一种包裹大分子药物的纳米型脂质体的制备方法

摘要

本发明公开了包裹大分子药物的纳米型脂质体的制备方法，其步骤为将卵磷脂、CaCl

说明书

技术领域

本发明涉及试验室研究和临床治疗中的给药领域，发明提供了一种能够快速，高效投递难透膜药物进入细胞的给药方法。

背景技术

试验室研究中，很多纯化获得的生物活性物质如藻蓝蛋白，超氧化物歧化酶，异硫氰酸荧光素(FITC)等不能有效进入细胞内部，这阻碍了对其的生物学活性的进一步研究；临床上，大多数肿瘤治疗药物如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，以下简称SOD)等必须进入细胞内部，才能发挥其生物学作用，天然SOD由于其分子量较大而基本不能穿透细胞膜，这导致了SOD的给药量增加，容易造成过敏性反应和毒副作用。卵磷脂是一种脂溶性物质，它所形成的球状脂质体具有生物膜的特征，可以有效透过细胞膜，并在细胞内形成一个缓释的药库，有效提高内包物质的半衰期。

发明内容

针对现有临床或研究试验中给药中存在的不足之处，本发明的目的是提供一种能快速，高效投递大分子药物到细胞内部的纳米脂质体的制备方法。

本发明提供的包裹大分子药物的纳米型脂质体的制备方法，依次包括以下步骤：

(1)将卵磷脂、CaCl₂和大分子药物于生理盐水搅拌混匀，4℃下静置，卵磷脂、CaCl₂和大分子药物的质量比为20∶10∶0.5～1；

(2)4℃下，对上述混合液交替进行超声波振荡和静置，直至得到脂质体悬液；

(3)1000～2000rpm离心脂质体悬液，收集上清；30000～50000rpm离心上清液，沉积于底部的即为脂质体小囊，PBS缓冲液洗涤脂质体小囊并溶于PBS缓冲液中，得到包裹大分子药物的纳米型脂质体。

上述的大分子药物是任何透膜能力差的物质，如超氧化物歧化酶或者藻蓝蛋白。采用超声波振荡的功率一般为400W～800W。

包裹大分子药物的纳米型脂质体的细胞给药方法：

(1)接种细胞(悬浮或贴壁细胞均可，细胞密度为5×10⁵个/ml培养基)于无血清培养基中，加入20％体积的脂质体药物，37℃二氧化碳(5％)培养箱中孵育1h，期间晃动细胞几次。

(3)PBS洗涤细胞两次，除去胞外未结合脂质体。

本发明与现有技术相比具有以下优点：(1)包裹大分子药物的纳米型脂质体，直径为90～110nm，对内包药物(如SOD)的包封率为45％。(2)制备获得脂质体能在20min内即有效投递内包药物到细胞内。(3)药物被投递到细胞后从脂质球中释放出来，进而发挥其药效，(4)脂质体原液配方中不含任何不明或细胞毒性物质，制备获得的纳米脂质体对细胞没有任何毒害作用。

附图说明

图1是400w和800w超声波功率下制备获得脂质体颗粒的直径分布曲线；

图2是脂质体投递荧光药物的时间依赖性效果，图a，b，c分别为包裹FITC的脂质体孵育细胞0min，20min，60min后的图片。脂质体内包的FITC的激发光波长和发射光波长分别为488nm和520nm；

图3是双重荧光探针标记的脂质体对SPC-A-1肺癌细胞投递后的单个细胞的示意图，图A、B、C、D分别为此细胞在各种不同激发波长下的显微图片。

具体实施方式

以下通过实例进一步对本发明进行描述：

实施例1、FITC荧光脂质体的制备

(1)混合100mg卵磷脂，46mg CaCl₂，10mg FITC(发绿色荧光的水溶性分子探针，能自发分布于脂质体微球内部)于20ml生理盐水，搅拌混匀，4℃下放置30min；

(2)4℃下，800W超声波振荡脂质体原液，每次超声波持续时间为9sec，间隔时间为1sec，并重复60次。

(3)将悬液置于4℃，静止放置10min。

(4)依次重复(2)，(3)操作两次，制备获得脂质体悬液。

(5)1000rpm离心脂质体悬液10min，收集上清；37000rpm超速离心上清液30min，沉积于底部的即为荧光脂质体小囊，PBS缓冲液洗涤脂质体小囊两次，并溶于20mL PBS中，得到包裹FITC的纳米型脂质体。

以力度仪测量获得脂质体的直径分布，直径分布为90nm-110nm(见图1)。

脂质体FITC的细胞投递：于RPM1640培养基中，接种200μl SPC-A-1肺腺癌细胞(5×10⁵ cells/ml)于96孔板，37℃，二氧化碳(5％)培养箱中培养24h。PBS洗涤两次细胞，并溶于160ul无血清培养基，加入40ul脂质体FITC，37℃孵育1h，PBS洗细胞两次除去胞外未结合脂质体。

脂质体FITC的细胞投递效果观察：200ul胰酶消化以上贴壁细胞，2000rpm离心细胞5min，收集细胞，并溶于200ul PBS，置于激光共聚焦显微镜下观察脂质体的FITC投递效果(见图2c)。由图可见包内绿色FITC荧光，表明FITC已经被投递到细胞内部。

实施例2、同实施例1步骤，其中超声波功率为400w，摸索超声波功率对脂质体制备的影响。力度仪测量结果表明800w超声波功率下制备获得脂质体大小更为均一，主要分布在90～110nm区间(见图1)。

实施例3、同实施例1步骤，其中脂质体FITC的细胞孵育时间为20min，摸索孵育时间对脂质体给药效率的影响。脂质体孵育后的胞内荧光含量分析表明，此纳米脂质体在约20min后开始投递FITC到细胞内部，并在60min后大量投递FITC到细胞内部(见图2a，b，c)。

实施例4、同实施例1步骤，其中脂质体配方为100mg卵磷脂，46mg CaCl₂，5mg FITC和5mg罗单明B(简称Rh B，是一种发红色荧光的脂溶性分子探针，能自发结合到脂质体微球表面)。制备双重荧光脂质体，摸索脂质体透膜方式和透膜后内包药物的细胞分布情况。结果表明脂质体的透膜方式不是融合，而是内吞；且脂质体内包物质在进入细胞后能从脂质体中逃逸，并释放到细胞质中(图3)。图3A显示Rh B在细胞内的分布，图3B显示FITC在细胞内的分布，图3C显示投递药物以后的细胞外形，图4D显示Rh B和FITC在细胞内的共同分布。细胞大小约20uM，切片厚度为2uM。分布于脂质球内部的绿色荧光FITC的激发光波长和发射光波长分别为488nm和520nm，分布于脂质球表面的红色荧光Rh B的激发光波长和发射光波长分别为543nm和560nm。

在双重激发光同时激发下，细胞内出现Rh B表明脂质体在投递药物同时，外层的卵磷脂也进入细胞，暗示脂质体的药物投递过程不是融合，而是内吞。细胞内Rh B和FITC并不重合，说明透膜后FITC不再局限于脂质球的内部，而是释放到细胞质中，均匀分布。细胞内Rh B分布不均匀，说明脂溶性卵磷脂在胞内相互融合；细胞内均匀分布的FITC说明水溶性FTIC逃脱脂质球后在细胞内均匀分布。

实施例5

(1)同实施例1步骤制备脂质体SOD并投递到肿瘤细胞内部，其中脂质体配方为100mg卵磷脂，46mg CaCl₂，5mg SOD(8000U/mg)，制备内包大分子临床药物(SOD)的脂质体。

(2)脂质体SOD的包埋率计算：以100g/L Triton-100溶解20ml脂质体悬液离心获得的脂质体小囊，Folin-酚法测定其中蛋白含量，包埋率＝脂质体小囊SOD蛋白含量/总SOD投入量(8mg)×100％。结果表明此纳米型脂质体对SOD的包埋率为45％。

以上列举的分别是试验室研究和临床给药中最具代表性的FITC和SOD的脂质体制备和应用方法，所选用的细胞为目前国内发病较多的SPC-A-1肺癌细胞。显然，本发明制备的脂质体包裹对象不限于以上大分子物质，它还包括了所有透膜能力差的大分子药物；投递对象也不限于以上细胞株。在实验室研究中的细胞给药领域和临床治疗的给药领域，利用此法进行任何相关或相似的给药，均应认为是本发明的保护范围。