抗肥胖免疫原性杂交多肽和包含该杂交多肽的抗肥胖疫苗组合物

摘要

本发明公开了一种包含载脂蛋白B－100的B细胞表位的拟肽和辅助T细胞表位的免疫原性杂交多肽，拟肽的C－末端与辅助T细胞表位的N－末端融合。本发明还公开了一种用于预防或治疗肥胖的包含该多肽的疫苗组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫原性杂交多肽，该杂交多肽包含载脂蛋白B-100的B细胞表位拟肽氨基酸序列，其中此拟肽的C-末端与辅助T细胞表位的N-末端融合，并且涉及包含该杂交多肽用于预防及治疗肥胖的疫苗组合物。

背景技术

近来，由于向西方饮食习惯的转变动脉硬化和冠状动脉粥样硬化病(CAD)在韩国逐渐增加并且成为死亡率增加的主要原因。导致这些疾病的血脂包括胆固醇、甘油三脂(TG)、游离脂肪酸和磷脂。它们与载脂蛋白形成脂蛋白质并且通过血流来运输。其中低密度脂蛋白(LDL)主要功能为运输甘油三脂和胆固醇，低密度脂蛋白-胆固醇水平的变化是疾病的预兆。

低密度脂蛋白-胆固醇是成人脂类代谢相关疾病的主要因素，它与每个组织细胞的细胞膜上的低密度脂蛋白受体相结合并且储存在组织里并被利用。低密度脂蛋白-胆固醇可选择性地被清除细胞吸收水解，而游离胆固醇改结合于高密度脂蛋白随同载脂蛋白E一起在肝中再循环或被转化为胆汁酸盐后排出。在这一过程中，载脂蛋白发挥了非常重要的作用来维持脂蛋白质的结构稳态，它可用作脂蛋白脂肪酶的协同因子并且在与细胞膜上的特异受体结合中起到了关键性的作用。

载脂蛋白B-100(Apo B-100)是低密度脂蛋白的主要蛋白质组分，它还存在于中密度脂蛋白和极低密度脂蛋白中。因此，当血液中的抗体被诱导识别载脂蛋白B-100时，通过吞噬细胞清除低密度脂蛋白将很容易发生。在这种情况下，近期一些研究已集中于应用疫苗来降低血浆里的低密度脂蛋白水平和减少动脉硬化的发生率。由抗胆固醇疫苗治疗所诱导的抗体是被认为结合于极低密度脂蛋白、中密度脂蛋白和低密度脂蛋白的IgM类型，这一策略显示了开发疫苗来预防和治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化的可能性(Bailey等人，胆固醇疫苗，Science 264，1067-1068，1994；Palinski W等人，Proc NatlAcad Sci U.S.A.92，821-5，1995；Wu R，de Faire U等人，Hypertension.33，53-9，1999)。此外，载脂蛋白B-100是一个巨大的蛋白质分子，它由4560个氨基酸残基组成，含有包括24个氨基酸残基的信号肽，分子量大于500kDa(Elovson J等人，Biochemistry，24：1569-1578，1985)。由于载脂蛋白B-100主要由肝分泌并且是两亲分子，它能够与血脂蛋白中的脂质成分和水环境相互作用(Segrest J.P等人，Adv.Protein Chem.，45：303-369，1994)。载脂蛋白B-100稳定低密度脂蛋白粒子的大小和结构并且通过与其受体结合而在调控血浆低密度脂蛋白-胆固醇的稳态中起着关键性作用(Brown MS等人，Science，232：34-47，1986)。

由本发明者申请的韩国专利公开发布号2002-0018971，公开了一种具有抗肥胖作用的载脂蛋白B-100表位的拟肽。然而，此申请仅公开了该B细胞表位拟肽具有抗肥胖作用。

在本发明之前，除了通过使用蛋白质载体或佐剂来增强免疫应答的尝试外，没有关于通过融合载脂蛋白的B细胞表位和T细胞表位使载脂蛋白的免疫原性增强的报道。

如美国专利5,843,446所公开，当促黄体生成素释放激素(LHRH)与不同蛋白质缀合来增强LHRH的免疫原性时，大部分免疫应答针对载体蛋白质而不是LHRH，导致了载体诱导的免疫抑制。因此，需要继续努力筛选其他的物质并确定能够增强B细胞表位的免疫原性的连接模式和连接位点。

为了增强半抗原的免疫原性进行了许多将载体蛋白质与半抗原融合的尝试，但是无法获得一致的增强作用。特别是如本发明的B细胞表位和T细胞表位的线性连接根据表位的方向、每个表位的类型等等(Francis，M.J.等人，Nature 330：168-170，1987)导致了免疫原性的丧失，并且连接子的存在引起抗原性降低(Partidos，C.等人，Mol.Immunol.29：651-658，1992)。也就是说，没有适用于设计肽疫苗的一致规律，而设计的疫苗的有效性也无法预测。由于同样原因，当高度疏水的PB1₄肽即一种载脂蛋白B拟肽与T细胞表位融合时，抗原区域埋入融合蛋白，导致其诱导抗体应答的能力降低。

基于此背景，本发明人进行了多种尝试以增强PB1₄的免疫原性，它是一种具有抗肥胖作用的载脂蛋白B-100的B细胞表位的拟肽。因此，其中辅助T细胞表位的N一末端与拟肽C-末端融合的杂交多肽显示了出色的免疫增强作用，表明其对预防和治疗肥胖是有效的。这是一个出乎意料的结果，因为杂交多肽显示出良好的抗肥胖活性无需诱导能使载脂蛋白B-100的B细胞表位的有益活性或作用失效的免疫应答或没有引起有害副作用。

发明内容

一方面，本发明提供了一种免疫原性杂交多肽，它包含了载脂蛋白B-100的B细胞表位拟肽的氨基酸序列，其中该拟肽的C-末端与辅助T细胞表位的N-末端相融合。

另一方面，本发明提供了一种预防或治疗肥胖的疫苗，它包含一种免疫原性杂交多肽，该多肽包含了载脂蛋白B-100的B细胞表位拟肽的氨基酸序列，其中该拟肽的C-末端与辅助T细胞表位的N-末端相融合。

另一方面，本发明提供了一种包含编码免疫原性杂交多肽基因的重组载体、一种包含该重组载体的转化体和一种通过培养转染了重组载体的宿主细胞来制备杂交多肽的方法。

附图简述

本发明的以上及其它目的、特征和其它优点将从以下结合附图的详细描述中更清楚地理解，其中：

图1显示了构建pB1₄T的方法；

图2显示了用限制性内切酶消化pB1₄T的结果；

图3显示了pB1₄T的DNA序列和由其预示的氨基酸序列；

图4显示了在转化大肠杆菌株M15/pB1₄T中PB1₄T表达的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果，所述的转化大肠杆菌株M15/pB1₄T使用了IPTG诱导PB1₄T表达，其中表达的重组PB1₄T用箭头标明(M：预染蛋白质大小标记；泳道1：未用IPTG诱导的大肠杆菌M15；泳道3-7：IPTG诱导的大肠杆菌M15/pB1₄T，在IPTG诱导后分别于1、2、3、4和5小时收集)；

图5显示了在转化大肠杆菌株M15/pB1₈中PB1₈表达的SDS-PAGE分析结果，所述的转化大肠杆菌株M15/pB18T使用了IPTG诱导PB1₄T表达，其中表达的重组PB1₈用箭头标明(M：预染蛋白质大小标记；泳道1：未用IPTG诱导的大肠杆菌M15；泳道3-7：IPTG诱导的大肠杆菌M15/pB1₈，在IPTG诱导后分别于1、2、3、4和5小时收集)；

图6显示了大肠杆菌裂解产物的离心上清液(泳道1)和沉淀(泳道2)的SDS-PAGE分析结果，其中表达的PB1₄T出现在沉淀中且用箭头标明。

图7显示了大肠杆菌裂解产物(泳道1：全体裂解产物；泳道2：离心上清液；泳道3：离心沉淀)的SDS-PAGE分析结果，其中表达的PB1₈出现在沉淀中且用箭头标明；

图8显示了用兔抗PB1₄抗体(A)和抗preS2单克隆抗体(B)纯化的PB1₄T的蛋白质印迹结果(泳道1：大肠杆菌M15；泳道2：未用IPTG诱导的大肠杆菌M15/pB1₄T；泳道3：IPTG诱导的大肠杆菌M15/pB1₄T，IPTG诱导3小时后收集)；

图9显示了根据线性咪唑梯度的Ni-NTA亲合色谱得到的PB1₄洗脱图；

图10显示了根据线性咪唑梯度的Ni-NTA亲合色谱得到的PB1₄T洗脱图；

图11显示了根据线性咪唑梯度的Ni-NTA亲合色谱得到的PB1₈洗脱图；

图12显示了构建pTB1₄的方法；

图13显示了用小鼠抗preS2单克隆抗体和缀合HRP的山羊抗小鼠IgG抗体(A)及用抗PB1₄抗血清和缀合HRP的山羊抗兔IgG抗体(B)纯化的PB1₄、PB1₄T和PTB1₄的蛋白质印迹结果；

图14显示了TB1₄/pQE30的DNA序列和由其预示的氨基酸序列；

图15是显示了标准、模拟和接种疫苗组的SD白鼠的体重增值的图表，其中标准组(■)注射PBS、模拟组(▲)注射卵清蛋白、一个接种疫苗组(◆)注射缀合卵清蛋白的PB1₄(PB1₄+OVA)、另一个接种疫苗组(●)注射PB1₄T肽，每个肽注射3次每次间隔2周，箭头标明注射疫苗的时间点；

图16是显示了分别免疫接种PB1₄、PB1₄T和PTB1₄而诱导的抗PB1抗体的滴度变化的图表；和

图17是显示了甘油三脂、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和总胆固醇的血清水平的图表。

实施本发明的最佳方式

一方面，本发明涉及一种免疫原性杂交多肽，它包含载脂蛋白B-100的B细胞表位拟肽的氨基酸序列，其中该拟肽的C-末端与辅助T细胞表位的N-末端相融合。

在增强载脂蛋白的免疫原性的策略中，本发明计划提供一种免疫原性杂交多肽，其中T细胞表位融合于载脂蛋白特别是载脂蛋白B-100(apo B-100)的B细胞表位的拟肽。当T细胞表位与载脂蛋白B-100的B细胞表位的拟肽融合时，PB1₄提高了诱导抗体应答的能力并且显示出长期疫苗效能从而具有出色的抗肥胖作用。

如本文所用的术语“表位的拟肽”涉及模拟表位最小部分的肽，即充分相似于天然表位的表位以致于其能够被特异针对天然表位的抗体所识别或其能够增强抗体与天然表位的交联。拟肽还可称为模拟位。这种拟肽是有益的，因为它被认为在体内“无我”，因此克服了免疫应答中的自身耐受性的问题。载脂蛋白B-100的B细胞表位的拟肽被特异结合于载脂蛋白B-100的抗体所识别。特异结合于载脂蛋白B-100的抗体包括特异识别和结合于载脂蛋白B-100的多克隆和单克隆抗体及其片段，例如Fc、Fab和F(ab′)2。

根据本发明的载脂蛋白B-100的B细胞表位的拟肽包括选自SEQ ID Nos.1、2和3的氨基酸序列。因此，在优选方面，本发明涉及一种免疫原性杂交多肽，它包括选自SEQ ID Nos.1、2和3的氨基酸序列，其中被特异结合于载脂蛋白B-100的抗体所识别的肽的C-末端与辅助T细胞表位的N-末端相融合。

本发明者通过对噬菌体展示肽库进行生物淘筛从中分离出可被抗载脂蛋白B-100、单克隆抗体(Mab)B9或单克隆抗体B23的单克隆抗体所识别的拟肽(SEQ ID Nos.1、2和3)。

包括选自SEQ ID Nos.1、2和3的氨基酸序列的载脂蛋白B-100的表位的拟肽，可以是包括具有任一SEQ ID Nos.氨基酸序列的单拷贝的单体形式，或为了进一步增强拟肽的免疫原性，可以是两个或更多、优选三至八个、更优选具有任一SEQ ID Nos.氨基酸序列的三至六个拷贝连接的多聚体形式。最优选的是四聚体(SEQ ID No.4)即四个拷贝相连接。当拟肽为多聚体形式时，每个构成一个单体的氨基酸序列可以是直接共价连接或通过一个连接子连接。当氨基酸序列通过连接子连接时，连接子可由一至五个氨基酸残基组成，选自例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸。连接子可用的优选氨基酸可包括缬氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸。考虑到基因操作的方便，更优选的是，选自缬氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸等等的两个氨基酸可用于连接和用作连接子。一个优选拟肽以通过连接子来连接选自SEQID Nos.1、2和3的氨基酸序列的两个或多个拷贝来制备。

如本文所用的术语“T细胞表位”涉及的氨基酸序列能够以适当的效率结合于MHCII类分子并且刺激T细胞或以与MHC II类形成复合物的形式结合于T细胞。在这种情况下，T细胞表位被T细胞上存在的特异受体所识别，其功能是提供需要将B细胞分化为产生抗体细胞的信号和诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)破坏靶细胞。T细胞表位没有特别的限制，只要它能刺激T细胞和加强免疫应答就可以，因此多种适合此目的的蛋白质、肽等等均可以。就本发明的目的而言，T细胞表位优选辅助T细胞表位。辅助T细胞表位的实例可包括乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen)辅助T细胞表位、衣原体trachomitis主要外膜蛋白(Chlamydia trachomitis major outer membrane protein)辅助T细胞表位、恶性疟原虫环子孢子(Plasmodium falciparum circumsporozoite)辅助T细胞表位、大肠杆菌TraT辅助T细胞表位、破伤风类毒素辅助T细胞表位、白喉类毒素辅助T细胞表位、曼氏血吸虫磷酸丙糖异构酶(Schistosoma mansoni triose phosphateisomerase)辅助T细胞表位、麻疹病毒F蛋白辅助T细胞表位、来源于百日咳疫苗、卡介苗(BCG)、脊髓灰质炎疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、狂犬病疫苗的T细胞表位序列、来源于结核菌素、钥孔虫戚血蓝蛋白的纯化蛋白质及其片段或组合物。T细胞表位可包括根据特殊目的添加、缺失或取代被选氨基酸残基，还可提供其中两个或多个不同T细胞表位连接的多聚体形式。在本发明的一个实施例中使用了乙肝病毒表面抗原。乙肝病毒(HBV)的基因组长度为3.2kb，具有四个重要蛋白质的信息和含四个开放阅读框，S基因(表面抗原蛋白)、C基因(核心蛋白)、P蛋白(DNA多聚酶)和X基因。S基因分为编码乙肝表面抗原(HBsAg)的S区和preS区。preS区分为根据HBV株编码108或119个氨基酸的preS1和编码与亚型无关的55个氨基酸的preS2。HBV preS2蛋白在体内免疫应答中活化辅助T细胞，从而激发抗HBV的抗体的形成。

如本文所用的术语“杂交多肽”通常是指不同来源的异源肽相连接的肽，在本发明中涉及B细胞表位和T细胞表位连接的肽。这种杂交多肽可从化学合成或确定各个部分后通过基因重组表达和纯化获得。优选在细胞表达系统中表达编码B细胞表位的基因序列与另一个编码T细胞表位的基因序列连接而成的混合基因。在这种杂交多肽中，B细胞表位和T细胞表位可直接相连或通过连接体例如连接子的方式连接。当使用连接子时，它不应负面影响杂交多肽对免疫应答的诱导。

如本文所用的术语“多肽”是包括其中含有两个或多个氨基酸的残基以共价肽键缀合的全长氨基酸链的术语，包括二肽、三肽、寡肽和多肽。特别的是在本发明中，多肽表示其中两个或多个肽相互连接的杂交多肽、其中所述的肽中的数个至数十个氨基酸共价键合。本发明的杂交多肽是两个或多个肽例如一个B细胞表位和一个T细胞表位连接的多肽。包含多肽的每个肽序列包括了相应前述表位的序列，还可进一步包括邻近表位的序列。这些肽可由L-或D-氨基酸组成或是两种不同构型氨基酸的多种组合物。本发明的杂交多肽可完全由包括前述B细胞表位、T细胞表位和它们邻近特定序列的抗原区域组成，此外还可包括一个附加序列。但是优选的这个附加序列不能降低整体免疫原性。此附加序列通过一个连接子序列举例说明。

如本文所用的术语“免疫原性”涉及诱导细胞和体液免疫应答来保护身体对抗杂质的能力。诱导这种免疫应答的物质称为免疫源。本发明应用兼有B细胞表位和T细胞表位两种免疫原性物质的多肽。

本发明者将四聚载脂蛋白B-100拟肽PB1₄的C-末端与具有T细胞表位的HBVpreS2的一部分(T片段)连接，从而得到表达PB1₄T的基因片段(图1)，所用的拟肽是一种具有B细胞表位但是T细胞表位不足的抗肥胖功能肽。PB1₄片段使用BamH I和Xho I来获得，T片段使用Sal I和HindIII来获得。将PB1₄T基因片段插入pQE30载体然后转染至大肠杆菌JM109中。通过限制性内切酶图谱(图2)和DNA序列分析(图3)来分析出现的菌落，发现其是B细胞表位与T细胞表位连接的正确克隆。这个克隆被命名为“pB1₄T”。用于表达PB1₄T和PB1₈的pQE30载体从其固有的起始密码子开始蛋白质表达，该蛋白质带有六个组氨酸残基以便蛋白质纯化，其后跟随一个肠激酶切割位点。由此表达的PB1₄T为16.2kDa，PB1₈为16.5kDa。蛋白质表达通过在给定时间点收集的样品的SDS-PAGE分析(图4和5)来研究。

因此，在本发明的应用中提供了SEQ ID No.9的免疫原性杂交多肽，此多肽中四聚载脂蛋白B-100拟肽与HBV表面抗原preS2相连接。

本发明的免疫原性杂交多肽可通过化学合成或基因重组制备。优选本发明的杂交多肽可通过转染重组载体至宿主细胞和分离纯化此宿主细胞表达的多肽来制备。

因此，另一方面，本发明提供了一种包含编码免疫原性杂交多肽的基因的重组载体和转染此重组载体的宿主细胞。

另一方面，本发明提供了一种通过培养转染了重组载体的宿主细胞来制备免疫原性杂交多肽的方法。

本发明中通过基因重组来制备免疫原性杂交多肽的方法包含以下四个步骤。

第一步是将编码杂交多肽的基因插入至载体中来构建重组载体。引入外源DNA的载体可以是质粒、病毒、黏粒等等。重组载体包括克隆载体和表达载体。克隆载体含有一个复制起点，例如质粒、pharge或粘粒的复制起点，它是附着其上的外源DNA片段的复制开始的“复制子”。制备表达载体以用于蛋白质合成。重组载体用作外源DNA片段插入的载体，通常是一个双链DNA片段。如本文所用的术语“外源DNA”涉及来源于异种的DNA或来源于同种的天然DNA的大量修饰的形式。此外，外源DNA包括在正常状态下于细胞中不表达的未修饰DNA序列。在这种情况下，外源基因是被转录的特异靶核酸，它编码多肽。重组载体含有可操作性的连接于转录和翻译表达调节序列的靶基因，它在选定的宿主细胞内发挥其功能以增加转染基因在宿主细胞中的表达水平。重组载体是含有基本调控元件的遗传构建体，基因插入物可与此调控元件连接以在个体细胞中表达。这种遗传构建体使用标准DNA重组技术进行制备。重组载体的种类没有特殊限制只要载体在包括原核生物和真核生物的多种宿主细胞中表达靶基因并且有制造靶蛋白质的功能就可以。但是优选的载体能够以相似于天然形式的方式来大量制造外源蛋白并且具有强启动子来完成靶蛋白质的强力表达。优选的重组载体含有至少一个启动子、一个起始密码子、一个编码靶蛋白的基因、一个终止密码子和一个终止子。重组载体可更适当地含有编码信号肽、增强子序列、靶基因的5′-和3′-未翻译区、选定标记区、复制单位等等的DNA。

第二步是转染重组载体至宿主细胞并且培养宿主细胞。通过Sambrook，J.等人，分子克隆，实验手册(第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory，1.74，1989描述的方法将重组载体引入宿主细胞以产生转化细胞，此方法包括磷酸钙或氯化钙/氯化铷方法、电穿孔法、电注射法、化学处理例如聚乙二醇(PEG)处理和基因枪。能够通过在营养培养基中培养表达重组载体的转化细胞来大规模制备和分离有用的蛋白质。普通培养基和培养条件可根据宿主细胞来适当的选择。应当保持包括温度、培养基的pH和培养时间在内的培养条件以适于细胞生长和目标蛋白质的大量制备。能够被根据本发明的重组载体转染的宿主细胞既包括原核生物也包括真核生物。通常使用对DNA具有高引入效率和对引入的DNA具有高表达水平的宿主细胞。宿主细胞的实例包括已知的原核和真核细胞例如大肠埃希杆菌属(Escherichia sp.)、假单胞杆菌属(Pseudomonas sp.)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)、放线菌属(Steptomyces sp.)、真菌和酵母、昆虫细胞例如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf9)和动物细胞例如CHO、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40和BMT 10。优选使用大肠杆菌。

第三步是诱导杂交多肽表达和累积。在本发明中，诱导剂IPTG用于诱导肽表达，且调节诱导时间以获得最大量的蛋白质收率。

最后一步是分离和纯化杂交多肽。重组制备的肽通常能够从培养基或细胞裂解产物中恢复得到。当肽是膜结合形式时，它可通过使用适合的表面活性剂溶液(例如Triton-X100)或通过酶裂解从膜上释放。表达杂交多肽所用的细胞可被多种物理或化学方法破坏，例如反复冷冻和融解、超声处理、机械破碎或细胞破碎试剂，杂交多肽还可通过常用生物化学分离技术(Sambrook等人，分子克隆：实验手册，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989；Deuscher，M.，蛋白质纯化方法酶学指导，Vol.182.AcademicPress.Inc.，San Diego，CA，1990)分离和纯化。生物化学分离技术的非限制实例包括电泳、离心、凝胶过滤、沉淀、透析、色谱法(离子交换色谱法、亲合色谱法、免疫吸附亲合色谱法、反相高效液相色谱法、凝胶渗透高效液相色谱法)、等电聚焦法及它们的变化和联用。

详细地，在本发明中，PB1₄T基因片段与pQE30载体连接并且转染至大肠杆菌。pQE30载体对大肠杆菌中大量制备蛋白非常有用因为使用IPTG作为诱导剂时它含有包括噬菌体T5启动子和乳糖操纵因子系统的启动子元件。PB1₄T的表达使用两个识别PB1₄T的抗体、即兔抗PB14多克隆抗体和小鼠抗preS2单克隆抗体作为一级抗体通过蛋白质印迹法来验证，然后纯化表达的蛋白质。PB1₄和PB1₄T用8M尿素变性因为它们是不可溶的，然后使用用于组氨酸标记蛋白质的Ni-NTA树脂通过亲和色谱法纯化。

用表达和纯化的多肽免疫大鼠，然后评价大鼠体重的增加、血清抗体滴度和血脂谱的变化。结果是，与标准组或用未融合拟肽接种的组相比，用杂交多肽接种的组显示了对体重增加的抑制、高滴度和抗拟肽的抗体的延长停留以及甘油三脂和低密度脂蛋白-胆固醇的血清水平的降低。

没有一致的规律适用于肽疫苗设计，设计的疫苗的效力也无法预测。由于同样的原因，当高度疏水性的PB1₄T肽与异源肽T细胞表位融合时，抗原区埋入融合蛋白，导致其诱导抗体应答能力的降低。在难以推测融合结果的情况下，本发明者设计了将载脂蛋白B-100表位的拟肽与T细胞表位相连接的杂交多肽，并且证明了此杂交多肽的免疫原性增强从而导致抗肥胖作用增强。

人工合成的杂交多肽和包含同样组分的疫苗的免疫原性在B细胞表位和辅助T细胞表位同时存在时才能产生。此外，疫苗的功效可根据B细胞表位和辅助T细胞表位的方向来决定。也就是说，杂交多肽诱导抗体应答的能力可根据辅助T细胞表位定位于B细胞表位的N-末端或C-末端而变化(Partidos，C，Stanley，C，和Steward，M，表位的定向对表示麻疹病毒蛋白质序列的嵌合合成肽的免疫原性的作用，Molecular Immunology，29(5)，651-658，1992)。

为了研究B细胞表位和辅助T细胞表位的定向在诱导免疫应答中的作用，与将PB1₄的C-末端连接至T片段来制备B1₄T基因片段不同，本发明者通过将PB1₄的N-末端连接至T片段(图12)来制备了TB1₄基因片段。详细地说，pTB1₄载体是根据实施例9描述的方法来构建，转染至大肠杆菌M15，并在其中表达。表达的杂交多肽PTB1₄具有His标签，通过使用Ni-NTA His结合树脂的亲合色谱来纯化。

为了比较PTB1₄和PB1₄T诱导抗体应答和免疫原性的能力，用每个多肽免疫SD大鼠然后收集血样。与PB1₄相比，PTB1₄增强了诱导抗体应答的能力，并且抗PTB1₄的血清抗体的停留时间有所延长。然而，发现用PTB1₄免疫接种的这些改良比用PB1₄T(图16)显著低约50-60％。同样的结果出现在对大鼠体重增加的抑制(表2)上。这些结果表明通过将PB1₄的C-末端连接至T片段来制备的PB1₄T多肽具有更强的免疫原性和抗肥胖作用。

因此，另一方面，本发明涉及预防或治疗肥胖的疫苗，该疫苗包含免疫原性杂交多肽，此多肽包括载脂蛋白B-100表位的拟肽的氨基酸序列，其中该拟肽的C-末端与辅助T细胞表位的N-末端融合。

通过比较免疫源的应答的强度和观察个体的比率来确定免疫源是否能够作为具有良好功效的疫苗。在本发明中，就提供预防或治疗肥胖的疫苗的目的而言，通过研究(a)体重增加、(b)血清抗体滴度和(c)血脂谱的变化来评价诱导抗原对免疫应答的作用，从而决定抗原的高效形式。

详细地说，100μg每种纯化PB1₄和PB1₄T肽腹膜注射7周大的SD白鼠3次每次间隔2周，观察大鼠体重的变化并且绘图(图15)。从初次注射到追加注射(第2次注射)，每组大鼠显示了相似的体重变化，其范围从292g到297g。然而从第2次注射后的一周起，在接种疫苗组及标准和模拟组间可观察到大鼠体重的差别。这表明初次注射诱导的弱免疫应答在追加第2次注射后被增强了，并且这增强的免疫应答导致了对大鼠体重增加的抑制。与标准组和模拟组相比，接种疫苗组显示了体重增量的减少。此外，PB1₄T肽比PB1₄肽对体重增量具有更强的抑制作用(表2)。体重增量上的差别甚至在第3次注射后仍存在。此外，同源的嵌合抗原PB1₄T被发现比缀合载体蛋白质，即卵清蛋白的PB1₄肽能更加有效地诱导免疫应答。在接种疫苗的SD白鼠中，血清抗体滴度在年龄为10、12、14和16周时用ELISA方法测定(图16)。PB1₄T免疫组显示了相对PB1₄免疫组增加的抗体滴度。在14周龄时，PB1₄T免疫组显示了比PB1₄免疫组高1.5倍的吸光度(O.D.：光密度)值。在16周龄时，PB1₄免疫组显示了抗体滴度的降低，而PB1₄T免疫组维持了抗体滴度的增加。就血脂而言，接种疫苗组显示了比标准和模拟组低的甘油三脂和胆固醇水平。特别是低密度脂蛋白-胆固醇水平降低至标准水平的60％(图17)。

这些结果表明PB1₄与T细胞表位融合的形式比具有B细胞表位的PB1₄本身具有更高的免疫原性，因此能够用于有效疫苗组合物中。

此外，本发明者设计了一种使用宠物犬受试的临床试验来检测PB1₄T的功效。将PB1₄T与氧化铝混合然后注射入10只宠物犬2次每次间隔2周，观察体重的变化。结果发现即使允许犬自由食用零食和高脂肪饮食，宠物犬体重也没有增加(表4)。此外，当第2次注射后从免疫的宠物犬收集血清样品和用ELISA方法检测血清抗体滴度时，甚至在血清样品稀释5000-50000倍时仍出现高吸光度，这表明PB1₄T肽具有出色的诱导抗体应答作用。

本发明的抗肥胖疫苗包括抗原、药学可接受的载体、适当的佐剂和其它普通物质，并且以免疫有效量给药。如本文所用的术语“免疫有效量”涉及足够产生对肥胖的治疗和预防作用且不会引起副作用或剧烈或过度免疫应答的剂量。精确剂量可根据施用的特异抗原而改变，并且可由本领域技术人员使用已知测定免疫应答发生的方法来确定。此外，剂量可依照给药形式和路线、受者年龄、健康状态和体重、症状的特性和程度、当前接受治疗的类型和治疗频率来改变。载体是本领域公知的并且包括稳定剂、稀释剂和缓冲液。适合的稳定剂包括碳水化合物例如山梨醇、乳糖、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖和葡萄糖，和蛋白质例如白蛋白或酪蛋白。适合的稀释剂包括生理盐水、Hanks′平衡盐溶液和Ringer′s溶液。适合的缓冲液包括碱金属磷酸盐、碱金属碳酸盐和碱土金属碳酸盐。疫苗还可包含一种或多种佐剂来提高或加强免疫应答。适合的佐剂包括肽；氢氧化铝；磷酸铝；氧化铝；和包括石蜡油例如Marcol 52、或植物油和一种或多种乳化剂、或表面活性物质例如溶血卵磷脂、多聚阳离子和多聚阴离子的组合物。本发明的疫苗组合物可作为单体治疗剂给药或与另一个治疗剂联用，或与常规治疗剂连续地或同时联合给药。疫苗组合物可通过已知给药途径给药。给药方法包括，但是不限于，口服、真皮、肌肉、腹膜、静脉、皮下和鼻内途径。此外，药学组合物还可使用能够运送活性物质至靶细胞的特定装置给药。

通过以下实施例可以更好的理解本发明，所列举的实施例用于说明，不能解释为对本发明的限制。

实施例

实验材料

DNA小量制备试剂盒和用于从凝胶提取DNA的试剂盒购买于Nucleogen，胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂等等购于Difco(Detroti，MI)，限制性内切酶购于TaKara，T4(噬菌体)DNA连接酶购于NEB。使用pBluescript II SK(Stratagene)、PCR 2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)和pQE30(Qiagen)载体和大肠杆菌JM109和M15株(Qiagen)。

用于诱导制备蛋白质的IPTG购买于Sigma，用于纯化表达的蛋白质的Ni-NTA树脂购买于Novagen，用于SDS-PAGE、蛋白质印迹、蛋白质印迹化学发光(ECL)等等的预染标记物购买于NEB。用于变性蛋白质的尿素购买于Duchefa，用于蛋白质纯化的咪唑购买于USB。用于透析的截留分子量为3500的透析膜购买于Spectrum，用于防止蛋白质聚集的试剂CHAPS购买于Amresco。用于ELISA法的抗体是从Sigma买来的缀合HRP抗大鼠IgG。用于蛋白质印迹分析和ECL的基质溶液BCIP/NBT购买于Sigma。ECL加蛋白质免疫印迹分析检测试剂购买于Amersham。所用佐剂为Freund′s佐剂(Sigma)和氢氧化铝(Reheis)。蛋白质浓度通过Pierce′s BCA蛋白质测定法和Biorad′sBradford测定法来确定。

血清中的甘油三脂、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇分别应用triglyzyme-V、cholestezyme-V、HDL-555(Shinyang Diagnostics，韩国)和EZ低密度脂蛋白胆固醇(Sigma)来测量。使用低密度脂蛋白校准器(Randox)。

年龄5周的雄性Sprague Dawley(SD)白鼠购买于Daehan Biolink公司，韩国，用韩国Samtako公司的饲料喂养，该饲料包含超过18％的天然蛋白质、5.3％的粗脂肪、4.5％的粗纤维和8.0％的灰。

下列缓冲液用于纯化重组体PB1₄T和PB1₄肽：超声破碎缓冲液(5mM咪唑，0.5MNaCl，20mM Tris-Cl，pH 7.9)、结合缓冲液(5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-Cl，8M尿素，pH 7.9)、洗涤缓冲液(50mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-Cl，8M尿素，pH 7.9)和洗脱缓冲液(400mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-Cl，8M尿素，pH 7.9)。

实施例1：用于生产抗肥胖PB1₄T肽的人造基因的制备

pBluescript II SK载体用BamHI和XhoI消化来获得B1₄片段，PCR2.1载体用SalI和HindIII消化来获得T片段。由于XhoI和SalI具有匹配的粘性末端，从两个载体中获得的B1₄和T片段用T4 DNA连接酶于16℃处理12小时来连接。由于连接位点不能用SalI或XhoI消化，所以再次使用SalI/HindIII消化来获得B1₄T片段。为了蛋白质表达，选择pQE30质粒作为载体系统，它设计表达的目标蛋白质以与六个组氨酸残基融合的形式存在以便于蛋白质纯化。B1₄T基因片段被插入pQE30载体的SalI/HindIII位点。获得的表达载体命名为“pB1₄T”(图1)。表达载体转染入大肠杆菌JM109。质粒DNA从转染细胞中分离且用SalI和HindIII处理以得到限制性内切酶图谱。结果为一个450bp片段成功插入pQE30载体中(图2)。

重组载体pB1₄T以转染入大肠杆菌(大肠杆菌M15/pB1₄T)的形式于2004年3月4日保存于韩国微生物培养中心(KCCM，361-221，Yurim B/D，Honje 1-dong，Sudaemum-gu，首尔，韩国)，指定的保藏编号为KCCM-10562。

实施例2：用于生产抗肥胖PB1₈肽的人造基因的制备

用SalI和XhoI消化pBluescript II SK载体获得B1₄片段。pBX₄载体(具有B1₄片段插入的pQE30载体，韩国专利公开发布号2002-0018971)通过SalI消化线性化，然后使用T4 DNA连接酶于16℃过夜来与B1₄片段连接。

实施例3：基因的核苷酸序列测定

为了证实B1₄T基因片段是否正确插入pB1₄T重组载体，将重组载体制成300-500ng/μg的浓度来进行DNA序列分析，此分析由韩国Core Bio System公司进行。

结果为选定的重组载体是正确的克隆(图3)。

实施例4：重组肽PB1₄T的表达

PB1₄T和PB1₈肽表达自pQE30载体，该载体从其固有的起始密码子开始蛋白质表达，该蛋白质带有便于蛋白质纯化的六个组氨酸残基，其后跟随一个肠激酶切割位点。大肠杆菌M15用作肽表达的宿主细胞。大肠杆菌M15株用重组载体转染然后涂在含有氨苄西林(Amp)和卡那霉素(Kan)的LB平板上。出现的菌落用10ml含有Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB培养基培养过夜。为了研究培养时间对蛋白质表达的影响，将1ml过夜培养的培养基接种至50ml新鲜LB培养基中。然后细胞于37℃振动培养1小时30分钟至600nm处的OD值为0.4至0.5。此时，将终浓度1mM的IPTG加入培养基中，继续培养细胞5小时，在这一过程中每小时收集1ml培养基。在加入IPTG前，收集1ml培养基作为未诱导对照。收集的样品以14000rpm转速离心1分钟。细胞沉淀溶解于30μl 2×SDS样品缓冲液中进行SDS-PAGE。结果见图4和5。SDS-PAGE分析显示PB1₄T为16.2kDa而PB1₈为16.5kDa。

实施例5：重组肽PB1₄T的蛋白质印迹分析

PB1₄T肽通过使用SDS-PAGE分析大小来鉴别，但是为了进一步证实是否表达的蛋白质是PB1₄T，使用两个能够识别PB1₄T的抗体来进行蛋白质印迹分析。作为对PB1₄T的蛋白质印迹分析的对照，转染不含有B1₄T片段的pQE30载体至大肠杆菌M15。IPTG诱导前和IPTG诱导后三个小时收集样品。兔抗PB1₄多克隆抗体和小鼠抗preS2单克隆抗体在PBS中以1∶10000稀释并用作一级抗体。作为能够识别一级抗体的二级抗体，过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG在PBS中以1∶10000稀释后使用。得到的印迹用ECL加蛋白质印迹分析试剂盒显影。印迹放置于暗箱中，一张Fuji医用X光片放于印迹上。印迹暴露于胶片上10秒并且显影。由于兔抗PB1₄多克隆抗体识别PB1₄T的PB1₄片段而小鼠抗preS2单克隆抗体识别PB1₄T的T片段，当PB1₄T蛋白质正确表达时，分别与每个一级抗体培养的两个印迹上应该能观察到条带。如图8所示，一级抗体分别识别PB1₄T中的PB1₄和T，说明PB1₄T正确表达。

实施例6：PB1₄T和PB1₈重组肽在大肠杆菌中表达形式的评价

为了确定PB1₄T和PB1₈表达为可溶性蛋白质还是不可溶性蛋白质，通过离心收获IPTG诱导3小时后的细胞。收获的细胞重悬于超声处理缓冲液中然后超声处理。得到的沉淀和上清液用SDS-PAGE分析。详细地，用IPTG处理以诱导蛋白质表达的细胞以9000rpm的转速在4℃下离心30分钟。沉淀的细胞在-20℃冷冻片刻，在冰上解冻，然后重悬于超声破碎缓冲液中(每1g沉淀5ml)。细胞被超声破碎15次每次30秒(每次间歇1分钟)。细胞裂解产物然后以9000rpm转速于4℃离心30分钟。收集上清液，由此获得含有未加工的可溶性蛋白质的粗提取物A。此外，收集沉淀，由此得到含有未加工的不可溶性蛋白质的粗提取物B。粗提取物A和B分别与2×SDS样品缓冲液混合，95℃煮沸5分钟，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳。SDS-PAGE分析显示靶蛋白质主要存在于沉淀中而不是上清液中，说明PB1₄T和PB1₈蛋白质以不可溶形式表达(图6和7)。

实施例7：PB1₄、PB1₄T和PB1₈重组肽的纯化

肽纯化使用针对组氨酸标记蛋白质的Ni-NTA树脂来进行。此纯化是利用结合于树脂的Ni⁺与融合蛋白末端组氨酸六聚体之间的相互作用的亲合色谱方法。在转染的大肠杆菌细胞于10ml LB培养基中预培养过夜后，将10ml培养基接种至500ml LB培养基中并且在37℃培养至600nm处的OD值达到0.4至0.5。然后，将1mM IPTG加入培养基中，细胞继续培养4个小时。细胞在9000rpm转速下离心30分钟，细胞沉淀置于-20℃。冷冻细胞在冰上解冻后，将其重悬于超声破碎缓冲液(5ml/g湿细胞)中超声破碎。细胞裂解产物然后以9000rpm的转速在4℃离心30分钟。沉淀重悬于与上清液同等体积的结合缓冲液中，超声破碎3次以除去细胞碎片，然后以9000rpm的转速在4℃离心30分钟。如此获得的上清液用于使用Ni-NTA树脂的亲合色谱。

使用直径1cm高度15cm、填充2ml树脂的柱子，所有步骤以2ml/min的流速进行。树脂填充进柱子后，用3至5倍柱体积的蒸馏水冲洗树脂，用5倍柱体积的1×电荷缓冲液(50mM NiSO₄)以Ni₂⁺给树脂带电荷，并且用结合缓冲液平衡，从而得到Ni螯合亲合色谱柱。给柱子上样两次后，用结合缓冲液冲洗柱子直至280nm的吸光度达到1.0的基线然后用洗涤缓冲液冲洗10分钟。待柱子完全平衡后，用含有比洗涤缓冲液更高浓度咪唑的洗脱缓冲液洗脱柱子从而形成一个咪唑梯度，再次单独洗脱柱子10分钟以完全洗脱结合至树脂的蛋白质。收集总计22ml的洗脱组分。由于洗脱的肽溶解于8M尿素，将其在PBS中透析过夜以除去尿素。

如上文描述，由于每种蛋白质是高度不可溶的，所以用含有8M尿素的缓冲液变性后再进行纯化，结合于树脂的蛋白质用50mM至400mM的咪唑梯度洗脱。结果显示于图9、10和11。大多数蛋白质在大约300mM咪唑时被洗脱。每1L培养基的蛋白质收率为3-3.5mg PB1₈和4-4.5mg PB1₄T。

实施例8：PB1₄、PB1₄T和PB1₈重组肽的定量

当洗脱的PB1₄T、PB1₄和PB1₈肽用PBS透析时，由于除去了尿素，蛋白质聚集从而形成了沉淀。在这种情况下，无法测量到精确的蛋白质浓度。纯化蛋白质的聚集用50mM CHAPS溶解。蛋白质浓度通过BCA蛋白分析方法和Bradford分析方法来测定。2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)连续稀释为1000、500、250、125和62.5ug/ml，BSA连续稀释液用作标准。BCA分析方法根据Pierce提供的实验设计来进行。BCA蛋白质颜色反应在37℃下进行30分钟，然后测量562nm处的吸光度。此外，样品可与Bradford试剂在室温下反应10分钟，然后测量595nm处的吸光度。使用BSA连续稀释液的吸光度或Bradford蛋白质颜色反应来获得标准曲线，样品的蛋白质浓度用标准曲线来确定。

实施例9：用于PTB14表达的pTB14载体的构建

转染入大肠杆菌M15的pQE30载体用KpnI(Takara)和SalI(Takara)双消化来切除T段(preS2)。pBluescript质粒也用同样的限制性内切酶处理。切除的T段和线性化的pBluescript在凝胶上分离、纯化和用T4 DNA连接酶相互连接。4μl pBluescript、4μl T段、1μl T4 DNA连接酶(MBI Fermentas，1Weiss u/ml)和1μl 10×缓冲液(MBIFermentas)在1.5ml小管中混合，连接混合物在16℃培养过夜。重组载体然后与JM109感受态细胞混合，在42℃热振荡90秒，在LB培养基中于37℃培养1小时。然后，转染细胞涂于LB/Amp平板上并且于37℃培养。在出现的菌落中随机选择数个菌落并进行培养。然后从培养的细胞中分离质粒DNA，用限制性内切酶消化，并用琼脂糖凝胶电泳来分析DNA片段的大小。去除T段上的一个XhoI位点来获得TB4段。也就是说，由于XhoI位点靠近T段的3′末端(离T段的5′末端大约150bp)，T段(乙肝病毒preS2基因，183bp)不能用于克隆，所以使T段在固有XhoI位点点突变从而得到新的序列。由于T段的固有XhoI位点，因此从pBluescript-preS2上切割掉一个短DNA片段(30bp)。将合成的寡聚物插入这个位置。为了避免自身连接，载体用碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim，GmbH，德国)于37℃处理30分钟，在95℃脱去磷酸5分钟，然后从凝胶上洗脱。寡聚物在其5′末端用多核苷酸激酶于37℃处理30分钟和65℃20分钟磷酸化。然后，载体和寡聚物在95℃静置5分钟，并且在一个加热块上缓慢冷却来退火。然后寡聚物和pBluescript-T用连接酶于16℃处理过夜。重组pBluescript-T转染入JM109细胞然后涂于LB/Amp平板上。从出现的菌落上分离质粒DNA后并进行分析，获得带有预期质粒的克隆。该寡聚物包括与preS2对应的28个核苷酸，其第15个核苷酸G在正链的5′末端被A取代以除去XhoI位点，从而得到取代精氨酸的赖氨酸。每一个被设计为28聚的正链和反链被退火并且被插入XhoI处理的pBluescript-preS2。用SalI和XhoI双消化pBluescript-T和用SalI消化pQE30-B₄后从凝胶上纯化它们。获得的T被插入其5′末端断裂的pQE30-B₄，从而得到pQE30-pTB₄。重组TB₄用SalI和HindIII的限制性内切酶图谱来确证。如此获得的载体命名为pTB1₄(图13)。

实施例10：PTB1₄的表达和纯化

表达载体pTB1₄引入大肠杆菌M15，转染细胞在含有Amp和Kan的2L LB培养基中培养。培养的细胞以7000rpm的转速离心10分钟，收获9g湿细胞。因为重组表达的杂交多肽PTB₄有His标签，它可使用Ni-NTA His结合的树脂来进行亲合色谱。使用树脂体积为4ml直径为1.8cm高为8cm的柱子。Econo系统的吸光度量程是0.5，记录仪的纸速是2cm/小时，上样速度为2ml/min。首先，湿细胞悬于超声处理缓冲液，超声处理然后以10000rpm转速在4℃离心30分钟。沉淀溶解于结合缓冲液然后用于亲合色谱。结合溶液流过柱子以沉降树脂。当用检测器确定了基线并且标明了预测值时，超声处理了的样品上样至柱子。当样品进入柱子并且显示预测值时，洗涤溶液流过柱子。当显示预测值时，洗脱溶液流过柱子，从而分离PTB1₄。表达和纯化的杂交多肽用SDS-PAGE和蛋白质印迹来分析。在SDS-PAGE凝胶上分离的PTB1₄通过半干转移转移至薄膜上。印迹在封闭缓冲液(0.5％酪蛋白-磷酸盐缓冲盐溶液-吐温，0.02％NaN₃)中于37℃培养2小时，用Tris-缓冲盐溶液-吐温(TBS-T，pH 7.6)洗涤2次每次2分钟。然后，印迹在一级抗体中于37℃培养1小时并且用TBS-T洗涤4次每次5分钟。印迹在二级抗体中培养1小时并用同样方法洗涤。为了鉴定T段，使用抗preS2单克隆抗体(1∶10000)和缀合HRP山羊抗小鼠IgG抗体(1∶10000)。A B段用兔抗PB1₄抗血清(1∶10000)和缀合HRP山羊抗兔IgG抗体(1∶10000)检测。干燥后，印迹用ECL试剂处理5分钟来检测条带。结果是，在用兔抗PB1₄抗血清和缀合HRP山羊抗兔IgG抗体来检测的B段中，PB1₄T和PTB1₄样品中出现大约16kDa的条带。在用抗preS2单克隆抗体和缀合HRP山羊抗小鼠IgG抗体检测的T段中，PB1₄样品中出现一个大约8kDa的条带，而PB1₄T和PTB1₄样品中出现一个大约16kDa的条带。这些结果表明每种杂交多肽均正确的表达和纯化(图13)。

实施例11：PB1₄和卵清蛋白的缀合

PB1₄与载体蛋白质，即卵清蛋白缀合。载体蛋白质和PB1₄以约1∶10的摩尔比混合，并且在反应瓶中4℃搅拌反应约1小时。补加2％戊二醛至反应混合物中后，继续反应3小时。然后使用截留分子量为3000的透析膜在PBS缓冲液中过夜透析反应混合物以除去残留的戊二醛。

实施例12：接种疫苗(免疫接种)

7周龄的SD白鼠分成6组接种疫苗(表1)。如表1描述，按照实施例7和10纯化和定量的每种肽100μg与每种佐剂混合以达到终体积100μl，腹膜注射至大鼠。注射3次每次间隔2周，也就是说，在年龄为7、9和11周时注射。Freund′s佐剂和氢氧化铝用作佐剂。Freund′s佐剂使用剂量和肽相同。5.8mg/ml氢氧化铝调节至终浓度0.2mg/ml，与每种肽混合，室温搅拌培养。第1次注射后5天和第2次注射后5天、2周和4周收集血样。

表1

用肽接种疫苗

  标准  模拟  实验组  A  B  C  D  E  抗原  PBS  OVA  PB1₄^(+OVA)  PB1₄T  PB1₄  (-OVA)  PB1₈  PTB1₄  佐剂  氢氧化铝  Freund’s  佐  剂或氢氧化铝  Freund’s  佐剂或氢氧  化铝  氢氧化铝  氢氧化  铝  Freund’s  佐剂或氢  氧化铝

SD大鼠接种疫苗后体重的变化作图(图15)。从第1次注射到追加注射(第2次注射)，每组大鼠显示了相似的体重变化范围从292g至297g。然而，从第2次注射后1周起，大鼠体重变化的区别可在接种疫苗组和标准及模拟组间观察到。在18周龄时，与模拟组相比PB1₄接种组显示了16g的体重差别，而PB1₄T接种组显示了27g的体重差别(表2)。这表明由第1次注射诱导的弱免疫应答在第2次注射后增强了，且增强的免疫应答导致了对大鼠体重增加的抑制。这些体重增量的差别在第3次注射后仍保持。

表2

接种疫苗后SD大鼠体重的变化

  年龄(周)  标准  模拟  PB1₄^+OVA  PB1₄T  PTB1₄  6  130±0  130±0  130±0  130±0  130±0  7_(V1)  200±0  193±6  202±4  202±4  201±6  8  253±6  257±6  254±9  254±11  252±5  9_(V2)  292±8  299±6  297±13  303±6  300±8  10  325±8  328±4  323±12  332±7  332±4  11_(V3)  354±6  362±3  357±14  362±10  359±8  12  372±15  376±8  365±11  362±13  363±13  13  395±12  396±12  383±10  377±13  379±15  14  407±14  407±8  395±8  391±12  396±10  15  413±16  414±9  403±11  397±10  401±10  16  422±18  424±10  414±13  406±10  412±10  17  436±22  435±11  425±14  415±9  420±9  18  456±24  452±11  436±12  425±9  433±11

在表2中，所有数据用平均值+标准差来表示，其中SD(标准差)由5只SD白鼠计算，单位是克。

实施例13：抗体滴度的测定

抗体滴度使用血清样品通过间接ELISA法测定。100μl(100ng)PB1₄放入微量滴定板的各孔。平板于4℃培养过夜，用封闭溶液(PBS，0.5％酪蛋白，0.02％NaN₃)于37℃培养1小时。用PBST洗涤每孔3次。从接种疫苗组SD大鼠收集的血清样品用PBS稀释1∶500至1∶8000。每孔加入100μl每个稀释的血清样品并在37℃培养1小时。用PBST洗涤每孔3次并且用1∶1000稀释的山羊抗大鼠IgG作为二级抗体进行培养。平板用邻苯二胺(OPD)进行成色显影，测量450nm处吸光度。

图16显示了接种疫苗组的SD大鼠在年龄10、12、14和16周的抗体滴度。当每个血清样品以1∶2000稀释时通过基于吸光度值0.6的ELISA法测定滴度。当血清样品被稀释1∶500至1∶8000时，用PB1₄、PB1₄T和PTB1₄注射的组直至14周龄时都显示了增加的抗体滴度。PB1₄T免疫接种组显示了比PB1₄免疫接种组高1.5倍的O.D.值，而PTB1₄免疫接种组相较于PB1₄组显示了轻微的增加。在16周龄时，PB1₄组显示了抗体滴度的降低，PB1₄T和PTB1₄组维持了抗体滴度的增加。然而，PTB1₄在增加抗体滴度上相比于PB1₄T具有大约50-60％的显著弱作用。

实施例14：血脂谱的评价

甘油三脂和胆固醇水平如下测定。4μl血清样品与200μl显影剂混合并于37℃培养5分钟，然后测量505nm和500nm处吸光度。为了测定高密度脂蛋白水平，血清样品和沉淀剂以1∶1比率混合，室温静置10分钟，以超过3000rpm的转速离心10分钟。4μl离心上清液与200μl显影剂混合并于37℃培养5分钟，然后测量555nm吸光度。低密度脂蛋白-胆固醇水平用EZ低密度脂蛋白胆固醇试剂盒(Sigma)和低密度脂蛋白校准器(Randox)测定。根据厂商提供的实验设计，4μl血清样品与1150μl试剂盒内含有的试剂混合，在37℃培养5分钟，补加250μl试剂，再次在37℃培养5分钟。然后测量600nm吸光度。每种脂质的血清水平用测定的吸光度来确定而标准曲线通过标准溶液获得。

第3次注射SD大鼠5周后收集的血清样品的脂谱的实验结果在下面表3中给出。

表3

血脂谱

  甘油三酯  高密度脂蛋白-胆固醇  总胆固醇  低密度脂蛋白-胆固醇  标准  102.3±5.6  51.5±2.7  110.2±6.5  47.7±9.5  模拟  98.0±5.9  54.6±7.8  104.1±3.9  42.9±9.1  PB1₄^+OVA  92.5±4.5  41.7±4.3  94.6±7.1  34.8±4.0  PB1₄T  90.3±6.2  43.0±2.5  97.6±2.3  33.0±4.3

在表3中，所有数据用平均值+标准差来表示，其中SD(标准差)由五只SD白鼠计算，单位是mg/dl。

标准和模拟组显示甘油三脂和胆固醇的水平大约高于接种疫苗组10mg/ml(10mg/100ml)。当接种疫苗组之间互相比较时，PB1₄接种疫苗组中甘油三脂和低密度脂蛋白-胆固醇的水平较高但是差别可忽视(图17)。

实施例15：宠物犬受试的临床试验

PB1₄T与用作佐剂的氧化铝混合。0.5ml混合物(2mg/ml)肌内或皮下注射入10只宠物犬(在韩国安山的动物医院中进行了肥胖治疗)2次每次间隔2周。在1.5至3个月时间内观察犬的体重的变化。结果是抗体缓慢减少(半衰期：3个月)而宠物犬中没有发现体重增加即使允许它们自由食用零食和高脂食物。详细地，在所有10只宠物犬中的体重增量均被抑制，即使当犬消化零食和高卡路里食物时。特别是根据犬的性别和年龄预测其体重增加的情况下注射PB1₄T的Yorkshire Terriers仍然没有增加体重。

此外，从免疫接种的宠物犬身上收集血清样品来评价诱导抗体应答的程度。第2次注射1周后，用ELISA法测定PB1₄T和PB1₄的抗体血清滴度。甚至当血清样品稀释5000-50000倍时吸光度仍高达0.5，这表明PB1₄T肽具有出色的诱导抗体应答的作用。

表4

接种疫苗后的体重变化

  种系  性别  年龄  (年)  受试期间(周)体重(kg)  饮食  0  2  4  8  12  Shih Tzu  母  4.4  5.5  5.2  5.5  5.3  5.3  高卡路里  Maltese  母  8  4.3  4.0  4.2  标准  Poodle  母  7.4  4.7  4.7  4.6  低卡路里  Poodle  母  6.1  4.5  4.5  4.4  低卡路里  Yorkshire Terrier  母  4  5.9  5.6  5.6  标准  Yorkshire Terrier  母  15  8.7  8.8  8.6  高卡路里  Yorkshire Terrier  母  3.7  3.8  3.8  3.7  高卡路里  Yorkshire Terrier  公  5.1  4.8  4.8  4.7  标准  Yorkshire Terrier  公  2.5  3.3  3.4  3.3  高卡路里  Miniature Pinsher  公  5.1  3.6  3.5  3.5  高卡路里  Miniature  Schunauzer  母  1.4  7.2  7.0  7.0  标准

工业适用性

如上文所述，本发明的杂交多肽，其中具有抗肥胖作用的载脂蛋白B-100的B细胞表位的拟肽的C-末端与辅助T细胞表位的N-末端融合，显示了良好的抗肥胖活性而无需诱导能使载脂蛋白B-100的B细胞表位的有益活性或作用失效的免疫应答或没有引起有害副作用。因此，杂交多肽在预防或治疗肥胖上非常有用。

关于国际承认的用于专利目的的微生物保藏的布达佩斯条约

                        国际表格

由本页底部确定的国际保藏单位根据71条颁布的原始保藏事项的受理致：金晓骏

韩国京畿道425-791

安山市常绿区萨-1洞

汉阳大学HBI604

  I.微生物鉴定  交存人给与的鉴定符号  M15/pB1₄T  国际保藏单位给与的保藏号：  KCCM 10562  II.科学说明和/或所建议的分类学命名  上述I所鉴定的微生物附有：  []科学说明  []所建议的分类学命名  (标有X是可获得的)  III.接收和受理  该国际保藏单位于2004年3月4日(原始保藏日期)¹接受并受理上述I中  所命名的微生物  IV.国际保藏单位  名称：韩国微生物培养中心   地址：韩国  首尔120-019   西大门区  弘济-1-洞，有林大厦361-221  有权代表国际保藏单位的  人的签名    日期：2004年3月12日

1根据条约6.4(d)，该日期为获得国际保存管理机构资格的日期；在获得国际保存管理机构资格之后，在将布达佩斯条约之外所做的保藏转为布达佩斯条约之下的保藏的情况下，则该日期为该国际保存管理机构收到该微生物的日期。

                              序列表

<110>SJ BIOMED INC.

<120>Anti-obese immunogenic hybrid polypeptides and anti-obese vaccine

     composition comprising the same

<160>9

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>mimetic peptide for apolipoprotein B-100epitope

<400>1

Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe

1                 5                  10                  15

<210>2

<211>15

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>mimetic peptide for apolipoprotein B-100epitope

<400>2

Arg Phe Arg Gly Leu Ile Ser Leu Ser Gln Val Tyr Leu Asp Pro

  1              5                   10                  15

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>mimetic peptide for apolipoprotein B-100epitope

<400>3

Ser Val Cys Gly Cys Pro Val Gly His His Asp Val Val Gly Leu

  1               5                  10                  15

<210>4

<211>204

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>DNA sequence for terameric mimetic peptide

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(204)

<400>4

gtc gac cgt aat gtt cct cct atc ttc aat gat att tat tgg att gca    48

Val Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala

  1              5                   10                  15

ttc ctc gac cgt aat gtt cct cct atc ttc aat gat gtt tat tgg att    96

Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile

             20                  25                  30

gca ttc ctc gac cgt aat gtt cct cct atc ttc aat gat gtt tat tgg    144

Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp

         35                  40                  45

att gca ttc ctc gac cgt aat gtt cct cct atc ttc aat gat gtt tat    192

Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr

     50                  55                  60

tgg att gca ttc                                                    204

Trp Ile Ala Phe

65

<210>5

<211>68

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>5

Val Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala

  1              5                   10                  15

Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile

            20                  25                  30

Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp

         35                  40                  45

Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr

     50                  55                  60

Trp Ile Ala Phe

65

<210>6

<211>180

<212>DNA

<213>Hepatitis B virus

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(177)

<223>Hepatitis B virus preS2

<220>

<221>terminator

<222>(178)..(180)

<400>6

atg cag tgg aac tcc acc aca ttc cac caa gct ctg cta gat ccc aga    48

Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg

 1               5                  10                  15

gtg agg ggc cta tat ttt cct gct ggt ggc tcc agt tcc gga aca gta    96

Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val

             20                  25                  30

aac cct gtt ccg act act gcc tca ccc ata tcg tca atc ttc tcg agg    144

Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg

         35                  40                  45

act ggg gac cct gca ccg aac ctc gag cgg tca     taa                180

Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Leu Glu Arg Ser

     50                  55

<210>7

<211>59

<212>PRT

<213>Hepatitis B virus

<400>7

Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg

 1                5                 10                  15

Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val

             20                  25                  30

Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg

         35                  40                  45

Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Leu Glu Arg Ser

     50                  55

<210>8

<211>444

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>DNA sequence for hybride polypeptide

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(441)

<220>

<221>terminator

<222>(441)..(444)

<400>8

atg aga gga tcg cat cac cat cac cat cac gga tcc gat gat gat gac    48

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Asp Asp Asp

1               5                   10                  15

aag atc gtc gac cgt aat gtt cct cct atc ttc aat gat gtt tat tgg    96

Lys Ile Val Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp

            20                  25                  30

att gca ttc ctc gac cgt aat gtt cct cct atc ttc aat gat gtt tat    144

Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr

        35                  40                  45

tgg att gca ttc ctc gac cgt aat gtt cct cct atc ttc aat gat gtt    192

Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val

    50                  55                  60

tat tgg att gca ttc ctc gac cgt aat gtt cct cct atc ttc aat gat    240

Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp

65                  70                  75                  80

gtt tat tgg att gca ttc ctc gac atg cag tgg aac tcc acc aca ttc    288

Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe

                85                  90                  95

cac caa gct ctg cta gat ccc aga gtg agg ggc cta tat ttt cct gct    336

His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala

            100                 105                 110

ggt ggc tcc agt tcc gga aca gta aac cct gtt ccg act act gcc tca    384

Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser

        115                 120                 125

ccc ata tcg tca atc ttc tcg agg act ggg gac cct gca ccg aac ctc    432

Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Leu

    130                 135                 140

gag cgg tca taa                                                    444

Glu Arg Ser

145

<210>9

<211>147

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>9

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Asp Asp Asp

 1               5                   10                  15

Lys Ile Val Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp

             20                  25                  30

Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr

         35                  40                  45

Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val

     50                  55                  60

Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp

 65                  70                  75                  80

Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe

                 85                  90                  95

His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala

            100                 105                 110

Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser

        115                 120                 125

Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Leu

    130                 135                 140

Glu Arg Ser

145

<210>10

<211>432

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>DNA sequence for PTB14

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(429)

<400>10

atg aga gga tcg cat cac cat cac cat cac gga tcc gat gat gat gac    48

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Asp Asp Asp

 1                5                   10                  15

aag atc gtc gac atg cag tgg aac tcc acc aca ttc cac caa gct ctg    96

Lys Ile Val Asp Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu

             20                  25                  30

cta gat ccc aga gtg agg ggc cta tat ttt cct gct ggt ggc tcc agt    144

Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser

         35                  40                  45

tcc gga aca gta aac cct gtt ccg act act gcc tca ccc ata tcg tca    192

Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser

     50                  55                  60

atc ttc tcg aag act ggg gac cct gca ccg aac ctc gac cgt aat gtt    240

Ile Phe Ser Lys Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Leu Asp Arg Asn Val

 65                  70                  75                  80

cct cct atc ttc aat gat gtt tat tgg att gca ttc ctc gac cgt aat    288

Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn

                 85                  90                  95

gtt cct cct atc ttc aat gat gtt tat tgg att gca ttc ctc gac cgt    336

Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg  

            100                 105                 110

aat gtt cct cct atc ttc aat gat gtt tat tgg att gca ttc ctc gac    384

Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp

        115                 120                 125

cgt aat gtt cct cct atc ttc aat gat gtt tat tgg att gca ttc   t    430

Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe

    130                 135                 140

aa                                                                 432

<210>11

<211>143

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>11

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Asp Asp Asp

  1               5                  10                  15

Lys Ile Val Asp Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu

             20                  25                  30

Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser

         35                  40                  45

Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser

     50                  55                  60

Ile Phe Ser Lys Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Leu Asp Arg Asn Val

 65                  70                  75                  80

Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn

                 85                  90                  95

Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg

            100                 105                 110

Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp

        115                 120                 125

Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe

    130                 135                 140