法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-10-17
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C07K14/435 授权公告日:20110921 终止日期:20160826 申请日:20050826
专利权的终止
2011-09-21
授权
授权
2007-05-02
实质审查的生效
实质审查的生效
2007-02-28
公开
公开
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码慢性神经痛相关蛋白RSEP1的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。
背景技术
慢性神经痛是外周或中枢神经系统病变或损伤引起的疼痛，临床上对慢性神经痛的治疗效果往往不佳[Merskey H，Bogduk N.Classification of chronicpain.Classification of chronic pain.IASP Press，Seattle，1994，394]。
慢性神经痛临床主要表现为受损神经支配区域的痛觉和感觉异常，如痛觉过敏(hyperalgesia，对正常痛刺激反应增强)；触诱发痛(allodynia，非疼痛刺激也能引起痛感觉)、感觉异常(paresthesia)、各种烧灼感、电击样感觉以及感觉缺失等等。
已经有很多的证据显示，脊髓的背角参与慢性神经痛的调制过程[IadarolaMJ，Berman，KF，Zeffiro TA，et al.Byas-Smith，M.G.，Gracely，R.H.，Max，M.B.&Bennett，G.J.Neural activation during acute capsaicin-evoked painand allodynia assessed with PET.Brain，1998，121：931-9471；Peyron R，Garcia-Larrea L，Gregoire MC，et al.Allodynia after lateral-medullary(Wallenberg)infarct.A PET study.Brain，1998，121：345-356]，并且，有很多的基因参与慢性神经痛形成的过程[Boucher TJ，Okuse K，Bennett DL，et al.Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states.Science，2000，290：124-127；Malmberg AB，Chen C，Tonegawa S，et al.Preserved acute painand reduced neuropathic pain in mice lacking PKCgamma.Science，1997，278：279-283]。另外，研究也表明，神经调质如速激肽[Zieglgansberger W，BertheleA，Tolle TR.Understanding neuropathic pain.CNS.Spectr.，2005，10：298-308]和内源性的阿片肽[Jones AK，Watabe H，Cunningham VJ et al.Cerebraldecreases in opioid receptor binding in patients with central neuropathicpain measured by[11C]diprenorphine binding and PET.Eur.J.Pain，2004，8：479-485]也参与了慢性神经痛的形成过程。然而到目前为止，慢性神经痛的分子机制还不清楚。
因此，本领域迫切需要开发新的慢性神经痛相关蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的慢性神经痛相关蛋白RSEP1蛋白以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的慢性神经痛相关蛋白-RSEP1多肽，它包括：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地，该多肽选自下组：
(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有传导神经痛的功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述RSEP1多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中4-429位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-917位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有RSEP1蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达RSEP1蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有RSEP1蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的RSEP1多肽特异性结合的抗体。
在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗RSEP1多肽活性的化合物，以及抑制RSEP1多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是RSEP1多肽的编码序列或其片段的反义序列。
在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在RSEP1蛋白的方法，它包括：将样品与RSEP1蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在RSEP1蛋白。
在本发明的第八方面，提供了一种检测与RSEP1多肽异常表达相关的疾病(如慢性神经痛)或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。
在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进RSEP1多肽活性的激动剂，或者筛选抑制RSEP1多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的RSEP1蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量(如0.001-99.99wt％，较佳地0.01-90wt％)的本发明的RSEP1多肽或其激动剂、拮抗剂(如反义核酸或抗体)以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可促进或抑制神经痛的传导。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了RSEP1的cDNA序列及各物种的蛋白序列比较。其中图1A：大鼠RSEP1 cDNA序列和蛋白序列，黑体是翻译起始密码子，星号标记的是终止密码子，下划线标记的是聚腺苷酸化信号。图左面数字标记是核苷酸，右面的数字标记的是氨基酸。方框里面的是设计反义核酸和错义核酸的序列。图1B：大鼠、人、小鼠、果蝇和线虫的RSEP1氨基酸序列的比较。短线表示的是相同的氨基酸残基，缺失的氨基酸残基用空格表示。
图2显示了大鼠RSEP1基因表达的Northern Blot分析结果。
图3显示了RSEP1 mRNA在大脑、小脑和脊髓的原位杂交的结果。其中用地高辛标记的RSEP1 cDNA探针和大脑(A)，小脑(C)和脊髓(E)进行原位杂交。B，D，F显示的放大的图像。标尺：A、C为1000μm，D为500μm，B、E为250μm，F为100μm。
图4显示了EGFP-RSEP1融合蛋白的亚细胞定位结果。其中，用EGFP-RSEP1融合蛋白表达载体(A，C)和空白对照载体EGFP-C2转染HEK293T细胞。转染24小时后，用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达(A，D)。用DAPI染核(B，E)，C和F是叠加的图像。箭头指示的是细胞核。标尺：20μm。
图5显示了RSEP1反义寡核苷酸(一种RSEP1拮抗剂)减轻了大鼠的慢性神经痛症状。横坐标为后肢回缩等待时间(paw withdrawal latency)或后肢回缩阈值(g)，纵坐标为手术后时间(天)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次通过大鼠慢性神经痛CCI(ChronicConstriction Injury，CCI)模型，利用cDNA微阵列技术结合原位杂交的方法分离出了一个慢性神经痛相关基因-RSEP1(Rat Spinal-cord Expression Protein1，RSEP1)，实验结果表明，RSEP1是一种慢性神经痛相关蛋白。
具体地，本发明人通过原位杂交技术研究了RSEP1基因在大鼠的脊髓和脑部的表达模式，结果发现在脊髓中，RSEP1主要表达在脊髓背角的I-II层，V层的小的感觉神经元以及脊髓腹角的大的运动神经元中都具有较高的表达。在大脑皮层中，RSEP1主要表达在额叶皮质(frontal cortex，Fr)，丘脑上辐射(superiorthalamic radiation，Str)，并且，在海马的CA1区，CA3区和齿状回(dentategyrus，DG)有很强的表达。另外，在小脑的颗粒细胞中也有很高水平的表达。RSEP1在脊髓中的表达模式提示，RSEP1是一个慢性神经痛相关基因。
另外，通过用反义核酸抑制RSEP1的表达，结果发现RSEP1反义寡核苷酸可以减轻了大鼠的慢性神经痛症状。这表明，RSEP1的确是一种慢性神经痛相关蛋白。
在本发明中，术语“RSEP1蛋白”、“RSEP1多肽”或“慢性神经痛相关蛋白RSEP1”可互换使用，都指具有慢性神经痛相关蛋白RSEP1氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的慢性神经痛相关蛋白RSEP1。
如本文所用，术语“RSEP1蛋白”还包括来自其他动物的同源蛋白，例如人的RSEP1蛋白。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的RSEP1蛋白或多肽”是指RSEP1多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化RSEP1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。RSEP1多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括RSEP1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然RSEP1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“RSEP1多肽”指具有RSEP1蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与RSEP1蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括RSEP1蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与RSEP1 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗RSEP1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含RSEP1多肽或其片段的融合蛋白(如与GST或6His融合所形成的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了RSEP1多肽的可溶性片段。通常，该片段具有RSEP1多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供RSEP1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然RSEP1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“RSEP1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码RSEP1蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的RSEP1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或RSEP1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的RSEP1多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码RSEP1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，RSEP1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含RSEP1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的实验结果提示，RSEP1蛋白功能低下或丧失会导致神经痛传导水平下降，而RSEP1蛋白功能亢奋会导致神经痛传导水平上升。重组的RSEP1蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗RSEP1蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗RSEP1蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组RSEP1蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激RSEP1蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对RSEP1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于RSEP1基因产物或片段。较佳地，指那些能与RSEP1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制RSEP1蛋白的分子，也包括那些并不影响RSEP1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的RSEP1基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的RSEP1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达RSEP1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hvbridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断RSEP1蛋白功能的抗体以及不影响RSEP1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用RSEP1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与RSEP1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗RSEP1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的RSEP1蛋白。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与RSEP1蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断RSEP1蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如RSEP1蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭RSEP1蛋白阳性的细胞。
多克隆抗体的生产可用RSEP1蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与RSEP1蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。由于RSEP1蛋白功能低下或丧失会导致神经痛传导水平下降，而RSEP1蛋白功能亢奋会导致神经痛传导水平上升。因此，RSEP1蛋白及激动剂可以促进神经痛的传导，而RSEP1的抑制剂(如抗体、反义核酸等)和拮抗剂可以抑制神经痛的传导。
通常，可将这些物质(本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体)配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的多肽的抑制剂或拮抗剂(如反义核酸)可直接用于疾病治疗，例如，用于慢性神经痛方面的治疗。在使用本发明RSEP1蛋白时，还可同时使用其他治疗剂。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明RSEP1多肽或其拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的RSEP1蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
RSEP1蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于RSEP1蛋白的无表达或异常/无活性的RSEP1蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的RSEP1蛋白，以抑制内源性的RSEP1蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将RSEP1基因转移至细胞内。构建携带RSEP1基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组RSEP1基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。
抑制RSEP1 mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
能与RSEP1蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对RSEP1蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测RSEP1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的RSEP1蛋白水平，可以用作解释RSEP1蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断RSEP1蛋白起作用的疾病。
一种检测检测样品中是否存在RSEP1蛋白的方法是利用RSEP1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与RSEP1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在RSEP1蛋白。
RSEP1蛋白的多聚核苷酸可用于RSEP1蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，RSEP1蛋白的多聚核苷酸可用于检测RSEP1蛋白的表达与否或在疾病状态下RSEP1蛋白的异常表达。如RSEP1 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断RSEP1蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用RSEP1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测RSEP1蛋白的转录产物。
检测RSEP1基因的突变也可用于诊断RSEP1蛋白相关的疾病。RSEP1蛋白突变的形式包括与正常野生型RSEP1 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明RSEP1蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从大鼠cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为917个碱基，其开放读框位于4-429位，编码全长为509个氨基酸的RSEP1蛋白(SEQ ID NO：2)。本发明蛋白提供了治疗慢性神经痛的新靶点，因而具有巨大的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料
Oligotex Direct mRNA Mid & Max Kit购自Qiagen公司
杂交尼龙膜购自Schleicher & Schuell公司
Taq polymerase购自New England Biolabs公司
TRIzol为Invitrogen公司产品
dNTP、DTT为Promega公司产品
DNA labeling kit为TAKARA公司产品
随机引物为Invitrogen公司产品
Sephadex G-50为Pharmacia公司产品
α-32P-dATP同位素购自Amersham Pharmacia Biotech公司
Sprague-Dawley成年大鼠(200-280g)购自中国科学院上海实验动物中心。
SP6/T7 Transcription Kit：购自Roche公司
通用方法：
(a)CCI大鼠模型制作：
CCI大鼠模型的制作方法如下：用戊巴比妥钠麻醉大鼠(40mg/kg，i.p.)，在大腿中部作切口，用钝器向两侧分开肌肉，暴露坐骨神经，用4.0号手术缝合线作四道轻度结扎，结扎的力度应该以大鼠的腿出现一次抽搐为宜，结扎的缝合线之间隔大约1mm的距离，缝合肌肉和皮肤。对照组利用同样的方法暴露坐骨神经，用手术缝合线在坐骨神经下方穿过，但是不结扎，缝合肌肉和皮肤。每只大鼠在手术后，在进行行为学检测前，至少恢复24小时。
实施例1：RSEP1蛋白cDNA的克隆
本发明人通过大鼠慢性神经痛CCI模型，用TRIzol试剂抽提大鼠腰膨大部的脊髓的总RNA，反转录标记探针，来差异筛选大鼠脑的cDNA文库制作的cDNA微阵列。并通过对各差异表达克隆所含的DNA序列进行双向测定，得到了一系列差异表达基因。其中一个cDNA克隆的DNA序列为新的全长cDNA。计算机分析表明，该全长cDNA是一个新的cDNA序列(如SEQ ID NO：1所示)，编码一个新的蛋白质(如SEQ ID NO：2所示)。此蛋白质被命名为RSEP1蛋白，其编码基因命名为RSEP1蛋白基因。
通过测序，Blast比较发现，RSEP1它是一个新的基因，并且包含了ORF全长(图1和SEQ ID NO：1)。RSEP1的cDNA全长为917bp，它的ORF长426bp，编码一个142个氨基酸的蛋(SEQ ID NO：2)白。在poly(A)+尾巴的上游19个碱基处有一个聚腺苷酸化信号(ATTAAA)。
MAAAAEGVPA TRREEPPRDD AAVETAEEAK EPAEADINEL CRDMFSKMAT YLTGELTATS 60
EDYKLLENMN KLTSLKYLEM KDIAINISRN LKDLNQKYAG LQPYLDQINV IEEQVAALEQ 120
AAYKLDAYSK KLEAKYKKLE KR 142
(SEQ ID NO：2)
通过BLASTP，本发明人把这个推测的氨基酸序列和蛋白质数据库中的序列进行了比较，结果发现了四个不同物种的同源序列。序列分析显示，这个蛋白是一个跨物种的高度保守的蛋白，大鼠的氨基酸序列和人的、小鼠的、果蝇的以及线虫的同源相似性分别是100％，98％，39％和31％(图1B)。因为其他四个物种的同源蛋白以及大鼠的RSEP1蛋白的功能研究还没有报导，所以本发明人把这个基因命名为RSEP1(Rat Spinal-cord Expression Protein 1，RSEP1)。通过http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/RnBlast.html，发现RSEP1基因位于大鼠染色体1q54的区域。
实施例2：用RT-PCR方法克隆RSEP1蛋白的编码序列
用Trizol(Gibco公司)提取处于大鼠的L4-5的脊髓的总RNA，取总RNA与0.5μg Oligo-dT12-18混合，进行反转录。反转录体系为20μl，反应结束后加80μlddH2O进行稀释。PCR扩增所用的引物如下：有义引物：5’-ggc atg gcg gct gctgcg gag ggc-3’(SEQ ID NO：3)，反义引物5’-tgagacacac gaacatgatt ctca-3’(SEQ ID NO：4)。PCR反应体积为50μl，其中含反转录模板10μl、0.4mM引物、0.2mMdNTP和1U ExTaq DNA聚合酶(Takara Inc.)，扩增参数为94℃30秒、60℃30秒、72℃45秒，25个循环后PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳初步确认。DNA序列分析结果表明该PCR产物的编码DNA序列与SEQ ID NO：1所示的编码区完全相同(PCR产物对应于SEQ ID NO：1中的1-453位)。
实施例3 RSEP1蛋白重组表达和纯化
在该实施例中，以实施例2中的PCR扩增产物为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得RSEP1 DNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为：
5′-CAGGTACCGGTCCGGAATTC-3′(SEQ ID NO：7)
该引物含有EcoRI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的部分编码序列；
3’端引物序列为：
5′-GGGGTACCTCAGCCTCAGGATTTAGTGG-3′(SEQ ID NO：8)
该引物含有KpnI限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和RSEP1的部分编码序列。
RSEP1蛋白cDNA PCR产物纯化后经EcoR I/KpnI酶切再与质粒pUC18按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。将正确序列的RSEP1蛋白cDNA EcoR I酶切片段克隆至市售的表达载体pGEX-2T，形成载体pGEX-2T-RSEP1，然后转化人DH5α。阳性克隆经酶切鉴定插入方向，酶切产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。经测序证实，已插入了完整的RSEP1编码序列。
挑表达RSEP1的阳性DH5α克隆接种于100ml 2×YTA培养基中，37℃300rpm振荡培养12-15hr，1∶10稀释于预热的2×YTA培养基继续振荡培养1.5hr，加100mMIPTG至0.1mM后30℃诱导2-6hr，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重悬，超声(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％轻摇30min，然后12,000g 4℃离心10min，上清用0.8μm滤膜过滤后，过1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B层析柱，1×PBS充分洗涤后，加入500ul谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH8.0)室温静置30分钟后收集洗脱液，重复洗脱2-3次，得到RSEP1蛋白，分子量与预测值相符。
实施例4抗RSEP1蛋白抗体的产生
将实施例3中获得的重组RSEP1蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀RSEP1蛋白基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。
实施例5 RSEP1 mRNA的组织分布：
通过Northern Blot的方法来研究RSEP1基因在大鼠各个组织中的表达分布情况。方法如下：从8周成年大鼠的脊髓中抽提大约20微克的总RNA，甲醛凝胶电泳后，转膜到带正电的尼龙膜上，然后用α-32P标记的探针杂交。RSEP1 mRNA的大小约为1.8kb，18S rRNA作为上样对照。
结果如图2所显示的，RSEP1 mRNA在各个组织中都只检出了一条大约1.8kb的条带，在大部分的脑区，除了小脑外，都有很高的表达；在脊髓，RSEP1 mRNA也有较高的表达；另外，在外周神经系统的肾脏和卵巢中，表达也较高，而其他的组织表达水平较低。
实施例6 RSEP1基因在CNS中的表达模式：
本实施例利用原位杂交的方法来研究RSEP1在大鼠中枢神经系统的表达模式。方法如下：用地高辛标记的RSEP1 cDNA探针和大脑(A)，小脑(C)和脊髓(E)进行原位杂交。
结果如图3所示。在大脑皮层，RSEP1 mRNA主要表达在前额叶和丘脑上放射，在海马的CA1区，CA3区和DG区的颗粒细胞也有很高水平的表达(图3A，B)。在脊髓，RSEP1 mRNA主要表达在背角的I-II层和V-VI层细胞以及腹角的大的运动神经元(图3E，F)。在小脑，主要表达在颗粒细胞层(图3C，D)。
实施例7 RSEP1融合蛋白的亚细胞定位：
(a)EGFP-RSEP1融合蛋白表达质粒载体的构建：
根据RSEP1基因的ORF前的序列，通过PCR的方法，把RSEP1基因的ORF(4-432bp)插入到市售的pEGFP-C2表达载体中。设计引物如下：
正向引物：5′-CAGGTACCGGTCCGGAATTC-3′(SEQ ID NO：7)
反向引物：5′-GGGGTACCTCAGCCTCAGGATTTAGTGG-3′(SEQ ID NO：8)
PCR产物用EcoRI和KpnI酶切，同样，pEGFP-C2载体也用EcoRI和KpnI酶切，回收，然后连接，构建融合载体。
(b)亚细胞定位
由于RSEP1是一个新的大鼠的cDNA序列，它没有任何已知的序列基序，所以了解RSEP1蛋白的亚细胞定位可能对研究RSEP1这个基因的功能会有帮助。用构建好的EGFP-RSEP1融合蛋白表达载体转染人胚胎肾293T细胞，用激光共聚焦显微镜来扫描细胞。
结果如图4所示。EGFP-RSEP1融合蛋白完全定位在细胞质中，在细胞核中没有EGFP-RSEP1融合蛋白的表达(图4A，4C)；相反，空白对照载体EGFP-C2在细胞质和细胞核中都有表达(图4D，4F)，这些结果表明RSEP1蛋白是一个细胞质蛋白。
实施例8 RSEP1反义寡核苷酸减轻大鼠慢性神经痛：
(a)反义寡脱氧核苷酸的合成和灌注：
为了探索RSEP1基因在大鼠慢性神经痛形成过程中具有的功能，本发明人根据RSEP1基因的序列设计和合成了反义核酸5’-tct cca ccg cag cat cgt ct-3’(SEQ ID NO：5以及错义核酸5’-ctt acc gca gca cct ctg ct-3’(SEQ ID NO：6)，RSEP1基因的序列见图1。在戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)的情况下，通过第四、第五腰椎的椎间孔把PE-10鞘内导管插入到L4-L5腰椎膨大部的蛛网膜下腔，导管内注入无菌的生理盐水(大约4μl)，露出体外的一端用塞子塞紧。将插入导管的大鼠饲养在单个的笼子中，恢复4天。将合成的反义核酸和missense溶解到0.9％的生理盐水中，然后注射到实验大鼠的L4-L5腰椎膨大部的蛛网膜下腔(4μl perrat，oligonucleotide at 0.5μg/μl)，再用5μl的生理盐水冲洗一次。每24小时注射一次，共注射4天。测痛，分析其行为学的变化，研究其功能。
(b)行为学检测方法
1、热痛敏：
采用Hargreaves等[Hargreaves等，1988]介绍的研究方法来测量大鼠受到伤害性热刺激以后，其后肢的收缩潜伏期。方法如下：把大鼠单个放到树脂玻璃笼子中，其中有一个抬高的玻璃平台，在平台的下方有一个发散性的热源。当大鼠对检测的笼子的环境熟识以后，开始用发散性的热源照射大鼠的后肢，当大鼠的脚爪抬起时，关掉热源，记录下大鼠从受到伤害性的热刺激到其后肢收缩的时间，这个时间被定义为后肢收缩的潜伏期，从而来测量其热痛敏。
热源保持一个恒定的强度，这样在CCI模型大鼠的没有手术的一侧产生了一个比较稳定的8-10秒的收缩潜伏期。如果大鼠对热源没有反应，照射20秒时就要关掉热源，以免组织灼伤。把大鼠分为每组4个来进行检测，这样，对大鼠的左后肢(对照的一侧)检测一次，间隔5分钟后，再检测右后肢(CCI一侧)。每组4只大鼠重复再测两次，最后把每侧的这三次的结果平均。
2、机械痛敏：
用一系列标准的范围从0.6-18克的von Frey金属针来测量大鼠后肢的收缩域值。把单只大鼠放到底部有金属网格的笼子中，使其对环境适应30分钟。按照逐步升高的次序(0.6，0.9，1.3，2.2，4.8，6，7.2，9，13，和18克)用von Frey金属针来刺激大鼠后肢脚底的中央区域，每次6秒钟。只有当大鼠的四肢都着地的时候才用von Frey金属针来刺激。刺激以后，只有当后肢完全的离开了金属网格的笼底才认为是一次收缩反射。重新对这个后肢进行检测，当收缩反射建立以后，再用下一个von Frey金属针来刺激，直到没有反应发生。用一系列的von Frey金属针来刺激大鼠的后肢5次，每次间隔15秒钟，在5次的刺激中，如果最小的刺激能够引起有3次的收缩反射，这个最小的刺激就是收缩域值。一旦左侧(对照的一侧)的域值被确定了，5分钟以后，用同样的检测程序再来检测右侧(CCI的一侧)，确定其收缩域值。
统计分析：
数据用平均数±标准误来表示，通过双因素多重方差分析来计算其统计学意义。P＜0.05被认为有统计学意义。
结果：
本实施例利用大鼠的神经损伤诱导的慢性神经痛模型-CCI模型[Bennett GJ，Xie YK.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of painsensation like those seen in man.Pain，1988，33：87-107]来探究RSEP1基因的功能。象以前报导的一样，在单侧CCI手术后3天内，大鼠显示出强烈的热痛敏和机械痛敏(图5，A，B)。在CCI手术后，最早在2天就出现痛敏反应。这些神经痛行为在手术损伤后肢后可以维持一个月之久，而对侧空白对照一侧在痛敏反应上没有表现出很大的变化(图5，A，B)。
大鼠的一侧后肢坐骨神经接受CCI手术，而另一侧作为空白对照。热痛敏(A)和机械痛敏(B)。在损伤的一侧表现出热痛敏(A)和机械痛敏(B)，而空白对照一侧没有表现出痛敏。脊髓蛛网膜下腔鞘内注射生理盐水没有减弱CCI损伤诱导的神经痛行为。通过在鞘内注射RSEP1反义寡核苷酸(每天注射一次，注射4天)减弱了CCI损伤诱导的热痛敏(C)和机械痛敏(D)，而注射生理盐水或RSEP1错义寡核苷酸不能够减弱这种痛敏。对于空白对照的后肢来说，无论是注射RSEP1的反义寡核苷酸还是错义管核苷酸还是生理盐水，都不能够影响热痛敏和机械痛敏。
鞘内注射RSEP1反义寡核苷酸，既能够减弱CCI大鼠的热痛敏也能够减弱机械痛敏(图5C，5D)。方差分析显示，在注射反义寡核苷酸组和对照组具有明显的统计学意义的差别(p＜0.05)。并且，作用于神经痛的反义寡核苷酸特异性的效果是可逆转的，在停止注射反义寡核苷酸以后，这种减弱的痛敏又慢慢恢复到以前的痛觉过敏和触诱发痛(图5C，5D)。RSEP1的反义寡核苷酸对痛行为的影响是CCI诱导的神经痛特异的，其对侧后肢的收缩的域值和潜伏期不受影响(图5E，5F)。
讨论：
在本发明中，通过抽提CCI大鼠的L4-5的脊髓的mRNA，反转录标记探针来筛选大鼠脑的cDNA文库，鉴定了大鼠的一个新基因，RSEP1(图1)。Northern blot分析揭示了RSEP1在一些脑区、脊髓和外周组织都有表达(图2)。原位杂交结果(图3)显示，RSEP1在海马的CA1，CA3和DG区，在脊髓背角的小的感觉神经元以及脊髓腹角的大的运动神经元都有较高水平的表达。在脊髓的背角，RSEP1表达在I-II和V-VI层，这个位置的神经元主要负责对伤害性的刺激做出反应[Fyffe，1984]，表明这个基因可能参与慢性神经痛的形成过程。在细胞水平上，RSEP1蛋白表达在细胞质中(图4)，表明这个基因的功能主要是参与细胞信号，而不是在细胞核中影响基因的表达。
在外周神经损伤以后神经痛形成的过程中，已有的研究发现，不同水平的很多基因的表达发生了变化[Costigan M，Befort K，Karchewski L，et al.Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays revealhundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheralnerve injury.BMC.Neurosci.，2002，3：16；Valder CR，Liu JJ，Song YH，et al.Coupling gene chip analyses and rat genetic variances in identifyingpotential target genes that may contribute to neuropathic allodyniadevelopment.J.Neurochem.，2003，87：560-573；Wang H，Sun H，Della PK，et al.Chronic neuropathic pain is accompanied by global changes in geneexpression and shares pathobiology with neurodegenerative diseases.Neurosci.，2002，114：529-546；Xiao HS，Huang QH，Zhang FX，et al.Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in therat peripheral axotomy model of neuropathic pain.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99：8360-8365：Yang L，Zhang FX，Huang F，et al.Peripheralnerve injury induces trans-synaptic modification of channels，receptorsand signal pathways in rat dorsal spinal cord.Eur.J.Neurosci.，2004，19：871-883]。但是，这些基因的表达变化只是和行为学的变化相关，而在基因表达水平的变化和行为学水平上的痛敏的变化方面还没有因果关系方面的证据。从这个方面来说，RSEP1的反义寡核苷酸能够减弱神经痛的行为是值得注意的，这表明，在RSEP1基因的表达变化和神经痛行为之间存在因果关系。
综上所述，本发明人鉴定了一个与大鼠的慢性神经痛行为相关的新基因-RSEP1。因为RSEP1无论在DNA水平上还是蛋白水平上都是非常保守的，并且蛋白同源类似物的功能还不清楚，因此，RSEP1可能代表了一类介导(或传导)慢性神经痛行为的新的蛋白。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学院
<120>慢性神经痛相关蛋白及其基因
<130>056616
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>917
<212>DNA
<213>大鼠(rat)
<220>
<221>CDS
<222>(4)..(429)
<223>
<400>1
ggc atg gcg gct gct gcg gag ggc gtc ccg gcg acg cga cgg gag gag 48
Met Ala Ala Ala Ala Glu Gly Val Pro Ala Thr Arg Arg Glu Glu
1 5 10 15
ccg cct cga gac gat gct gcg gtg gag aca gct gag gaa gca aag gag 96
Pro Pro Arg Asp Asp Ala Ala Val Glu Thr Ala Glu Glu Ala Lys Glu
20 25 30
cct gca gaa gct gac atc aat gaa ctc tgc cgg gac atg ttc tcc aaa 144
Pro Ala Glu Ala Asp Ile Asn Glu Leu Cys Arg Asp Met Phe Ser Lys
35 40 45
atg gcc aca tat ttg act ggg gaa ctg aca gcc acc agt gaa gac tac 192
Met Ala Thr Tyr Leu Thr Gly Glu Leu Thr Ala Thr Ser Glu Asp Tyr
50 55 60
aaa ctc ctg gaa aat atg aat aag ctc acg agc ttg aag tac ctt gaa 240
Lys Leu Leu Glu Asn Met Asn Lys Leu Thr Ser Leu Lys Tyr Leu Glu
65 70 75
atg aaa gac att gct ata aac atc agc aga aac ctg aag gac tta aac 288
Met Lys Asp Ile Ala Ile Asn Ile Ser Arg Asn Leu Lys Asp Leu Asn
80 85 90 95
cag aaa tat gcc gga ctg cag cca tat ctg gat cag atc aac gtg att 336
Gln Lys Tyr Ala Gly Leu Gln Pro Tyr Leu Asp Gln Ile Asn Val Ile
100 105 110
gag gag cag gtg gca gct ctc gag cag gca gcc tac aag ttg gat gct 384
Glu Glu Gln Val Ala Ala Leu Glu Gln Ala Ala Tyr Lys Leu Asp Ala
115 120 125
tat tca aag aaa ctg gaa gcc aag tac aag aag ttg gag aag cga 429
Tyr Ser Lys Lys Leu Glu Ala Lys Tyr Lys Lys Leu Glu Lys Arg
130 135 140
tgagaatcat gttcgtgtgt ctcaagtgtt ttttaatatg gaagttgttt tataaccact 489
aaatcctgag gctgacaatt atcacagttc ctcagaagaa aactgctggt taatcccaag 549
accacacgat accacggatg aactggaggg ctgcggctgt tctggagtct cctctgaggt 609
ggtacctctc agaaactcac acccagaatg cctcaccgtt tacttgaatg cttcatcatc 669
catacaagat ggagactcta gagttcaggg catacctggg cttgccagta gagtccaggg 729
aggggacctg ctttccctgg tattgggcaa ttagcacgtt attttctaaa atggctgttt 789
tgttcgtttt gttttctact gatgatataa tgtattatta acaagattct aaattaaaag 849
ggaaaacaaa acataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 909
aaaaaaaa 917
<210>2
<211>142
<212>PRT
<213>大鼠(rat)
<400>2
Met Ala Ala Ala Ala Glu Gly Val Pro Ala Thr Arg Arg Glu Glu Pro
1 5 10 15
Pro Arg Asp Asp Ala Ala Val Glu Thr Ala Glu Glu Ala Lys Glu Pro
20 25 30
Ala Glu Ala Asp Ile Asn Glu Leu Cys Arg Asp Met Phe Ser Lys Met
35 40 45
Ala Thr Tyr Leu Thr Gly Glu Leu Thr Ala Thr Ser Glu Asp Tyr Lys
50 55 60
Leu Leu Glu Asn Met Asn Lys Leu Thr Ser Leu Lys Tyr Leu Glu Met
65 70 75 80
Lys Asp Ile Ala Ile Asn Ile Ser Arg Asn Leu Lys Asp Leu Asn Gln
85 90 95
Lys Tyr Ala Gly Leu Gln Pro Tyr Leu Asp Gln Ile Asn Val Ile Glu
100 105 110
Glu Gln Val Ala Ala Leu Glu Gln Ala Ala Tyr Lys Leu Asp Ala Tyr
115 120 125
Ser Lys Lys Leu Glu Ala Lys Tyr Lys Lys Leu Glu Lys Arg
130 135 140
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物
<400>3
ggcatggcgg ctgctgcgga gggc 24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物
<400>4
tgagacacac gaacatgatt ctca 24
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<223>反义核酸
<400>5
tctccaccgc agcatcgtct 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<223>错义核酸
<400>6
cttaccgcag cacctctgct 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物
<400>7
caggtaccgg tccggaattc 20
<210>8
<211>28
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物
<400>8
ggggtacctc agcctcagga tttagtgg 28
机译： 制备用于治疗动物神经痛，慢性退行性疾病相关性疼痛和手术后疼痛的药物的药物组合物
机译： 药物组合物治疗神经痛和神经痛的慢性疼痛
机译： 药物组合物治疗神经痛和神经痛的慢性疼痛
