一种具有增强植物基因表达和启动子活性的内含子

摘要

本发明涉及一种具有增强基因表达并且本身具有启动子活性的内含子，该序列为菜豆重金属诱导基因PvSR2的444bp的内含子序列。应用本发明的内含子进行植物的转基因开发，能提高目标基因的表达，具有重要的应用价值，该内含子也可以用作转基因产品开发中控制外源基因表达的启动子。

说明书

发明领域

本发明属于植物内含子领域，特别是关于一种具有增强基因表达能力和启动子活性的菜豆重金属诱导基因PvSR2的内含子序列，以及该内含子序列在植物转基因开发上的用途。

背景技术

真核生物基因经常为一个或多个内含子(intron)隔离成断裂基因，这些内含子必须精确地剪切以形成功能性的mRNAs。这是真核生物基因表达的基本特征，也是基因表达调控的重要途径。人们很早就知道动物基因的内含子对基因表达有增强作用。但在植物方面，直到1987年Callis等(Callis et al.1987，Genes Dev.1：1183-1200)首次证明玉米Adh1基因第一内含子在玉米细胞中能增强Adh1基因和外源CAT基因(chloramphenicol acetyltransferase)基因的表达后才被正式提出。随后，植物基因内含子在一些植物中能增强外源基因表达的能力，这些转基因植物包括水稻(McElroy et al.，1990，Plant Cell2：163-171；Snowden et al.，1996，Pant Mol Biol 31：689-692；Rethmeier et al.，1997，Plant J 12：895-899)，大豆(Kato et al.，1998，Biosci Biotechnol Biochem62：151-153)，马铃薯(Leon et al，1991 Plant Physiol 95：968-972；Fu et al.，1995a Plant Cell 7：1387-1394，1995b Plant Cell 7：1395-1403)，，拟南芥菜(Roseand Last，1997，Plant J 11：455-464；Chaubet-Gigot et al.，200l，Plant Mol Biol45：17-30)，烟草(Plesse et al，2001，Plant Mol Biol 45：655-667)。植物中内含子的增强基因表达的效应被Mascarenhas等在1990年定义为内含子介导的增强基因表达效应(intron-mediated enhancement(IME)of gene expression)(Mascarenhas et al.，1990，Plant Mol Biol 15：913-920)。IME并不是常见的现象，因为一些天然不含内含子的植物基因表达效率很高，而一些内含子不能增强外源转基因的表达水平(Chee et al.，1986，Gene 41(1)：47-57；Mascarenhaset al.，1990，Plant Mol Biol 15：913-920)。与转录增强子不同的是，内含子的增强效应依赖于它在转录单位内的位置和取向。在多数情况下，内含子正向插入到转录单位5`端是增强基因表达所必需的。IME取决于内含子的类型、在转录单位内的位置、所用启动子、外源基因、内含子两侧的外显子序列以及宿主细胞等多种因素。但也发现有增强子样的内含子，它们的增强效应与其在转录单位内的位置和方向无关。如番茄蛋白酶抑制剂II的内含子无论以正向或反向插入到35S-GUS-NOS表达框的5`端和3`端，均能增强GUS报告基因在烟草叶片中的瞬时表达(谢先芝和吴乃虎，2001，科学通报46：934-938)。内含子增强基因表达在单子叶植物中非常明显，可达100倍，但在双子叶植物中增强幅度只有2-5倍(Simpson and Filipowicz，1996，PlantMol.Biol.32：1-41)。植物的内含子增强基因表达的机理还不十分清楚，一般可以接受的观点是在转录水平或转录后水平上内含子能增强转录的效率或稳定mRNA来增强mRNA的积累从而增强基因表达(Rose and Beliakoff，2000，Plant Physiol 122：535-542；Clancy and Hannah，2002，Plant Physiol 130：918-929)。综上所述，可见内含子在转基因植物中能提高外源基因的表达，因此具有很大的应用价值。

植物内含子除了具有增强基因表达的能力外，极少数植物的内含子还具有启动子的功能，能够独自启动目的基因的表达。玉米泛素基因的第一个内含子连同40bp部分第一个外显子序列能够启动GUS基因在未成熟的三叶草花序和小麦盾片中瞬时表达，并且其表达活性较泛素基因启动子作为调控序列时高出50倍(Salgueiro et al.，2000，Plant Mol Biol.42；615-22)。水稻Ostub16β-微管蛋白基因(Ostub16 rice β-tubulin gene)的863bp第一内含子连同10bp部分第二外显子序列能够指导GUS基因在水稻的胚性愈伤组织和烟草叶片中瞬时表达，并在内含子序列内鉴定出转录起始位点(Morello，et al.，2002，Plant J.29：33-44)。番茄的蛋白酶抑制剂II的内含子通过GUS组织染色、荧光定量检测和凝胶阻滞分析表明该内含子具有启动子活性(谢先芝和吴乃虎，2001，科学通报46：934-938)。能自身驱动基因表达的内含子序列中含有转录因子的结合位点，如玉米泛素基因的第一个内含子中存在着一个TATA盒样结构TATAA和一个CAT盒样结构CAAT，水稻Ostub16β-微管蛋白基因第一内含子序列中也存在TATA盒样结构(TATAAAT)。

重金属特异诱导基因PvSR2(Phaseolus vulgaris stress-related 2)是从法国菜豆(Phaseolus vulgaris L.cv.Saxa)中克隆出来的对重金属特异响应的基因，它编码一种与重金属胁迫有关的蛋白质，克隆的cDNA长为690bp(YuxiuZhang，Tuanyao Chai et al.，2001，Plant Sci 161：783-790)。

发明内容

本发明目的在于提供菜豆中重金属诱导的PvSR2基因的444bp的内含子序列，以及该序列在植物基因工程中用于提高目的基因表达的用途，为今后的开发目标基因高表达的转基因产品奠定基础。

本发明所述的菜豆PvSR2基因的内含子，具有附图2所示的核苷酸序列。

本发明人从菜豆中克隆了重金属诱导的PvSR2基因的444bp的内含子，并在研究了该内含子增强GUS基因的表达。当该内含子分别位于PvSR2启动子和CaMV 35S启动子和GUS报告基因的5`非翻译区之间时能分别增强GUS基因表达4.7倍和2倍。而且这种增强效应依赖于内含子在转录单位内的方向。有趣的是该内含子能在烟草的原生质体，烟草的叶盘和拟南芥菜启动GUS基因的瞬时表达，而且序列分析表明具有启动子样的性质，说明该内含子是启动子样的内含子。

因而，在本发明的另一个方面，提供了所述的PvSR2基因的内含子在转基因植物中提高目的基因表达的用途。所述的植物优选为烟草或拟南芥菜。所述的目的基因优选为GUS基因。

在本发明的另一个方面，提供了所述的PvSR2基因的内含子作为控制植物目的基因表达的启动子上的用途。所述的植物优选为烟草或拟南芥菜。所述的目的基因优选为GUS基因。

本发明的内含子来源于菜豆的基因，通过验证能在自身启动子和异源的CaMV35S启动子控制下增强外源GUS基因的表达。植物内含子增强外源基因表达已有报道，如玉米的乙醇脱氢酶基因Adh-S的第一内含子能增强外源的荧光素酶基因(luc)和氯霉素乙酰转移酶基因(cat)的表达(Callis et al.，1987，Genes Dev.1：1183-1200；Luehrsen et al.，1991，Mol Gen Genet 225：81-93)。因此，本发明的内含子同样也可以增强和控制其它异源的目的基因的表达。

附图说明

图1A为PvSR2基因上游区的克隆电泳图

其中1：从PstI酶切的基因组DNA中通过DNA步行获得的PCR产物；M(分子量标准物)：λDNA/HindIII+EcoRI：

图1B为5`-RACE电泳图

其中1：5`-RACE产物；M(分子量标准物)：DL2000；

图2为本发明PvSR2基因的内含子序列图，划线处为内含子两端保守序列；

图3为本发明所构建的载体结构示意图

其中，转录起始位点标记为+1，翻译起始位点标记为ATG，在pBinMRP和pBMRP中，PvSR2基因内含子两端连接PvSR2基因部分外显子序列Ep1和Ep2，5`-UTR代表GUS基因的5`非翻译区序列。在pBI-int/s-GUS、pBI-int/as-GUS和pBIN-GUS，PvSR2基因内含子两端含有PvSR2基因部分外显子序列E1(7bp)和E2(16bp)，其序列已在pBI-int/s-GUS以小写字母给出。

图4A为瞬时表达载体的HindIII/EcoRI双酶切鉴定电泳图；

其中M：λDNA/HindIII 1：pBI-int/s-GUS，2：pBI-int/as-GUS 3：pBIN-GUS4：pBI121；5：pBI101；

图4B为PvSR2基因内含子在CaMV 35S启动子控制下能增强GUS基因瞬时表达其中pBI121为阳性对照，pBI101为阴性对照；

GUS酶活性单位为nmol[对-硝基苯酚]/min/mg蛋白。该实验数值是从三次重复得出：平均值±标准差；

图5A为瞬时表达载体pBinMRP和pBMRP的HindIII/XbaI双酶切鉴定电泳图；

其中M：1kb分子量标记物1：pBinMRP，2：pBMRP

图5B为PvSR2基因内含子在自身启动子控制下能增强GUS基因的瞬时表达；

GUS酶活性单位为nmol[对-硝基苯酚]/min/mg蛋白。该实验数值是从三次重复得出：平均值±标准差。

图6GUS基因经含有pIN-GUS质粒的农杆菌侵染后烟草叶盘和拟南芥菜中的瞬时表达组织染色分析

A为经含有pIN-GUS质粒的农杆菌侵染后烟草叶盘的GUS基因瞬时表达组织染色分析，其中下面的叶盘为野生型对照，上面两个叶盘为经含有pIN-GUS质粒的农杆菌侵染后的烟草叶盘。

B为野生型对照，未经含有pIN-GUS质粒的农杆菌侵染的拟南芥菜组织染色分析；

C和D为经含有pIN-GUS质粒的农杆菌侵染后拟南芥菜的GUS基因瞬时表达组织染色分析。

具体实施方式

实施例1植物材料的培养

无菌烟草苗(Nicotiana tabacum，W38)生长在MS培养基，在16h光照(25℃)/8h黑暗条件下培养。拟南芥菜(Arabidopsis thaliana，Columbiaecotype)种子表面消毒后在附加2％蔗糖的1/2MS中生长。菜豆(Phaseolusvulgaris L.cv.Saxa)种子表面消毒后生长在土盆中，生长条件为光照16h(22℃)/8h黑暗条件下培养。当两片初叶展开时，用0.2％(w/v)HgCl₂.喷叶片。

实施例2菜豆PvSR2基因内含子的克隆

步骤1：DNA步行获得基因上游调控区

菜豆的基因组DNA用CTAB法提取，PvSR2基因的5`上游区的克隆按照宝生物工程公司的In vitro Cloning kit说明书进行。简述如下：分离的菜豆的基因组DNA用PstI、HindIII和EcoRI三种限制性内切酶分别完全消化后，经乙醇沉淀回收后与试剂盒中提供的带有相应酶切位点和引物C1、C2的接头连接。接着用根据PvSR2基因设计的基因特异引物1(gene-specific primerl，GSP1见表1)和接头上的的引物C1进行第一次扩增，接着将扩增产物稀释100倍后进行巢式PCR，所用引物为位于GSP1和C1内侧的引物GSP2(gene-specific primer2，GSP2见表1)和C2。图1A所示为从PstI酶切的基因组DNA中经过巢式PCR获得的2.1kb的特异扩增产物。将特异扩增条带回收后克隆在pMD18T-vector上并测序(上海生物工程公司)，将该质粒命名为pUC-MRP。测序表明从PstI酶切的DNA中经过DNA步行获得了PvSR2基因的上游2188bp的片断，即PvSR2基因上游序列。

步骤2：5`-RACE确定PvSR2 cDNA的5`端上游序列

用RNAgent Total RNA Isolation System(promega)提取喷施0.2％(w/v)HgCl₂6h的叶片的总 RNA。5`-RACE按照SMART<sup>TM</sup> RACE cDNAAmplification kit(Clontech Laboratories)操作说明书进行。简述如下：200ng总RNA用PvSR2 cDNA序列设计的基因特异反转录引物(RGSP，见表1)进行反转录，取2.5μl cDNA进行PCR，所用引物为RGSP和试剂盒提供UPM(universal primer mix)引物。5`-RACE产物电泳如图1B所示，表明获得的长度为327bp的上游cDNA片段。将5`-RACE产物克隆到T-easy vector(Promega)上并测序，测序表明补全了PvSR2 cDNA5`端上游序列，比原来克隆的PvSR2基因的cDNA长度向5`端延伸了119bp。比较步骤1获得的PvSR2基因组序列和步骤2得到的PvSR2基因的全长cDNA序列，发现一个长度为444bp的内含子序列(序列如图2所示)，内含子两端具有植物内含子的剪切保守序列，并且具有很高的AU含量(71.5％)，为典型的双子叶植物基因内含子。

实施例3PvSR2基因内含子增强GUS报告基因的表达的研究

步骤1融合报告基因载体的构建

为了分析内含子增强GUS报告基因的表达，PvSR2基因的含内含子的启动子区和缺失内含子的启动子区分别用位于内含子两侧外显子的反向引物ASP1(位于exon2，5`端含识别位点，序列见表1)或ASP2(位于exon1，5`端含XbaI识别位点，序列见表1)以及共同的正向引物GSP(位于启动子5上游，5`端含HindIII识别位点，序列见表1)扩增得到。PCR产物用HindIII和XbaI消化过夜后，连接到经酶切除掉CaMV35S启动子片断的pBI221(Clontech)载体的HindIII/XbaI位点，经过常规转化和筛选获得重组表达质粒pBinMRP和pBMRP(结构见图3所示)。HindIII和XbaI酶切鉴定表明pBinMRP和pBMRP载体构建正确(图5A)。

为了鉴定内含子在异源启动子CaMV35S控制下对GUS报告基因的表达的影响，内含子以正向或反向插入到CaMV35S启动子和GUS报告基因的5`端非翻译区之间，或取代CaMV35S启动子直接连到GUS报告基因的5`端非翻译区之前构建一系列载体。构建过程如下：用正向系列引物(intron forwardprimers，IFP；序列见表1，由7bp上游外显子1和13bp内含子序列组成)和反向系列(intron reverse primers，IRF。序列见表1，由16bp下游外显子2和4bp内含子序列组成)配对即IFP(+)/IRP(+)和IFP(-)/IRP(-)扩增相应片断，随后克隆到pMD18-Tvector(TaKaRa)并测序。测序正确的IFP(+)RP(+)和IFP(-)/IRP(-)扩增产物克隆来源的重组质粒用XbaI和BamHI酶切后回收目的片段，然后插入到pBI 121(Clontech)的XbaI/BamHI位点之间构建内含子正向插入的载体pBI-in/s-GUS(图3)和反向插入的载体pBI-in/as-GUS(图3)。HindIII和EcoRII酶切鉴定表明pBI-in/s-GUS和pBI-in/as-GUS载体构建正确(图4A)。

                           表1实验所用的引物^a

  名称  序列b  实验目的  IFP(+)^a   IRP(+)^a   IFP(-)^a   IRP(-)^a   IFP^a   GSP   ASP1   ASP2   5`GCTCTAGAACAAATCGTATGTTCGGTCC-3`        XbaI(+71至+90)  5`-CGCGGATCCCTTCTTTTCTCTCATCCTGC-3`        BamHI(+518至+537)  5`-CGCGGATCCACAAATCGTATGTTCGGTCC-3        BamHI (+71至+90)  5`-GCTCTAGACTTCTrTTCTCTCATCCTGC-3`       XbaI(+518至+537)  5`-CCCAAGCTTACAAATCGTATGTTCGGTCC-3        HindIII(+71至+90)  5`-CCCAAGCTTCTGCAGACAT CGTTTTGTATT-3`        HindIII(-1623至-1603)  5`-GCTCTAGACTTGAGTTCTTGCTCTTCTTT-3       XbaI  (+531至+551)  5`-GCTCTAGA TGATGGAACTGTGAAGATTGT-3`       XbaJ(+28至+48)         融合报告基因载体的构建          GSP1   GSP2   5`-CTCCACTGTGTTAACGCCGGGCTTC-3`         (+641至+665)  5`-GTTCCTTGGCGTAAGAGTAGAGGATGC-3`         (+601至+627)   基因组DNA步行    RGSP  5`-AGATGGAACCTGTCGTACACCGGA-3`         (+688至+712)  5`-RACE

^a：‘F’和‘R’分别代表正向和和反向引物；‘+’和‘-’分别代表获得内含子以正向和反向插入到GUS基因的5非翻译区。

^b：以PvSR2基因转录起始位点+1来标定引物所在的位置。下标线处为限制性内切酶的识别位点。

步骤2：烟草原生质体的制备和PEG介导转化

烟草的原生质体从三周的无菌苗的叶片中分离制备，20μg的pBI-int/s-GUS、pBI-int/as-GUS、pBIN-GUS、pBI121、pBI101、pBMRP-in-GUS和pBMRP-GUS按照Negrutiu等1987年的PEG介导的方法(Negrutiu et al.1987，Plant Mol.Biol.8：363-373)分别转化烟草原生质体。转化的烟草原生质体用改良的MS液体培养基(含30g/l蔗糖，72.8g/l甘露醇，2mg/l NAA，0.5mg/6-BA)培养。GUS基因前无任何启动子的质粒pBI101作为负对照和5`端有CaMV 35S启动子的质粒pBI121作为正对照。瞬时表达分析在转化24h后进行。

步骤3GUS酶活性分析

100g离心1min收集转化培养后的原生质体细胞，然后用200μl GUS提取缓冲液(10mM EDTA，0.1％Triton X-100，0.1％SLS和10mmol/Lβ-巯基乙醇)重悬原生质体沉淀，加少许灭菌石英砂，在蜗旋震荡器上震荡破碎细胞。冰上放置10min，然后10000g离心5min，回收含GUS酶的粗提液，冰上备用。提前制备Sephadex G-25层析柱，使用前用新鲜配制的GUS提取缓冲液平衡柱子10min，而后1000g离心10min弃去流出液，将GUS酶的粗提液加到柱子顶端，然后置冰上，直到不含叶绿素的GUS酶粗提液流出，若还有叶绿素存在则重新过柱。蛋白浓度测定用Bradford法。GUS酶活性用Jefferson描述的分光光度法(Jefferson et al.1987，Plant Mol Biol Rep 5：387-405)，反应底物用对-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷酸(PNPG)(sigma公司产品)。测量仪器用SmartSpec^TM 3000分光光度计(Bio-Rad)。GUS酶活用nmol[对-硝基苯酚]/min/mg蛋白表示。

步骤4：分析数据

内含子正向插入到CaMV35S启动子和GUS基因之间时(质粒pBI-int/s-GUS)，和对照质粒pBI121相比能提高GUS基因表达4.7倍，而反向插入到CaMV35S启动子和GUS基因之间时(质粒pBI-int/as-GUS)则失去增强能力，仅相当于CaMV35S启动子活性的50％(图4B)。当内含子在自身启动子(PvSR2启动子)控制之下(质粒pBinMRP)，和没有内含子的PvSR2启动子相比(质粒pBMRP)，可以提高GUS基因表达2.5倍(图5B)

实施例4内含子在烟草原生质体中具有启动子活性

步骤1内含子-GUS融合表达载体的构建

用IFP/IRP(-)(序列见表1，具体组成参见实施例3步骤1)扩增相应内含子片断，随后克隆到pMD18-T vector(TaKaRa)并测序。测序正确的IFP/IRP(-)扩增产物克隆来源的重组质粒质粒用HindIII和XbaI酶切后回收目的片段，然后插入到pBI 121(Clontech)的位点HindIII和XbaI之间构建内含子取代CaMV35S启动子的载体pBIN-GUS(图3)。HindIII和EcoRII酶切鉴定表明pBIIN-GUS载体构建正确(图4A)。

步骤2原生质体制备和PEG介导转化同实施例3。

步骤3GUS酶活性的测定实施例3。

步骤4数据分析表明

GUS基因5`端仅含有内含子的质粒pBIN-GUS在烟草原生质体中的GUS基因的瞬时表达活性相当于GUS基因5`端含有CaMV 35S启动子的pBI121质粒GUS基因瞬时表达活性的70％(图4B)。

实施例5内含子驱动GUS基因在烟草叶盘和拟南芥菜中瞬时表达的组织化学鉴定

步骤1为了验证内含子是否能启动GUS基因的瞬时表达，将pBIN-GUS用冻融法导入到农杆菌EHA105中，然后浸染烟草叶盘或整株拟南芥菜，共培养36h后检测GUS活性。

步骤2：组织化学鉴定GUS酶活性

GUS组织化学染色用Jefferson(1987)的染色法(Jefferson et al.，1987，EMBO J.；6：3901-3907)，底物用X-gluc。结果在转染后的烟草叶盘和拟南芥菜中出现了强烈的GUS染色斑，而在未受感染的野生型烟草叶盘和拟南芥菜中没有出现明显的染色斑，表明内含子能指导GUS基因强烈表达，(参见图6)。