相同层析柱上分别纯化各份。在所述两个纯化运作中活性/树脂比率分别是4.3与4.0g/L。

聚酰胺柱制备

[00451]根据树脂再生程序(见下)清洁含有400L聚酰胺树脂的搪玻璃柱(内径＝40cm，h＝320cm)并以2 BV(800L)经4L AcOH(pH＝3.2)酸化的软化水调节。

纯化第一部份

[00452]以H₂O(56L)稀释第一部份76.4L起始溶液以降低DMSO含量低于5％(v/v)并以1N HCl(3.4L)酸化至pH 2.78。接着将此溶液以150L/h的流动速率装载至柱上。装载后以下列溶液洗涤树脂：4BV(1600L)经AcOH(8L)酸化的H₂O，pH＝3.2；5 BV(2000L)AcONa 0.1M，pH＝8.2；1 BV(400L)经AcOH(1L)酸化的H₂O，pH＝3.2。以4 BV(2400L)经AcOH(6L)酸化并且pH＝3.4的H₂O/MeOH(8∶2)洗提达巴万星。

[00453]在洗提步骤中收集各自是50-60L的22份并通过HPLC分析。将9至25份(达巴万星浓度高于0.5g/L并且(B0+B1)的HPLC面积％80％)收集在一起，从而获得969L具有1.56kg达巴万星的溶液(产率＝93.9％)。接着通过毫微过滤使此溶液浓缩，从而获得125.7L具有1.38kg达巴万星的溶液。将850L含有145g不纯达巴万星(8.7％)的渗出液中和并排出。

树脂再生

[00454]在再使用之前以下列溶液洗涤树脂：2.5 BV(1000L)经乙酸(2.5mL/L)酸化的1∶1 MeOH/水；2.5 BV(1000L)1∶10.5％NaOH/异丙醇；10 BV(4000L)软化水。接着以2 BV(800L)经乙酸(2.5mL/L)酸化的水使树脂再均衡。

纯化第二部份

[00455]以H₂O(56L)稀释来自水解步骤的第二部份起始溶液(76.5L)以降低DMSO含量低于5％(v/v)并以3.0L 1N HCl酸化至pH 2.87。接着如先前第一部份的纯化作用中所述将第二部份纯化。通过毫微过滤使经收集的部分(体积＝972L，达巴万星1.54kg，产率＝92.7％)浓缩，从而获得133L具有1.46kg活性的溶液。排出850L含有73g达巴万星(4.3％)的渗出液。

[00456]将来自两个纯化步骤的浓溶液再分析并收集在一起，从而得到258L含有2840g经纯化达巴万星的溶液。纯化产率是86％。起始自MA的总产率是58.3％。

最终聚酰胺再生

[00457]在第二个纯化运作之后，以经pH＝3.4的AcOH(2.5L)酸化的2.5 BV的1∶1 MeOH-水、2.5 BV的1∶10.5％Na OH-异丙醇、10 BV软化水使聚酰胺再生。

达巴万星的脱色与沉淀

[00458]将每摩尔达巴万星中1.5mol 1N HCl与每克达巴万星中0.3g炭CG1(0.85kg，得自NORIT)添加至以上获得的258L溶液中。在室温下搅拌混合物至少45分钟。pH值是3.1。接着在SUPRA DISC筒模上过滤悬浮液。以50L H2O/MeOH 8∶2洗涤得自SEITZ-SCHENK的SDP-EK1与滤饼。分析滤液并使用临界值是250D的MPS 44膜通过毫微过滤再次浓缩。获得21.3L含有119g/L达巴万星的浓溶液(pH4.1；MeOH 1.9％，GC)。最终添加909mL 1N HCl以调节pH处于2.63，其对应于1.65mol HCl/mol达巴万星的成盐比率。

[00459]在搅拌同时将溶液(22.2L)倾倒入200L丙酮中。将倾析后所获得的固体离心并以14L新鲜丙酮洗涤。接着在减压(50mmHg)下于35℃下干燥产物，同时维持内部温度低于30℃保持17小时。在干燥过程中，于3与5小时后将1L不含发热原的水(＜250EU/mL)(分成各0.5L的两部分)喷洒至固体上以移除以其它方式难以消除的残余丙酮。接着筛滤(50目)产物，从而获得2592g达巴万星(HPLC检定率82.4％；水(KF)14％；Cl-3.0％)。

实施例14.用于A-40926与达巴万星制备的替代方法

[00460]下述方法是可用于A-40926与达巴万星制备过程中的替代方法。

XAD-7 HP上的A-40926制备

脱乙酰化与菌丝体微过滤

[00461]在室温下(24℃)下将150L含有A-40926的发酵肉汤(pH7)于合适反应器中搅拌，并以2.5N NaOH溶液(2.5L)调节处于pH11.5。搅拌4小时后，以15％HCl调节肉汤处于pH 10.6，并经0.2微米膜进行微过滤。收集439L透明渗出液并接着使用临界值是250D的MPS 44膜通过毫微过滤进行浓缩。调节所获得的A-40926浓溶液(58.6 L；3.89g/L)处于pH 6.4并储存于4℃下直至使用。

柱制备与纯化

[00462]将XAD-7 HP树脂(8L)悬浮于1∶1水/甲醇溶液中，过滤并以蠕动泵装载至适当玻璃柱(内径12cm)中。

[00463]接着以水洗涤树脂并以经缓冲处于pH 6的6 BV碳酸钠水溶液使其均衡，所述碳酸钠水溶液是通过每升水中溶解5g碳酸钠并以乙酸调节pH来制备。

[00464]将一部分含有194g A-40926的浓肉汤装载至XAD-7 HP柱中。接着以1/2 BV/小时的流动速率用下列两种经缓冲溶液洗涤树脂以消除所存在的一部分亲水性和有色物质：3 BV(24L)0.5％乙酸水溶液，其经30％氢氧化钠调节处于pH 5；5 BV(40L)8∶2水/丙酮混合物，其经5mL乙酸/L水酸化。

[00465]最终以8 BV(64L)经5mL乙酸/L水酸化的1∶1水/丙酮混合物洗提A-40926。收集16份各自是4L的部分。将其中A-40926浓度大于0.5g/L的浓部分(5至15)聚集在一起从而获得含有163.4gA-40926的溶液(43L，3.8g/L)。柱产率是81.3％。排出含有0.23g/L(45.3g；22.2％)纯度较差的A-40926的其它部分(200L)。

[00466]在洗提后以6 BV(55L)NaOH 0.5％/异丙醇(1∶1)混合物使树脂再生，并最终以10 BV水洗涤至中性。

炭处理

[00467]以HCl 37％(70mL)调节所收集的部分处于pH 2.5并接着以50g炭PA 200型(0.3g/g A-40926)脱色。将所获得的悬浮液于室温下搅拌2小时并接着经KS 50过滤器(d＝25cm，时间＝2.5小时)过滤，从而获得45.6L微黄色A-40926溶液(3.5g/L；产率＝96.4％)。

浓缩

[00468]以NaOH 30％(230mL)调节经脱色溶液处于pH 7并通过毫微过滤和超滤来浓缩。使用所述技术对于消除在Rt＝2-4分钟时于HPLC色谱上所侦测到的亲水性物质而言很重要。当将滞留物浓缩成起始体积的1/10(4L)时，添加相同体积的水并将所获得的溶液再次浓缩。重复此浓缩/稀释步骤三次以减少残余丙酮至0.25％。通过HPLC分析最终溶液(2.2L，146.3 g A-40926，66.5g/L，产率＝91.5％)。纯化产率是75.4％。

A-40926结晶

[00469]通过使用实验室规模的超滤器将300mL份的A-40926溶液(19.9g A-40926)进一步浓缩成100mL并接着在60-65℃下加热。调节(30％NaOH)此溶液的pH处于7，并在此温度下向每毫升浓溶液中逐滴添加1.2mL 5∶1丙酮/异丙醇混合物。使所得混合物在20℃下冷却。1.5小时后，将所获得的固体过滤，于过滤器上以丙酮洗涤并在40℃下干燥15小时。获得20.6g产物(HPLC检定率82.0％；A-4092616.9g)。沉淀产率是84.9％。起始自经过滤肉汤的总产率是约64％。

在CG-71上制备A-40926

柱制备

[00470]将CG-71树脂(350mL)倾倒入玻璃柱(内径＝4cm)中并以水洗涤。以3BV碳酸钠溶液使树脂均衡，所述碳酸钠溶液是通过将5g碳酸钠溶解于以乙酸使pH处于6的水中来制备。将250mL含有14.7g A-40926的发酵肉汤(pH7)装载至柱(42g/L树脂)中。以下列三种溶液洗涤树脂：1050mL(3 BV)经乙酸调节处于pH 6的碳酸钠水溶液(5g/L)；1750mL(5 BV)经乙酸调节处于pH 8的碳酸钠水溶液(5 g/L)；3150mL(9 BV)经乙酸调节处于pH 9的碳酸钠水溶液(5g/L)。

[00471]接着以10 BV软化水洗提活性。收集各自是500mL的20份。将12至15份收集在一起，从而获得2.2L含有11.7g A-40926的经纯化溶液(产率＝79.6％)。接着通过超滤浓缩此溶液并以软化水进一步稀释浓溶液并再次超滤。在减压下将所获得的溶液进一步浓缩至50mL。

A-40926结晶

[00472]在60℃下加热浓溶液并在搅拌同时以5∶1丙酮/IPA混合物(60mL)处理。接着在室温下缓慢冷却混合物。将所获得的固体过滤，在过滤器上以丙酮洗涤并在真空中于35℃下干燥80小时。获得8.9g经纯化A-40926(HPLC检定率84.2％)。总产率是51％。

达巴万星合成中使用N-甲基-2-吡咯烷(NMP)作为溶剂的替代酰胺化步骤

[00473]在搅拌同时将MA混合物逐份添加至1∶1 NMP/MeOH混合物(64mL)中。在20-25℃下持续搅拌直至完全溶液，接着添加DMEPA(2.42mL；1.96mol/eqMA)与HOBT(1.06g；0.71mol/eqMA)。以NMP中的9.37mL 15％HCl(先前自溶解于57.7mL NMP中的34.0mL HCl 37％制备)调节反应混合物(检查以水稀释成1∶10的样品)的pH值至3.0。接着在搅拌同时添加DCC(3.17g；1.57mol/eqMA)于NMP/MeOH 1∶1(12.7mL)中的溶液。通过HPLC监测反应。在约6小时后反应完成(MA-A-1 88.9％，MA 7.3％，ISO 3.7％)。此实验表明NMP可以是用于酰胺化反应的DMSO的便利替代物。整个过程不受此溶剂改变影响并且所获得的最终达巴万星在化学上等同于其它批次。

达巴万星制备的替代方法：单罐方法

[00474]在室温下于100mL玻璃反应器中将10g A-40926复合物(HPLC滴定度80.66％，4.6mmole)在搅拌同时悬浮于24mL MeOH中。在0℃下冷却混合物，并添加4g HCl(g)于16.4mL MeOH中的溶液以完成产物溶解作用。接着使温度升至20℃，同时持续搅拌额外24小时。

[00475]此后将40mL DMSO与0.4g HOBT添加至反应混合物中。

[00476]接着添加1，1-二甲胺丙胺，藉此调节所得反应混合物的pH值介于3-3.1之间(在以水稀释样品至9∶1后进行测量)。接着添加1.8g固体DCC并持续搅拌额外15小时。此时将反应混合物转移入1L玻璃反应器中并以80mL水稀释。接着通过添加240mL 15％NaOH使pH值达到12。持续搅拌额外60分钟，并以260mL 15％HCl水溶液酸化混合物处于pH 2.8。获得约800mL含有6.4g达巴万星的最终透明溶液(产率＝76％)。

[00477]HPLC分析显示所获得的产物的概况与以其它制造方法获得的产物的概况相当。

N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物

[00478]本发明提供了用于例如预防和/或治疗哺乳动物微生物感染的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物。为了方便起见，在本文的说明书中，达巴万星化合物根据美国专利第5,750,509号进行编号，并描述在图26中。

[00479]在某些实施方案中，本发明提供了式(III)的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物，或其药学可接受的盐或溶剂化物：

[00480]在某些实施方案中，本发明提供了式(IV)的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物，或其药学可接受的盐或溶剂化物：

[00481]式(III)和(IV)提供了本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的肽核。这个肽包括7个氨基酸，且氨基末端在右侧，如式(III)和(IV)所示，且羧基末端在左侧。根据本发明的这个方面，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物在氨基末端氮或N¹⁵上包含两个烷基取代基。换句话说，在式(III)和(IV)中，R¹和R¹′是烷基。

[00482]在优选实施方案中，R¹和R¹′是C_1-4烷基。在某些实施方案中，R¹和R¹′各自独立地选自丙基、乙基和甲基。在进一步的实施方案中，R¹和R¹′各自独立地选自乙基和甲基。在更优选的实施方案中，R¹和R¹′至少一个是甲基。在最优选的实施方案中，R¹和R¹′是甲基。

[00483]分子的剩余部分可以用和本领域技术人员已知的达巴万星化合物相同的方式修饰。相应地，X是以上部分中定义的氨基烷基氨基。典型的氨基烷基氨基描述在美国专利第5,750,509号中。在某些实施方案中，X是N，N-二甲氨基丙氨基。

[00484]因此，在特定实施方案中，本发明提供了式(V)化合物或其药学可接受的盐或溶剂化物：

[00485]本发明的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物可以在一个或多个位置糖基化，如本领域技术人员已知的。在优选实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物在式(III)或(IV)的G和M位糖基化。在特定实施方案中，M是氢或糖部分。例如，M可以是氢、α-D-吡喃甘露糖基或6-0-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖基。在特定实施方案中，G是氢或糖部分。例如，G可以是氢或葡糖醛胺。

[00486]在某些实施方案中，一个或两个糖部分可以被酰化或乙酰化，或这两者。例如，当G是葡糖醛胺时，葡糖醛胺部分可以被脂肪酸酰化。脂肪酸可以是本领域技术人员已知的任何脂肪酸。在特定实施方案中，脂肪酸选自8-甲基壬酸、正癸酸、9-甲基-癸酸、正十一烷酸、10-甲基-十一烷酸、正十二烷酸、11-甲基-十二烷酸、正十三烷酸、12-甲基-十三烷酸和正十四烷酸。在优选实施方案中，脂肪酸是C₁₂脂肪酸。在特定实施方案中，脂肪酸是10-甲基-十一烷酸。

[00487]在某些实施方案中，本发明提供了式(VI)化合物，或其药学可接受的盐或溶剂化物：

[00488]在式(VI)中，R²是C_10-14酰基。在特定实施方案中，R²选自8-甲基壬酸、正癸酸、9-甲基-癸酸、正十一烷酸、10-甲基-十一烷酸、正十二烷酸、11-甲基-十二烷酸、正十三烷酸、12-甲基-十三烷酸和正十四烷酸。在优选实施方案中，R²是C₁₂脂肪酸。在特定实施方案中，R²是10-甲基-十一烷酸。

[00489]如以下合成部分所述，N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物可以从达巴万星化合物合成。相应地，本发明的某些N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物具有达巴万星A₀、A₁、B₀、B₁、C₀和C₁的糖部分和脂肪酸。

[00490]在特定实施方案中，本发明提供了N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物。N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物包括在N¹⁵处具有两个甲基的式(I)或(II)。如上所述，N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物可以被一个或多个糖部分糖基化。在某些实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物在一个或多个这些糖部分上被酰化。在优选实施方案中，酰基是10-甲基-十一烷酸。

[00491]在优选实施方案中，本发明提供了具有下列结构(VII)的N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物，或其药学可接受的盐或溶剂化物：

[00492]在某些实施方案中，本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物是纯化的。当用于本文中时，术语纯化的指的是N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物相对于组合物中的其它达巴万星化合物是富集的。例如，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物相对于生产N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的混合物可以是富集的，例如，如从下列实施例中所述的发酵肉汤衍生的混合物。在某些实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物富集两倍、三倍、五倍、十倍、一百倍、一千倍或一万倍。

[00493]在进一步的实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物是分离的。当用于本文中时，术语分离的指的是N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物相对于组合物中的非达巴万星化合物是富集的。例如，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物相对于生产N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的混合物可以是富集的，例如，如从下列实施例中所述的发酵肉汤衍生的混合物。在某些实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物富集两倍、三倍、五倍、十倍、一百倍、一千倍或一万倍。

[00494]在更进一步的实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物是纯化和分离的。当用于本文中时，术语纯化和分离的指的是N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物相对于组合物中的非巴万星化合物和相对于其它达巴万星化合物是富集的。例如，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物相对于生产N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的混合物可以是富集的，例如，如从下列实施例中所述的发酵肉汤衍生的混合物。在某些实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物富集两倍、三倍、五倍、十倍、一百倍、一千倍或一万倍。

N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物

[00495]本发明还提供了在羰基63处具有羧酸基团的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物。这些化合物用于例如制备本发明的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物。在某些实施方案中，这些N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物也用于预防和/或治疗哺乳动物微生物感染。

[00496]在某些实施方案中，本发明提供了式(VIII)的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物，或其药学可接受的盐或溶剂化物：

[00497]在某些实施方案中，本发明提供了式(IX)N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物，或其药学可接受的盐或溶剂化物：

[00498]式(VIII)和(IX)提供了本发明这一方面的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的肽核。该肽包括7个氨基酸，且氨基末端在右侧，如式(III)和(IV)所述，且羧基末端在左侧。根据本发明的这一方面，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物在氨基末端氮或N¹⁵上包含两个烷基取代基。换句话说，在式(I)和(II)中，R¹和R¹′是烷基。此外，在式(VIII)和(IX)中，X是OH，如在本领域技术人员已知的抗生素A 40926化合物中。

[00499]在优选实施方案中，R¹和R¹′是C_1-4烷基。在某些实施方案中，R¹和R¹′各自独立地选自丙基、乙基和甲基。在进一步的实施方案中，R¹和R¹′各自独立地选自乙基和甲基。在更优选的实施方案中，R¹和R¹′至少一个是甲基。在最优选的实施方案中，R¹和R¹′是甲基。

[00500]本发明的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物可以在一个或多个位置糖基化，如本领域技术人员已知的。在优选实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物在式(VIII)或(IX)的G和M位糖基化。在特定实施方案中，M是氢或糖部分。例如，M可以是氢、α-D-吡喃甘露糖基或6-0-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖基。在特定实施方案中，G是氢或糖部分。例如，G可以是氢或葡糖醛胺。

[00501]在某些实施方案中，一个或两个糖部分可以被酰化或乙酰化，或这两者。例如，当G是葡糖醛胺时，葡糖醛胺部分可以被脂肪酸酰化。脂肪酸可以是本领域技术人员已知的任何脂肪酸。在特定实施方案中，脂肪酸选自8-甲基壬酸、正癸酸、9-甲基-癸酸、正十一烷酸、10-甲基-十一烷酸、正十二烷酸、11-甲基-十二烷酸、正十三烷酸、12-甲基-十三烷酸和正十四烷酸。在优选实施方案中，脂肪酸是C₁₂脂肪酸。在特定实施方案中，脂肪酸是10-甲基-十一烷酸。

[00502]在某些实施方案中，本发明提供了式(X)化合物，或其药学可接受的盐或溶剂化物：

[00503]在式(X)中，R²是C_10-14酰基。在特定实施方案中，R²选自8-甲基壬酸、正癸酸、9-甲基-癸酸、正十一烷酸、10-甲基-十一烷酸、正十二烷酸、11-甲基-十二烷酸、正十三烷酸、12-甲基-十三烷酸和正十四烷酸。在优选实施方案中，R²是C₁₂脂肪酸。在特定实施方案中，R²是10-甲基-十一烷酸。

[00504]如以下合成部分所述，N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物可以从抗生素A 40926化合物合成。相应地，本发明的某些N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物具有抗生素A 40926因子A₀、A₁、B₀、B₁、C₀和C₁的糖部分和脂肪酸。

[00505]在特定实施方案中，本发明提供了N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物。N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物包括在N¹⁵处具有两个甲基的式(VIII)或(IX)。如上所述，N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物可以被一个或多个糖部分糖基化。在某些实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物在一个或多个这些糖部分上被酰化。在优选实施方案中，酰基是10-甲基-十一烷酸。

[00506]在优选实施方案中，本发明提供了具有下列结构(XI)的N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物，或其药学可接受的盐或溶剂化物：

[00507]在某些实施方案中，本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物是纯化的。当用于本文中时，术语纯化的指的是N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物相对于组合物中的其它抗生素化合物是富集的。例如，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物相对于生产N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的混合物可以是富集的，例如，如从下列实施例中所述的发酵肉汤衍生的混合物。在某些实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物富集两倍、三倍、五倍、十倍、一百倍、一千倍或一万倍。

[00508]在进一步的实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物是分离的。当用于本文中时，术语分离的指的是N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物相对于组合物中的非抗生素化合物是富集的。例如，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物相对于生产N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的混合物可以是富集的，例如，如从下列实施例中所述的发酵肉汤衍生的混合物。在某些实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物富集两倍、三倍、五倍、十倍、一百倍、一千倍或一万倍。

[00509]在更进一步的实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物是纯化和分离的。当用于本文中时，术语纯化和分离的指的是N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物相对于组合物中的非抗生素化合物和相对于其它达巴万星化合物是富集的。例如，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物相对于生产N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的混合物可以是富集的，例如，如从下列实施例中所述的发酵肉汤衍生的混合物。在某些实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物富集两倍、三倍、五倍、十倍、一百倍、一千倍或一万倍。

制备本发明化合物的方法

[00510]可以根据本领域技术人员制备这类N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物显而易见的任何方法制备本发明化合物。

[00511]例如，在某些实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或本发明组合物可以通过本领域技术人员显而易见的任何技术将相应的N¹⁵-单甲基化合物或组合物烷基化而制备。例如，如路线图1所示，在室温下通过将化合物或组合物与HCHO、NaBH₃CN、DMF、H₂O和NaHCO₃的混合物接触可以使N¹⁵-单甲基化合物或组合物甲基化。在特定实施方案中，将N¹⁵-单甲基达巴万星化合物或组合物溶于水和DMF，向其中加入甲醛和碳酸氢钠，接着加入NaBH₃CN，生成N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物或组合物。

路线图1

[00512]相应的N¹⁵-单甲基化合物或组合物可以根据已公开的技术制备，例如在美国专利第5,750,509号和美国专利申请公开第2004/0142883号中广泛描述的那些，其内容被全文引入作为参考。如果化合物或组合物在其N¹⁵氮上有保护基，它们可以用本领域技术人员已知的任何技术除去。

[00513]适当的原料包括达巴万星A₀、A₁、B₀、B₁、C₀和C₁以及抗生素A 40926因子A₀、A₁、B₀、B₁、C₀和C₁。如下列实施例中所示，根据该方法，从达巴万星B₀制备N¹⁵，N¹⁵-二甲基达巴万星B₀。这些达巴万星化合物的制备广泛描述在美国专利申请公开第2004/0142883号中。这些达巴万星化合物具有下列结构：

其中，R如下

达巴万星化合物R A₀-CH(CH₃)₂ A₁-CH₂CH₂CH₃ B₀-CH₂CH(CH₃)₂ B₁-CH₂CH₂CH₂CH₃ C₀-CH₂CH₂CH(CH₃)₂ C₁-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃

[00514]在进一步的实施方案中，可以从抗生素A 40926发酵肉汤制备本发明的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物。包含抗生素A 40926和相关化合物的发酵肉汤可以根据所述技术制备，例如，在美国专利第5,750,509号和美国专利申请公开第US 2004/0142883号。可以纯化肉汤，生成想要的抗生素A 40926化合物，它可以根据美国专利第5,750,509号和美国专利申请公开第US 2004/0142883号酯化、酰胺化和水解，生成达巴万星化合物的混合物。可以根据本领域技术人员显而易见的任何技术从混合物中纯化和/或分离N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物。在下列实施例中，将HPLC技术用于纯化本发明的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物。

组合物

[00515]另一方面，本发明提供了包含一种或多种本发明化合物的组合物。一般地，本发明组合物包含本发明化合物和一种或多种其它化合物。其它化合物可以是本发明化合物、本领域技术人员已知的化合物、尚未发现或公开的化合物或其它化合物。

[00516]在某些实施方案中，组合物是在以下部分更详细描述的药物组合物。

[00517]在特定实施方案中，组合物包含本发明的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物，和达巴万星或抗生素A 40926化合物。达巴万星或抗生素A 40926化合物可以是本领域技术人员已知的任何达巴万星或抗生素A 40926化合物。典型的达巴万星化合物包括在美国专利5,750,509号和美国专利申请公开第US 2004/0142883号中描述的那些，其全部内容由此引入本文作为参考。典型的抗生素A 40926化合物描述在美国专利第4,935,238、4,868,171和4,782,042号中，其全部内容由此引入本文作为参考。

[00518]典型的达巴万星化合物包括达巴万星A₀、A₁、B₀、B₁、C₀和C₁。这些达巴万星化合物的制备广泛描述在美国专利申请公开第US2004/0142883号中。这些达巴万星化合物进一步描述在以上部分中。当然，本发明组合物可以包括没有列在以上典型达巴万星化合物中的另外的达巴万星化合物。

[00519]在某些实施方案中，组合物包含本发明化合物的多聚体。多聚体可以是二聚体、三聚体或更大的多聚体。多聚体可以是均聚物、杂聚物或均聚物和杂聚物的混合物。例如，多聚体可以包括达巴万星组合物中存在的任何因子的组合，包括任何达巴万星因子A₀、A₁、B₀、B₁、B₂、C₀、C₁、D₀、D₁、MAG或异B₀。例如，多聚体可包括N¹⁵-烷基达巴万星化合物和N¹⁵，N¹⁵-二烷基达巴万星化合物。在某些实施方案中，本发明还提供了本发明化合物的同型二聚体。在进一步的实施方案中，本发明提供了本发明化合物与达巴万星化合物的异二聚体。达巴万星化合物可以是本发明的达巴万星或是本领域技术人员已知的达巴万星。

[00520]在某些实施方案中，本发明组合物相对于达巴万星或抗生素A 40926化合物包含显著量的本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物。在某些实施方案中，相对于达巴万星或抗生素A 40926化合物，本发明的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物至少是组合物的0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.6、1.7、1.75、1.8、1.9、2.0、2.5、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98或99％。在优选实施方案中，化合物是式(V)化合物。

[00521]在某些实施方案中，本发明组合物相对于达巴万星化合物包含显著量的本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物。在某些实施方案中，相对于达巴万星化合物，本发明的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素本发明化合物至少是组合物的0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.6、1.7、1.75、1.8、1.9、2.0、2.5、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98或99％。在优选实施方案中，化合物是式(V)化合物。

[00522]在某些实施方案中，本发明组合物相对于抗生素A 40926化合物包含显著量的本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物。在某些实施方案中，相对于抗生素A 40926化合物，本发明的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物至少是组合物的0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.6、1.7、1.75、1.8、1.9、2.0、2.5、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98或99％。在优选实施方案中，化合物是式(V)化合物。

[00523]在某些实施方案中，本发明组合物相对于其它化合物包含显著量的本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物。在某些实施方案中，相对于其它化合物，本发明的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物至少是组合物的0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.6、1.7、1.75、1.8、1.9、2.0、2.5、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98或99％。在优选实施方案中，化合物是式(V)化合物。

[00524]在进一步的实施方案中，本发明提供了包含达巴万星A₀、A₁、B₀、B₁、C₀和C₁连同本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的组合物，其中，本发明化合物的量相对于一种或多种或全部达巴万星A₀、A₁、B₀、B₁、C₀和C₁是富集的。该组合物可以是富集的，例如，以使得N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物相对于一种或多种或全部达巴万星A₀、A₁、B₀、B₁、C₀和C₁至少是组合物的0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.6、1.7、1.75、1.8、1.9、2.0、2.5、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98或99％。在优选实施方案中，化合物是式(V)化合物。

[00525]在某些实施方案中，本发明提供了包含达巴万星B₀和本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的组合物。在进一步的实施方案中，本发明提供了包含达巴万星B₁和本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的组合物。在进一步的实施方案中，本发明提供包含达巴万星B₀、达巴万星B₁和本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的组合物。在优选实施方案中，本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物是式(V)化合物。在特别优选的实施方案中，本发明提供了包含式(V)化合物、达巴万星B₀和达巴万星B₁的组合物。这些组合物可以是纯化、分离、或纯化和分离的。在某些实施方案中，组合物是90、91、92、93、94、95、96、97、98、98.5、99或99.5％纯的。″纯″指的是组合物包含组合物化合物的量。例如，包含式(V)化合物、达巴万星B₀和达巴万星B₁的组合物相对于组合物中的其它化合物将包含至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、98.5、99或99.5％的这三种化合物。可以通过本领域技术人员已知的任何方法例如HPLC，例如通过％曲线下面积评价纯度。

[00526]在本发明组合物中，可用重量、摩尔量或本领域技术人员已知的其它技术计算各个组分的量。

使用方法

[00527]提供了向需要治疗细菌感染的个体施用本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的方法。在一个实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物是式(V)化合物。治疗可以包括预防、治疗或治愈。方法包括以治疗或预防有效量施用N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物。

[00528]当用于本文中时，″治疗有效量″指的是当给患者施用治疗疾病时，将达到所需治疗结果(例如减轻或消除细菌感染)的化合物或组合物的量。″治疗有效量″尤其可以根据化合物、疾病及其严重性、和所治疗的患者的年龄、体重等而改变，并且可以一个或多个剂量施用。″预防有效量″指的是当给易被细菌感染和/或可患上细菌感染的个体施用时，足以预防将来细菌感染或减轻其严重性的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的量，所述易感例如由于医疗操作或住院，或暴露于被细菌感染的个体。N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以在药学可接受的载体中给药。

[00529]N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以作为N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素制剂中的″单位剂量″给药，该制剂包括当给个体施用时足以提供化合物治疗或预防有效的血浆水平持续数天、至少约5天、一周或10天的化合物的量。在一些实施方案中，化合物是式(V)化合物。在一些实施方案中，化合物是制剂组分，该制剂包括足以提供化合物治疗或预防有效水平持续数天、常常至少约5天、一周或10天的化合物的量。给药间隔，或剂量之间的时间，可以是例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多天中的任何一个。

[00530]当用于本文中时，术语″个体″或″对象″或″患者″可互换使用，指的是脊椎动物、通常是哺乳动物、常常是人类。

[00531]另外，本发明的化合物或组合物可以与抑制化合物、组合物和/或组合物中存在的一种或多种其它N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素或其它抗生素组分降解的稳定剂一起制剂。在一些实施方案中，稳定剂选自甘露醇、乳糖、蔗糖、山梨醇、甘油、纤维素、海藻糖、麦芽糖、棉子糖及其混合物。在一个实施方案中，制剂包含甘露醇。在另一个实施方案中，制剂进一步包含乳糖。在一个实施方案中，组合物可以1∶2重量比的甘露醇：N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物配制。在另一个实施方案中，组合物可以以1∶1∶4重量比的甘露醇∶乳糖∶N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物配制。

[00532]在一些实施方案中，组合物或其它制剂包含N¹⁵，N¹⁵二甲基抗生素化合物、达巴万星化合物或其组合。组合物或其它制剂可以以导致药物治疗有效(即杀菌)血浆水平持续数天、常常至少约5-约10天、常常至少约一周的剂量给药。例如，血浆中的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合或组合物可以维持在或维持高于约4mg/l的最小杀菌浓度持续至少5天。N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以维持血浆水平在至少约5mg/l、至少约10mg/l、至少约20mg/l、至少约30mg/l、至少约40mg/l，持续至少5天、至少约一周或更长时间。可以用本领域公知的方法测量N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的血浆浓度，例如液相色谱法、质谱法、或微生物生物检定法。

[00533]N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物血浆浓度水平的上限可以由抑制所治疗的患者人群中不能接受的不良作用的剂量来决定。

[00534]N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以以单剂量或多剂量施用。当作为单剂量施用时，可以将N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物制成包含足量的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物，以实现体内抗菌性质至少5天，可选地至少6天，可选地至少7天，可选地至少8天，可选地至少9天，可选地至少10天，可选地至少11天，可选地至少12天，可选地至少13天，可选地至少14天，可选地至少15天。

[00535]当采用多剂量时，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以每周一次给药，持续两周或更多周。在一个实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以以至少两个剂量给药，常常是两个剂量间隔约5-约10天，更经常是一周一次，持续两周。在某些实施方案中，该方案相对于传统抗生素治疗方案提供了显著的优点。

[00536]N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物也可以以多剂量给药，间隔两天或更多天或至少一周，或以一个或多个两周一次剂量。在一些实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以每周一次给药，接着两周一次，或每月一次给药。在一些实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以以每周一次的间隔给药2、3、4、5、6周或更多周。

[00537]最有利地，因为使用了较高的较低频率剂量，所以不需要N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物每天给药。例如，单剂量或多剂量可以为约0.1-约5克。可以施用约0.1-约4克例如约3g的单剂量以用于治疗各种感染。当施用多剂量时，例如每周一次，各剂量可在约0.25-约5.0克的范围内。

[00538]就其中施用单剂量治疗感染的实施方案而言，剂量可以是约0.1-约5克、或约0.5-约4克、或约1-约3.5克、或约2-约3克，例如约3克。在一些实施方案中，可施用约1、1.5、2、2.5或3克的单剂量以治疗细菌感染。就其中施用单剂量进行预防的实施方案而言，剂量例如可为约0.1-约3克、或约0.1-约1克，例如约0.5或约0.25克。

[00539]在包括多剂量的给药方案中，单个剂量可相同或不同。在一些实施方案中，可以施用比一个或多个后续剂量更高的第一剂量，可以是例如约1.5-3倍更高。例如，第一剂量可为约0.5克-约5克，且第二剂量为约0.25克-约2.5克，第一剂量可为约0.8-约2g，且第二剂量为约0.4-约1克，或第一剂量可为约0.4-约3g，且第二剂量为约0.2-1.5g。

[00540]在一些实施方案中，施用至少2个剂量，其中第一剂量包括约两倍于后续剂量的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物。在一个实施方案中，第一剂量包括约1克N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物，且后续剂量包括约0.5克。在另一个实施方案中，第一剂量包括约0.5克，且后续剂量包括约0.25克。

[00541]在一些实施方案中，可以间隔两天或两天以上或间隔至少约一周以相同或不同量的两个剂量施用N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物。例如，可以间隔约5-约10天或约1周施用两个约0.2-约1.5克剂量的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物。在一个实施方案中，可以间隔约1周施用约1克第一剂量和约0.5克第二剂量的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物。

[00542]在多剂量给药方案中，剂量之间的时间例如可在约5-约10天的范围内，经常是约一周。给药频率可为例如两个每周剂量或多个每周剂量。给药间隔或剂量之间的时间例如可为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25天或更多天中的任何一个。所给的剂量数可以是例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个剂量，初始剂量之后的各剂量在所选剂量间隔以后施用。

[00543]在某些实施方案多个剂量给药方案中，″谷水平″或在第一剂量之后并就在施用第二剂量之前血浆中的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的水平可为至少约4mg/l。在诸如约一周的给药间隔的末期，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的谷水平优选为至少约20mg/l，至少约30mg/l，或至少约40mg/l。

[00544]N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以胃肠外给药，例如肌内(i.m.)、静脉内(i.v.)、皮下(s.c)、腹膜内(i.p.)或鞘内(i.t.)。给药计划与所施用的实际剂量可根据诸如感染性质与严重程度、患者的年龄、体重、全身健康状况和特定患者对N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的耐受性而有所变化，但这对于健康专家而言是可确定的。在一个实施方案中，在N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物1克静脉内剂量一周以后，随后给予0.5克静脉内剂量。

[00545]可以以控制速率将药物施用和传递给患者，例如静脉内，以便血液中的浓度不会增加太快或者发生沉淀。在一些实施方案中，以适当速率施用N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物，以便药物与血流中的内源蛋白形成复合物。不受限于特定理论，相信诸如人血清白蛋白的内源蛋白可在体内与一个或两个分子的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物形成复合物。当存在足量N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素组合物时，相信至多两个N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物分子可结合到内源蛋白上，并且在两个不同结合位点结合独立的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物分子来形成此复合物。可选地，二聚体N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素可以结合到内源蛋白上的单个结合位点上也是可能的。

[00546]N¹⁵，N¹⁵-烷基抗生素化合物或组合物的输注持续时间可以是例如约1分钟-约2小时。例如，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以使用约30分钟的输注持续时间，其中剂量可以是约0.5-约1克。在控制速率条件下进行静脉内给药可产生比在体外生理pH下在溶液相中可达成的浓度远远过量的体内N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物浓度。尽管不希望受限于理论，但此可归因于N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素与诸如血清白蛋白的内源蛋白形成复合物，其可增加血浆吸收N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的容量。

[00547]在某些实施方案中，在体外或离体形成N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素复合物可允许更快的给药，例如至少约1分钟、至少约10分钟或至少约20分钟。通过将人血清白蛋白和/或另一种内源蛋白与N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物混合可形成所述复合物，从而在体外或离体形成复合物，并且接着将此复合物给所治疗的患者施用。可选地，人血清白蛋白或其它内源蛋白可从自体来源获得，或从经修饰以含有用于所述蛋白的基因的微生物通过表达来获得。

[00548]所施用的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的量可以是本文公开的任何剂量。可选择剂量以便一种或多种N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物维持在治疗或预防有效(即杀菌)的血浆水平持续一段延长时间，如至少5天，或约一周或更长时间。优选施用可产生并维持杀菌浓度至少约一周(或约5-约10天)的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物剂量。杀菌浓度可以定义为经24小时杀死体外实验最初存在的细菌中至少约80％，至少约85％，至少约90％，或至少约95％、96％、97％、98％或99％中的任何一个所需要的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的浓度。血浆中N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的最小杀菌浓度可为约4mg/l。

[00549]可以使用N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物以及本发明方法预防或治疗的适应症的实例包括复杂和非复杂的SSTI、血流感染(BSI)、与导管相关的血流感染(CRBSI)、骨髓炎、假体关节感染、外科预防、心内膜炎、医院或社区获得性肺炎、肺炎球菌性肺炎、发热中性粒细胞减少的经验疗法、关节腔感染和装置感染(例如起搏器和内部心脏除颤器)。可以预防或治疗革兰氏阳性或耐抗生素的细菌感染，例如杆菌、棒状杆菌、李斯特菌属、肠球菌、葡萄球菌、链球菌、奈瑟菌属、或梭菌属感染，尤其是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、A群和C群链球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、淋病奈瑟菌或艰难梭菌。可以用本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物、组合物和方法预防或治疗的其它感染包括革兰氏阴性菌，例如巴尔通体属、布鲁氏菌属、弯曲杆菌属、肠杆菌属、埃希氏杆菌属(以及其它Proteobactria)、弗朗西斯氏菌属、缠绕杆菌属、嗜血杆菌属、克雷伯氏菌属、军团杆菌属、钩端螺旋体属、摩根氏菌属、莫拉菌属、变形杆菌属、普罗威登斯菌属、假单胞菌属、沙门氏菌、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、寡养单胞菌属、弧菌属和耶尔森氏菌属感染，尤其是大肠埃希菌、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌和酵母菌如白色念珠菌感染。

[00550]本发明还包括用本发明化合物、组合物和方法预防或治疗其它感染菌，例如幽门螺旋杆菌、Borelia burgdorferi、嗜肺性军团菌、子孢子分枝杆菌(Mycobacteria sporozoites)(属)(例如结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌(Mycobacteriaintracellular)、Mycobacteria kansaii、戈氏分枝杆菌)、脑膜炎奈瑟菌、单核细胞增多性李司特菌、酿脓链球菌(A群链球菌)、无乳链球菌(B群链球菌)、草绿色链球菌、牛链球菌、厌氧性链球菌、致病弯曲杆菌属、肠球菌、流感杆菌、Bacillus antracis、白喉棒状杆菌、棒状杆菌属、猪红斑丹毒丝菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌、破伤风梭状芽孢杆菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀巴斯德氏菌、类杆菌属、具核梭杆菌、念珠状链杆菌、Treponema pallidium、细弱密螺旋体、钩端螺旋体属和以色列放线菌感染。

[00551]本文所述的预防和治疗感染和疾病可用本发明的化合物、组合物和方法来完成。在一个实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物是式(V)化合物。在一些实施方案中，患者先前没有用一种或多种抗生素如万古霉素或替考拉宁治疗过。在其它实施方案中，患者先前没有用N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物治疗过。在一些实施方案中，患者先前已经测试了细菌对抗生素的耐药性。在其它实施方案中，患者先前还没有测试过细菌对抗生素的耐药性。

[0052]本发明还包括预防或治疗SSTI的方法。可从该预防或治疗中获益的患者可能患有深部或浅表感染。SSTI可包括较深的软组织和/或需要显著的外科手术干预，例如严重脓肿、感染的溃疡、重度烧伤或深度和大面积蜂窝织炎。也可预防或治疗手术伤口感染。

[00553]皮肤和皮肤结构感染的临床表现可从轻度毛囊炎到严重坏死性筋膜炎而有所不同。获得模式也可随社区获得性皮肤和皮肤结构感染而有所变化，所述感染之前是由职业暴露或娱乐活动引起的损伤并通常与病原体较大的多样性相关。医院获得性皮肤和皮肤组织感染通常与外科手术、褥疮和导管插入有关。手术后感染是第三常见的医院感染，并占向全国院内感染监测系统(NNIS)报道的所有医院感染的17％。最常见的感染源是患者的内源菌群。金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性的葡萄球菌和肠球菌属是最经常从SSTI分离出的病原体。

[00554]SSTI感染的症状可包括红斑、触痛或疼痛、发热或局部温热、排液或淌液、肿胀或硬化、发红或波动。可得益于以本发明方法进行治疗的患者包括具有深部或复杂感染或需要外科手术干预的感染的患者，或具有潜在糖尿病或外周血管疾病的患者。所述感染经常是由革兰氏阳性菌引起的，例如葡萄球菌或链球菌种，例如金黄色葡萄球菌或酿脓链球菌。治疗皮肤或软组织细菌感染的方法包括以一定量并根据上述给药方案将治疗有效剂量的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物对需要治疗的个体给药。在一个实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物是式(V)化合物。在一个实施方案中，分两个剂量静脉内施用N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物，经常是间隔约5-约10天，更经常是间隔约1周。在一些实施方案中，第一剂量包括至少两倍于第二剂量的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物。在一个实施方案中，第一剂量是约1000mg，且第二剂量是约500mg。

[00555]正如本领域技术人员可以理解的，本文所述的给药方法尤其可以根据化合物、疾病及其严重性、被治疗患者的年龄、体重等而改变，但也是医师不经过度的实验就可确定的。

[00556]本发明还提供了用于预防性防止细菌感染发作的方法，例如是由金黄色葡萄球菌、或由奈瑟菌属或梭菌属细菌引起的感染。在本发明的预防方法中，将预防有效量的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物给例如通过医疗程序可能对患上细菌感染敏感的个体施用。N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以以足以提供预防有效的血浆水平持续至少约1天、至少约3天、至少约5天、或至少约一周或更长时间的量来施用。N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可在外科手术之前或之后或在外科手术同时作为抗感染的预防步骤例如胃肠外施用，例如经由i.m.、i.v.、i.p.、s.c或i.t.注射。可在诸如外科手术的侵入性医疗程序或在诸如医院的医疗护理机构中住院之前、之后即刻，之前或之后一天或多天或约一周或期间施用N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物以预防感染。预防方法可用于其中个体可能或很可能染上细菌感染的任何情形中，包括其中个体已经暴露于或很可能暴露于细菌感染的个体的情形。就预防方法而言，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可作为单剂量施用，或作为两个或两个以上相同或不同量的剂量间隔数天到约一周施用。在一个实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可在插入静脉内导管之前或同时施用，以预防血流的相关感染。在一个实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物是式(V)化合物。

[00557]就预防方法而言，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以根据上述任何给药方案以单剂量或多剂量施用。N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以作为包含约0.1-约3克、或约0.1-约1克，例如约0.25克或约0.5克的单剂量施用。在一个实施方案中，经过约2分钟-约1小时(例如约30分钟)的时限静脉内施用约0.25克的单剂量。在另一个实施方案中，可与另一药物(例如抗生素)治疗的施用同时经静脉内施用N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物。

[00558]在任何上述治疗或预防方法中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以与至少一种其它抗生素同时或相继施用。在一些实施方案中，除N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素之外可以施用至少一种其它抗生素，它对一种或多种N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物不能有效对抗的革兰氏阴性菌种和/或革兰氏阳性菌株有效(例如杀菌)。在一些实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物和可以有效对抗(例如杀菌)至少一种革兰氏阴性菌种的至少一种抗生素是作为达巴万星组合物中的混合物施用的。

药物组合物

[00559]本发明提供了为根据上述方法施用N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物而配制的药物组合物。本发明的药物组合物可以是N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的单位剂量形式，它包括当化合物或组合物给个体施用时，足以提供治疗或预防有效的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物血浆水平持续数天(至少约3天、至少约5天、或至少约一周或更长时间)的量的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物，以及药学可接受的载体。一般而言，治疗或预防有效的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物血浆水平可以是至少约4mg每升血浆。N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物血浆水平可以通过本领域公知方法测量，例如液相色谱法、质谱法或微生物生物检定。如本领域技术人员公知的，血清中其它N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物水平可以用类似方法来定量。

[00560]N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以任选为药学可接受的形式用于给个体施用，例如作为药学可接受的无毒性的盐。

[00561]N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的适当的盐的实例包括通过与有机和无机酸发生标准反应所形成的盐，所述酸是例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、琥珀酸、柠檬酸、抗坏血酸、乳酸、马来酸、谷胺酸、樟脑酸、戊二酸、乙醇酸、邻苯二甲酸、酒石酸、月桂酸、硬脂酸、水杨酸、甲磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸等酸。可与达巴万星形成盐的碱的代表性实例包括碱金属或碱土金属氢氧化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁和氢氧化钡；氨和脂肪族、脂环族或芳族胺，例如甲胺、二甲胺、二乙胺、乙醇胺和甲基吡啶(参见例如美国专利第5,606,036号)。

[00562]在一些实施方案中，提供适合于胃肠外给药例如静脉内注射的药学可接受的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的含水制剂。在一个实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物是式(V)化合物。为了制备该N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的含水制剂，可使用现有技术公知的方法，且可使用现有技术通常使用的任何药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或或其它添加剂。在一个实施方案中，用于静脉内注射的药学可接受的含水制剂包括5％右旋糖。

[00563]用于胃肠外给药的药物组合物包括N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物和生理可接受的稀释剂，例如去离子水、生理盐水、5％右旋糖、水混溶性溶剂(例如乙醇、聚乙二醇、丙二醇等)、非水性媒剂(例如油，如玉米油、棉籽油、花生油和芝麻油)或其它常用稀释剂。制剂可进一步包括例如聚乙二醇、聚丙二醇或其它已知增溶剂的增溶剂、用于稳定溶剂的缓冲剂(例如柠檬酸盐、乙酸盐和磷酸盐)和/或抗氧化剂(例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠)(参见例如美国专利第6,143,739号)。其它合适的药学载体及其制剂描述在E.W.Martin的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中。如现有技术中已知的，还可以将本发明的药物制剂制备成含有可接受水平的颗粒(例如无颗粒)和制备成无热原(例如符合美国药典中的可注射要求)。

[00564]在一个实施方案中，通过将经干燥(例如冻干)的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物剂量(其经常含有稳定剂或稳定剂混合物)溶解于体积足以溶解的一定量的水中并优选地溶解于去离子水中来提供药物组合物。例如，足以进行溶解的水的量可以是大约10mL，并且所得的pH值可以高于3.0，约3.5到4.5。通过将该溶液加到第二份量的含水稀释剂中而稀释该溶液，所述含水稀释剂包含5％右旋糖，例如用于静脉内给药的滴液袋中所含的量，从而可将溶液的pH升高至约5-5.5。在另一个实施方案中，滴液袋中溶液的pH可以是约4.5。第二份量的含水稀释剂可以被去离子或灭菌，或既去离子又灭菌。在一个实施方案中，含水稀释剂是5％右旋糖。其它溶解方法及其N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素制剂将对本领域技术人员来说是显而易见的。

[00565]可以在其中可以保持N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的杀菌有效性的条件下在无菌小瓶中构成用于胃肠外使用的药物组合物，其含有上述治疗或预防有效量的一个或多个单位剂量的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物，任选包括赋形剂。化合物或组合物可呈或可不呈干(例如冻干)粉形式。在使用前，可以加入生理可接受的稀释剂，并通过注射器取出溶液以给患者施用。上述药物制剂可以通过任何可接受的方式灭菌，所述方式例如包括电子束或γ灭菌法或通过无菌过滤。

[00566]用于胃肠外给药的制剂可以包括N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物，其浓度例如是每毫升最终制剂中约0.1-约100mg、约0.5-约50mg、约1-约10mg、约1-约5mg、或约2-约4mg N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物。在一个实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物是式(V)化合物。

[00567]在一些实施方案中，本发明的药物组合物包括N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物和一种或多种另外的抗生素的混合物。优选地，混合物中的至少一种非达巴万星抗生素可以有效对抗(例如杀菌)一种或多种革兰氏阴性菌种(诸如阿苏胺)和/或有效对抗(例如杀菌)N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物所不能有效对抗的一种或多种革兰氏阳性菌株(诸如利奈唑胺或达托霉素)。混合物也可以包括上述药学可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物包含N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物和一种或多种另外的抗生素，在一些实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素组合物包含式(V)的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物。

[00568]在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含一种或多种抑制一种或多种N¹⁵，N¹⁵二烷基抗生素化合物降解为活性较低或无活性材料的稳定化物质。当用在本文中时，“稳定化物质”或“稳定剂”指的是稳定组合物中存在的一种或多种N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的水平的物质。“稳定有效量”指的是足以提高可以存在于组合物中的一种或多种N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的长期稳定性的稳定剂的量。在一些实施方案中，可通过两种或两种以上稳定化物质的混合物提供稳定有效量，其中单独各物质不以足以提供稳定化效果的量存在。

[00569]稳定剂的实例例如包括非离子物质，如糖，例如单、二或多糖或其衍生物；糖醇；或多元醇。所述稳定化物质例如包括甘露醇、乳糖、蔗糖、山梨醇、甘油、纤维素、海藻糖、麦芽糖、棉子糖或其混合物。

[00570]在一个实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素制剂包含甘露醇。在另一个实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素制剂进一步包含乳糖。在一个实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素组合物以1∶2重量比的甘露醇：N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物配制。在另一个实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素组合物以1∶1∶4重量比的甘露醇∶乳糖∶N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物配制。甘露醇和乳糖的组合可以比单独各个物质提供更大的稳定作用。本发明药物组合物的pH可以是例如约2-约9，可选地约3-约8，可选地约4-约7，可选地约5-约6，可选地约3.5-约4.5。本发明药物组合物的pH还可以是例如，低于约9，可选地低于约8，可选地低于约7，可选地低于约6，可选地低于约5，或可选地低于约4。本发明药物组合物的pH还可以是例如，大于约2，大于约3，可选地大于约3.5，可选地大于约4，可选地大于约4.5，可选地大于约5.0，可选地大于约5.5，可选地大于约6.0，可选地大于约6.5，或可选地大于约7.0。

[00571]在一些实施方案中，可以采用一种或多种方法来减少MAG(本发明N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或不含酰基葡糖醛胺部分的达巴万星化合物的衍生物)和/或其它降解产物的形成。例如，在稳定物质如甘露醇的存在下冻干N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以用来减少所形成的MAG的量。

[00572]可以将N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物和组合物保存在低于环境温度、如约5℃下，以提高稳定性。

[00573]如本文实施例所证明，每周一次以高剂量水平(即导致异常高和持久的血清水平)施用N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以显示出异常好的安全性，其类似于或优于每天一次甚或每天2-4次施用较低剂量的常规抗生素的标准治疗所观察到的安全性。可以以比其它抗生素更低的频率施用高剂量(即导致异常高和持久的血清水平，例如200-5000mg)的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物且不具有不良副作用，从而能够改进功效和患者依从性。

[00574]在某些实施方案中，以N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物进行治疗导致低的不良事件发生率。严重不良事件包括在任何剂量下发生的导致死亡、危及生命、导致住院或现有住院延长、或持久的或显著的能力丧失或无力的任何不良药物经历。

药盒

[00575]本发明还包括用于细菌感染的治疗或预防方法中的药盒。药盒可以包括本发明药物化合物或组合物(例如包括至少一个单位剂量的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物)与向健康护理提供者提供治疗或预防细菌感染的用法的相关信息的说明书。说明书可以印刷形式、或以诸如软盘、CD或DVD的电子介质形式、或以其中可获得所述说明书的网址形式提供。单位剂量的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物可以包括当对个体施用时使得治疗或预防有效的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物血浆水平可以在个体内维持至少5天的剂量。在某些实施方案中，药盒包括有待间隔至少5天、间隔约1周施用的两个单位剂量，或包括可比第二剂量高出约1.5到约3倍的第一剂量的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物。在一些实施方案中，可以包括作为无菌含水药物组合物或干粉(例如冻干)组合物的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物。在一个实施方案中，N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物是式(V)化合物。

[00576]在一些实施方案中，提供了合适的包装。当用于本文中时，“包装”指的是通常用于系统中并且能够将适于对个体施用的N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物保持在固定范围内的固体基质或材料。所述材料包括玻璃和塑料(例如聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯)瓶、小瓶、纸、塑料和塑料箔层压的封套及其类似物。如果使用电子束灭菌技术，那么包装应具有足够低的密度以允许对内容物灭菌。

[00577]药盒还可以任选包括用于施用N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物的设备，例如用于静脉内给药的注射器或设备；和/或用于制备供给药用的干粉(例如冻干)组合物的无菌溶液，例如稀释剂，如5％右旋糖。

[00578]本发明的药盒除N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物之外还可包括非达巴万星抗生素或非达巴万星抗生素的混合物以如以上方法中所述与N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物或组合物一起使用。

[00579]提供下列合成和生物学实施例，以阐明本发明，且并不以任何方式解释成限制本发明范围。

实施例

[00580]实施例15：纯化N¹⁵，N¹⁵-二甲基达巴万星B₀

[00581]在上面描述了制备A-40926并随后合成达巴万星。本实施例描述了从根据本发明制备的达巴万星化合物的混合物中纯化式(V)的N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物，即N¹⁵，N¹⁵-二甲基达巴万星B₀。对本领域技术人员显而易见的是，N¹⁵，N¹⁵-二甲基达巴万星B₀是在N¹⁵上含两个甲基的经过修饰的达巴万星B₀。就该实施例和下列实施例的目的来说，在其中化合物尚有待完全表征的部分中，N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素B₀被称为″化合物A″。并且，为在以下部分中方便起见，将N¹⁵，N¹⁵-二甲基达巴万星B₀称为达巴万星B₂。N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素B₀、达巴万星B₂和化合物A是相同的分子。

[00582]样品制备

[00583]在真空下通过乙腈和水蒸发，从来自根据本文方法制备的达巴万星纯化的约2L有机-含水溶液浓缩。向剩余物中加入二乙醚，得到6g固体粗品。溶于水/乙腈90/10v/v混合物中以后，用水(pH3乙酸)/乙腈不连续梯度洗脱，将固体在硅烷化硅胶上纯化(柱床体积1L；柱id＝5cm)。收集含化合物A的级分、浓缩至较小体积(数ml)，并进行制备型HPLC纯化。

[00584]收集富集级分。在真空乙腈蒸发和冻干以后，回收数μg化合物A。

[00585]实施例16：化合物A的N¹⁵胺取代基的鉴定

[00586]化合物A具有1828 Da的分子量，比达巴万组分B₀和B₁(M.W.1814)多14个单位。HPLC-ESI-MS分析证实，不像复合物的其它组分，变化发生在末端氨基的N¹⁵上。

[00587]具有甲胺基团(R-NHCH₃)的其它达巴万星化合物在其碎片质谱(ESI-MS/MS)中显示有31个单位(-NH₂CH₃)的中性丢失。化合物A的碎片质谱显示有45个单位的丢失，而不是31个单位。这种类型的中性丢失可以用两种结构假说来解释：N¹⁵可能是N，N-二甲胺基团(R-N(CH₃)₂，叔胺)或N-乙胺基团(R-NHCH₂CH₃，仲胺)。

[00588]水解的和衍生的化合物A的HPLC-ESI-MS分析可以在这两个假说之间辨别。图29显示了酸水解之后源于B₀的三个肽碎片。形成了两个二肽，含氨基N¹⁵和氯原子的″AA1+AA3″，″AA5+AA7″，和含氯原子的三肽″AA2+AA4+AA6″。其它水解产物是脂肪酸和DMEPA4(二甲氨基-丙基氨基)链。

[00589]对于化合物A来说，二肽″AA1+AA3″必须是不同的，如图30所示。可以通过将水解产物与衍生化试剂(derivatizing agent)反应来验证正确的假说，其中该衍生化试剂只与伯胺和仲胺反应(参见图31)。

[00590]组分B0的二肽″AA1+AA3″应当与两组衍生化试剂反应(参见图31a)。对于化合物A来说，根据氨基N¹⁵可以获得两种不同的衍生肽″AA1+AA3″(图31b)。根据所提出的假说在理论上预期这两个分子将具有用质谱分析很容易区别的分子量。

[00591]材料

[00592]化合物A

[00593]达巴万星

[00594]盐酸37％，试剂级，Rudi Pont cod.750-11

[00595]甲醇HPLC级，J.T.Backer cod.8402

[00596]AccQ TagTM Chemistry Package，Waters cod.WAT052880

[00597]水解

[00598]在PICO-TAG Work Station(Waters，Mildoford，MA，USA)中进行样品和标准品的水解。

[00599]在含1％(w/v)苯酚的6N HCl的存在下，在105℃下将所有的360μg化合物A和约1mg达巴万星标准品水解24小时。冷却反应混合物，蒸发至干燥，并用甲醇调节至最终体积500L。

[00600]衍生化

[00601]选择Waters AccQ-FluorTM试剂盒进行肽衍生化。AccQ-Fluor试剂是一种N-羟基琥珀酰亚胺-激活的杂环氨基甲酸酯胺衍生化合物。该衍生化试剂的结构和反应路线图记录在路线图2中。

路线图2

[00602]将1mL″试剂稀释剂″加到含″试剂粉末″的小瓶中。将小瓶涡旋10秒钟，并加热至55℃，直至完全溶解。重构的AccQ-Fluor试剂大约是10mM乙腈溶液。将20μl水解的样品或标准品放入有圆锥形塞子的小瓶中，并加入20μl″AccQ-Fluor硼酸盐缓冲剂″，并简单涡旋。这时，加入40μl重构的AccQ-Fluor试剂，并将样品涡旋30sec。在55℃加热小瓶持续10min。在这些条件下，氨基应当反应，且可能的副产品应当减少到最低限度。该反应以后，样品就准备好了进行HPLC分析。

[00603]HPLC-UV-MS分析

[00604]Thermo Finnigan Surveyor MS泵，二极管阵列检测器和自动进样器，

[00605]装配有ESI接口的ThermoQuest Finnigan LCQ Deca质量检测器。

[00606]色谱：柱：AccQ-TagM(Waters C18 NovoPak 4_m 3.9×150mm)；柱温：37℃；流速：1mL/min；相A：醋酸铵140mM pH5(乙酸)；相B：水/乙腈60/40v/v；UV检测器：254nm；注射体积：20μl。从柱中得到的洗脱液分流同时进行UV和质量检测。

[00607]质谱法

[00608]样品输入条件：毛细管温度：200℃

[00609]套管气体：N₂，40(任意单位)

[00610]辅助气体：N₂，20(任意单位)

[00611]样品输入电压设置：极性：阳性

[00612]电源电压：4.7kV

[00613]毛细管电压：10V

[00614]管镜片偏移距：40V

[00615]扫描条件：扫描方式：完全ms

[00616]扫描范围：100-700amu

[00617]微扫描次数：3

[00618]最大离子时间：50ms

[00619]结果

[00620]用HPLC分离衍生的和水解的达巴万星碎片，并用ESI-MS评价(数据未显示)。碎片AA1+AA3大小为737(m/z)，碎片AA5+AA7大小为689(m/z)，且碎片AA2+AA4+AA6大小为1086(m/z)。

[00621]用HPLC分离化合物A的衍生的和水解的碎片，并用ESI-MS评价。碎片AA1+AA3大小为737(m/z)，碎片AA5+AA7大小为581(m/z)，且碎片AA2+AA4+AA6大小为1086(m/z)。

[00622]AA5+AA7的大小证明了化合物A是N¹⁵，N¹⁵-二甲基化合物。

[00623]实施例17：达巴万星B₀的甲基化

[00624]按照以上概述的方法制备达巴万星B₀，并按照美国专利申请公开第2004/0142883号中描述的方法用HPLC纯化。将达巴万星B₀样品进行选择性仲胺N-甲基化，生成N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素B₀。然后在下列实施例中用HPLC-UV和HPLC-UV-MS分析反应混合物。

[00625]材料

[00626]达巴万星B₀

[00627]水，MmilliQ级

[00628]NaBH₃CN，氰基硼氢化钠，Fluka cod.71435

[00629]DMF，N，N-二甲基甲酰胺，Carlo Erba cod.444926

[00630]HCHO，甲醛溶液，36.5％水溶液，Reidel de Haen cod.33220。

[00631]NaHCO₃，碳酸氢钠，试剂级

[00632]方法

[00633]将49.5mg达巴万星溶于12.5 ml水和1.5mL DMF，并装入圆底烧瓶(pH3.5)。取出200μl的三个小份并用800μl水稀释(t0)。加入76μl甲醛的3 6％(v/V)水溶液和2.5mg碳酸氢钠(pH5.8)。在碳酸氢钠完全溶解之后在搅拌下加入8mg NaCNBH₃。立即取出该反应混合物的200μl的三个小份，并用800μl水和300μlCH₃CN稀释，以得到澄明溶液(t0′)。将反应混合物放在室温中30分钟。在10分钟和30分钟之后，通过提取200μl的3小份从反应介质中取样，每一份都用800μl水和300μl CH₃CN稀释(t10和t30)。

[00634]在30分钟之后，通过将烧瓶冷却至-20℃而停止反应。用HPLC-UV和HPLC/UV/MS分析监测反应。

[00635]实施例18：N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素B₀的结构证实

[00636]该实施例证实了来自以上实施例的化合物A和N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素B₀是完全相同的。

[00637]用HPLC-UV分析反应样品t0、t0′、t10和t30，并与参比标准进行比较。t0、t10和t30的色谱非常相似，证明立即发生了甲基化作用。

[00638]在图33中显示了t0′相对于t0的色谱。甲基化B₀显示出了与来自以上实施例15的化合物A相同的保留时间。从而证明了该假说，即，化合物A是B₀的甲基化衍生物，因此化合物A的脂肪酸侧链是10-甲基十一烷酸。

[00639]HPLC-UV-MS结果证实了在上一段中报告的HPLC-UV结构结论。N，N′-二甲基B₀的峰与化合物A的峰完全重叠。

[00640]由此证明了化合物A的N¹⁵处的基团是二甲胺基团，而不是乙胺。组分化合物A的阐明结构报告在图28中。

[00641]进一步用NMR、ESI-MS和IR证实化合物A的结构。313K处的NMR谱记录在Bruker AMX 600上。将样品溶解在DMSO-d6中，并用COSY-DFTP、ROESY和HMQC谱测定质子和碳NMR分配。为ROESY实验选择350msec的混合时间。通过电喷射离子化，以阳极模式，在Thermoquest Finnigan LCQ^deca上，在250℃下测定质谱。在KBron aBruker IFS 48仪器中记录红外光谱。

[00642]在图34中提供NMR峰分配。表40报告了与B₀相比的B₂的1H分配。B₂的NMR谱显示出与达巴万星B₀有很多相似。脂肪酸侧链包含异丙基末端基团。大部分质子和碳化学位移与对B₀组分发现的大致相同。对属于氨基酸1的信号可观察到主要的化学位移偏离。特别地，2.31ppm(¹³Cδ 40.06ppm)的单峰给出了完全相应于六个质子和与质子x1、1f和1e相关的NOE。它的化学位移和两极相关提示，该信号归因于属于第一个氨基酸自旋系统的二甲氨基基团。

表40

    B₂              B₀    B₂              B₀    δ¹H    δ¹H    δ¹³C    δ¹H    δ¹H  δ¹³C    w1    -    n.a.     -    6e    7.26    7.28  123.2    CH，    2.31    2.45    30.99    6f    7.42    7.44  126.9    x1    4.43    4.33    66.07    w7    8.41    8.47  -    1b    6.70    6.71    118.5    x7    4.42    4.45  53.3    1e    6.93    7.05    117.6    7d    6.73    6.75  101.1    1f    7.00    7.23    126.65    71    6.43    6.40  107.9    w2    7.36    8.2    -    AG1    5.48    5.40  101.9    x2    4.83    4.79    55.9    AG2    3.72    3.71  55.98    z2    2.81；3.32    2.95；3.37    n.a.    AG3    3.62    3.62  76.11    2b    7.09    7.1    130.6    AG4    3.41    3.51  n.a.    2c    7.17    7.07    123.4    AG5    n.a.    4.27  66.28    2e    6.97    6.97    122.33    AG-NH    7.71    7.77  -    2f    7.63    7.87    131.29    FA2    2.02    2.01  35.8    w3    7.58    7.54    -    FA3    1.43    1.42  24.84    x3    6.10    6.09    54.31    FA4-FA9    1.11-1.22    1.0-1.2  28.8-29.3    3d    6.72    6.55    107.5    FA10    1.50    1.49  27.2    3f    6.49    6.78    107.1    FA11    0.84    0.84  22.34    w4    7.64    7.44    -    FA12    0.84    0.84  22.34    x4    5.60    5.59    54.63    wNN    7.96    8.19  -    4b    5.80    5.78    108.8    NNa    3.31；3.20    3.17；3.40  35.38    4f    5.11    5.08    103.8    NNb    1.65    1.87  23.37    w5    8.36    8.48    -    NNc    2.39    2.96  53.94    x5    4.41    4.35    57.72    NNd    2.24    2.71  42.05    5b    7.10    7.13    135.01    M1    5.27    5.32  96.7    5e    6.71    6.71    116.0    M2    3.25    3.3  70.24    5f    6.71    6.71    125.8    M3    n.a.    3.49  73.6    w6    6.62    6.62    -    M4    n.a.    3.69  72.91    x6    4.14    4.19    61.97    M5    n.a.    3.50  n.a.    z6    5.20    5.38    70.8    M6    n.a.    3.50  60.68    6b    7.69    7.75    126.6

[00643]在图35中提供了红外光谱。在图36中提供了ESI-MS。数据证实了化合物A的结构就是达巴万星B₂(N¹⁵，N¹⁵-二甲基达巴万星B₀)。

实施例19：达巴万星B₂(N¹⁵，N¹⁵-二甲基达巴万星B₀)的活性

[00644]分离N¹⁵，N¹⁵-二甲基达巴万星B₀、数种N¹⁵-单甲基达巴万星化合物和数种已知的抗生素，并在体外测试它们的抗菌活性。根据以上实施例和美国专利申请公开第2004/0142883号中描述的方法制备化合物。用HPLC纯化各达巴万星化合物。

[00645]样品制备

[00646]将分离出的N¹⁵-单甲基达巴万星化合物和N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物溶于0.01N HCl∶DMSO∶95∶5v/v。在溶解之前，用HPLC分析各个样品并定量。制备256μg/mL N¹⁵-单甲基达巴万星化合物(A₀、A₁、B₀和B₁达巴万星)的溶液和128μg/mL分离出的N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素B₀(在下表中称为″B₂达巴万星″)的溶液。

[00647]如表41中的报道，用相对于总色谱面积的面积％评价主峰的色谱纯度：

表41：不同N¹⁵-单甲基和N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物的主峰的色谱纯度

  ID  状态  浓度(μg/mL)  ％主峰  A₀达巴万星  溶液  256  82  A₁达巴万星  溶液  256  80  B₀达巴万星  溶液  256  96  B₁达巴万星  溶液  256  79  B₂达巴万星  溶液  128  72

[00648]微生物学表征

[00649]所测试的化合物包括上述分离出的N¹⁵-单甲基达巴万星化合物和N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物，以及包含N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物的达巴万星组合物(″DA 025/A″)、万古霉素(VA)(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)、庆大霉素(GE)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)、青霉素G(Pen.G)(Sigma Chemical Co.，st.Louis，MO)和两性霉素B(Amph.B)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。

[00650]微生物

[00651]所用的微生物是从美国典型菌种收藏所(ATCC)(Rockville，MD)、SmithKline and French Laboratories(SKF)和Upjohn Company(UC)(Kalamazoo，MI)获得的参比菌株。

[00652]最低抑菌浓度(MIC)测定

[00653]通过肉汤微量稀释法，遵循标准NCCLS操作(NCCLSDocument M7-A6，第23卷，第2期，″Methods for dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that growaerobically.″Approved Guideline. January 2003，它可以被全文引入作为参考)，含或不含30％成年牛血清(BS)(PAA LaboratoriesGmBH，Haidmannweg Pasching Austria)，使用大约5×10⁵ CFU/ml的细菌接种，测定MIC。所用的培养基包括阳离子调节过的M_ller Hinton肉汤(Difco Laboratories，Detroit，MI)，该培养基分别用CaCl₂和MgCl₂调节至最终浓度为20mg/L和10mg/L。在35℃下培养20-24小时以后，读取试验结果。

[00654]结果

[00655]MIC结果总结在下表42中。针对一组革兰氏阳性细菌，各种分离的N¹⁵-单甲基达巴万星化合物和N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物(″B₂″)的活性与DA组合物相当或略微高于DA组合物，其中DA组合物包含N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物的混合物。用于溶解试验化合物的空白溶液(HCL 0.01N/DMSO 95∶5)是没有活性的。

[00656]有意义的是，N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物(″B₂″)显示出了对抗革兰氏阳性菌的活性，该活性可比得上或高于N¹⁵-单甲基达巴万星化合物的活性。例如，在革兰氏阳性菌范围内，N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物(″B₂″)的活性可比得上或高于B₀的活性。

[00657]相当显著的是，N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物(″B₂″)也显示出了对抗所测试范围的革兰氏阴性菌的活性。事实上，在该试验中有对抗代表性革兰氏阴性菌活性的唯一的化合物就是分离出的N¹⁵，N¹⁵-二甲基抗生素化合物(″B₂″)，它的活性为16-32mg/L MIC范围。

[00658]VA和GE参比化合物对抗ATCC参比菌株的MIC值在NCCLS值的范围之内。

表42.不同N¹⁵，N¹⁵-二烷基抗生素化合物和参比菌株的体外活性

MIC(mg/L)

微生物                     A₀        B₀    B₁    B₂   DA       VA  GE    Pen.G Amph.B Blank^*

                                                                          025/A

Siaphylococcus aureus Smith 0.125 0.125 0.25 0.125 0.125 0.25     1     0.5     0.06   ＞64  ＞1∶2

ATCC 19636

S.aureus Smith+30％BS       1     2     2    2     2     2        2     ≤0.125 0.06   ＞64  ＞1.2

S.aureus ATCC2913ref.       0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125   2     8       8     ＞64  ＞1∶2

strain¹

S.epidermidis ATCC 12228    0.125 0.125 ≤0.06 ≤0.06 ≤0.03 0.125  2     ≤0.125 ＞32  ＞64  ＞1∶2

Streptococcus pyrogenes SKF 0.015 ≤0.06 ≤0.06 ≤0.06 ≤0.03 0.06  1      4      ≤0.03 32   ＞1∶2

13400

S.pneumontae Felton UC41    0.125 ≤0.06 ≤0.06 ≤0.06 ≤0.03 0.015  0.5   8      ≤0.03 ＞64 ＞1∶2

Enterococcus faecalis ATCC  0.125  0.125  0.125 0.125  0.06   0.25    1   8      32     ＞64 ＞1∶2

7080

E.faecalis ATCC29212 ref    ≤0.06 0.125  0.125 0.125  0.125  0.25    2   32      4     ＞64 ＞1∶2

strain²

Bacillus sublilis ATCC 6633 ≤0.06 ≤0.06 ≤0.06 ≤0.06 0.03 ≤0.007 0.125 0.25   ≤0.03 ＞64 ＞1∶2

Escherichia coli SKF 12140  ＞64   ＞64   ＞64   ＞64    32   ＞64    ＞128 2     ＞32   ＞64 ＞1∶2

E.coli ATCC25922 ref strain³＞64   ＞64   ＞64   ＞64    32   ＞64    ＞128 1     ＞32   ＞64 ＞1∶2

Proteus vulgaris ATCC 881   ＞64   ＞64   ＞64   ＞64    32   ＞64    ＞128 2     ＞32   ＞64 ＞1∶2

Pseudomonas aeruginosas     ＞64  ＞64    ＞64   ＞64    16   ＞64    ＞128 1     ＞32   ＞64 ＞1∶2

ATCC 101

Candida albicans SKF 2270   ＞64  ＞64   ＞64    ＞64    32   ＞64    ＞128  ＞128  ＞32 0.125 ＞1∶2

上表中：

Staphylococcus aureus/S.aureus：金黄色葡萄球菌，

S.epidermidis：表皮葡萄球菌 Streptococcus pyrogenes：酿脓链球菌，

S.pneumoniae：肺炎链球菌，Enterococcus faecalis/E.faecalis：粪肠球菌，

Bacillus subtilis：枯草杆菌，Escherichia coli/E.coli：大肠埃希氏杆菌，

Proteus vulgaris：普通变形杆菌，Pseudomonas aeruginosas：铜绿假单胞菌，

Candida albicans：白色念珠菌，ref.strain：参比菌株

*不显示活性的最低稀释倍数。

参比菌株MIC的质量控制范围(NCCLS M1OO S-12，Vol.22，No.1，Jan.2002)：

¹VA  0.5-2mg/L

²VA  1-4mg/L

³GE  0.25-1mg/L

实施例20：制备包含达巴万星B₂的达巴万星组合物

[00659]通过制备型HPLC制备包含纯化的达巴万星B₀、达巴万星B₁和达巴万星B₂的组合物。

[00660]用HPLC纯化根据以上方法制备的达巴万星混合物。纯化在Kromasil C18，16μm，100_孔径上进行。缓冲系统是pH被调节至5.5的50mmolar NH₄H₂PO₄水溶液。洗脱的流动相是66/34缓冲液/乙腈混合物。该方法生成了包含97％达巴万星B₀、达巴万星B₁和达巴万星B₂的达巴万星组合物(通过HPLC分析)。典型的分析HPLC色谱图在图37中，其中，达巴万星B₀在约29.901，达巴万星B₁在约30.79(未标记)和达巴万星B₂在约33.282。

异B₀的特征

[00661]异B0的质谱(图38)显示，m/z 1817的离子相应于单质子化了的分子，其它离子则归因于阳离子加合物或部分来源碎片。1816Da的分子量和断裂模式与对B组分观察到的相同，这支持将异B₀鉴定为B₀的非对映异构体(具有反转手性的一个或多个立体异构中心的相同的分子)。

[00662]发现在各个制备步骤中，每当pH增加得太多的时候，异B₀的水平就增加。因此，通过对达巴万星进行碱处理来制备异B₀。

[00663]样品制备(BI-K0096)

[00664]在室温下，通过长时间(大约165小时)用NaOH水溶液(pH 12.7)处理10g第027批次的达巴万星，得到约300mg异B₀。中和以后，回收反应产物为褐色固体粗品，在硅烷化硅胶柱上用水(pH3.5；乙酸)/乙腈以不连续梯度的模式进行洗脱，对该粗品进行加倍色谱纯化。

[00665]从富集级分中分离整整79.98％面积的BI-K0096。HPLC曲线复制在图39中。

[00666]为了验证BI-K0096与达巴万星杂质异B₀的对应关系，用三种不同方法通过HPLC分析制备出的化合物BI-K0096。在所测试的所有条件下，BI-K0096在色谱上与异B₀杂质完全相同。

[00667]结构分析

[00668]MS和MS/MS谱报告在图40A-C。这些质谱与组分B₀的质谱完全相同。从该质量分析不可能证实立体化学差异。

[00669]在600MHz光谱仪上在DMSO-d⁶中记录的异B₀的¹H和¹³CNMR谱揭示了与达巴万星的谱有很多相似的地方，但也有重大区别(分别参见图41和42)。异B₀和B₀的分配报告在表43中，且质子的相应位置鉴定在图43中。

表43.达巴万星异B₀的NMR分配

    分配          异B₀    分配              异B₀    δ¹H    δ¹³C    δ¹H    δ¹³C    w1    n.a.    6e    n.a.    n.a.    CH₃    2.24    33.70    6f    7.42    126.9    x1    4.26    64.65    w7    8.56    -    1b    7.13    120.5    x7    4.45    n.a    1e    6.82    116.6    7d    6.75    101.5    1f    6.97    120.87    7f    6.43    108.18    w2    8.19    -    AG1    5.23    102.0    x2    4.53    55.67    AG2    3.72    55.91    z2    2.80    38.59    AG3    3.55    n.a.    2b    7.01    n.a.    AG4    3.48    n.a.    2c    6.90    n.a.    AG5    3.26    n.a.    2e    7.29    n.a.    AG-NH    7.60    -    2f    7.22    n.a.    FA2    2.0    n.a.    w3    8.44    -    FA3    1.41    n.a.    x3    5.34    54.65    FA4-FA9    1.11-1.30    n.a.    3d    6.51    104.7    FA10    1.49    n.a.    3f    6.0    101.36    FA11    0.85    n.a.    w4    8.59    -    FA12    0.85    n.a.    x4    5.38    55.07    wNN    8.05    -    4b    5.74    109.07    NNa    3.15；323    n.a.    4f    5.12    104.5    NNb    1.63    n.a.    w5    8.32    -    NNc    2.30    n.a.    x5    4.56    53.20    NNd    2.16    n.a.    5b    7.16    135.3    M1    5.21    97.7    5e    6.70    115.88    M2    n.a.    n.a.    5f    6.70    n.a.    M3    n.a.    n.a.    w6    6.59    -    M4    n.a.    n.a.    x6    4.21    62.04    M5    n.a.    n.a.    z6    5.26    71.27    M6    n.a.    n.a.    6b    7.77    126.8

[00670]对于分子的某些部分来说，质子和碳的化学位移与B₀组分大致相同。对属于氨基酸序列1-4的信号可观察到主要的化学位移偏移。这些自旋系统的质子显示出了可忽略的正向或负向Δδ(化学位移差别)。氨基酸3尤其显示出了较大数量的相关改变(x3、w3、3f、3d)；x3也是唯一的共振，显示出它的³J_HH有重大修饰，偶合常数CH(x3)-NH(w3)现在是6.54Hz，相对于B₀中是约10.4。此外，ROESY实验表明x3以及与x3相邻的大部分质子在双极关系中的差别。所报道的NMR结果和所发表的关于替考拉宁差向异构体的文献数据清楚地表明，x3是差向异构中心，且差向异构化作用诱导在至少一部分分子中构象的改变。

微生物学表征

[00671]所用的化合物是：

-前述异B₀

-达巴万星(DA)(BI-K397第025/A/AS1批次)参比标准

-万古霉素(VA)(第121K1140批次Sigma Chemical Co.St Louis，M0，USA)

-庆大霉素(GE)(第57H1099批次Sigma Chemical Co.St Louis，MO，USA)

-青霉素G(Pen.G)(第43H1134批次Sigma Chemical Co.StLouis，MO，USA)

-两性霉素B(Amph.B)(第61H4039批次Sigma Chemical Co.StLouis，MO，USA)。

[00672]将万古霉素、达巴万星和两性霉素B以10mg/mL溶于二甲亚砜(DMSO)，并稀释在蒸馏水中；将庆大霉素和青霉素G溶于蒸馏水。

培养基

[00673]将M_ller Hinton肉汤(Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)分别用CaCl₂和MgCl₂调节至最终浓度为20mg/L和10mg/L。

血清

[00674]成年牛血清(BS)(第A05123-159批次PAA LaboratoriesGmBH Haidmannweg Pasching Austria)。

微生物

[00675]所用的微生物是得自美国典型菌种收藏所(ATCC，Rockville，USA)、Smith Kline and French Laboratories(SKF)和Upjohn Company(UC，Kalamazoo，Michigan，USA)的参比标准菌株。

最低抑菌浓度(MIC)

[00676]用肉汤微量稀释法，遵循标准NCCLS操作[13]，含或不含30％牛血清，使用大约5×10⁵CFU/mL的细菌接种物，测定MIC。在35℃下培养20-24h以后读取试验结果。

结果

[00677]在对抗革兰氏阳性菌方面，异B₀的活性与达巴万星非常相似(参见表44)

表44.异B₀和参比化合物的体外活性

微生物                               MIC(mg/L)异B₀DA025/AVAGEPen.GAmph.B空白活性金黄色葡萄球菌Smith ATCC196360.50.2510.50.06＞64＞1∶2金黄色葡萄球菌Smith+30％BS1622≤0.1250.06＞64＞1∶2金黄色葡萄球菌ATCC 29213参比菌株¹0.250.25288＞64＞1∶2表皮葡萄球菌ATCC 122280.1250.1252≤0.125＞32＞64＞1∶2酿脓链球菌SKF 134000.060.0614≤0.0332＞1∶2肺炎链球菌Felton UC410.1250.0150.58≤0.03＞64＞1∶2粪肠球菌ATCC 70800.250.251832＞64＞1∶2粪肠球菌ATCC 29212参比菌株²0.250.252324＞64＞1∶2枯草芽孢杆菌ATCC 6633≤0.06≤0.007≤0.1250.25≤0.03＞64＞1∶2大肠埃希杆菌SKF 1214064＞64＞1282＞32＞64＞1∶2大肠埃希杆菌ATCC 25922参比菌株³64＞64＞1281＞32＞64＞1∶2普通变形杆菌ATCC 881＞64＞64＞1282＞32＞64＞1∶2铜绿假单胞菌ATCC 10145＞64＞64＞1281＞32＞64＞1∶2白色念珠菌SKF 2270＞64＞64＞128＞128＞320.125＞1∶2

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[00678]尽管已经为清晰理解的目的通过说明和实施例详细地描述了前述发明，但所述领域技术人员应明白在不偏离本发明的精神和范畴下可实施某些改变与修正。因此，所述描述不应理解为限制由附加权利要求所描绘的本发明范畴。

[00679]本文所引用的所有公开出版物、专利和专利申请案均以全文引用方式并入本文中以用于各种目的，程度如同特定和个别地表明各个公开出版物、专利或专利申请案并入作为参考。