利用分子标记快速培育“三系”杂交稻恢复系的方法

摘要

本发明公开了利用分子标记快速培育“三系”杂交稻恢复系的方法，包括以下步骤：1)以待改良的亲本为母本和另一亲本为父本，进行常规有性杂交，并获得F2代分离群体；2)利用分子标记技术，选用特定的恢复分子标记，进行辅助选育；3)选取分子标记反应为阳性的单株，并收种；4)分别种植所选株系；待成熟时，选取相对综合性状好的单株，编号收种；将收种后的单株留下20厘米稻桩，略施氮肥以保持湿润；待再生苗出现时，重复步骤2)进行分子标记检测，确定阳性株系，保留对应单株的种子；5)分别种植上述保留株系，选取综合性状稳定、优良的株系，即为带有恢复基因的恢复系。利用本发明方法，能快速培育“三系”杂交稻恢复系。

说明书

技术领域

本发明涉及一种杂交稻育种的方法，特别是一种快速培育“三系”杂交稻恢复系的方法。

背景技术

普通“三系”杂交稻恢复系的培育中首要的问题就是要确保恢复基因的存在，否则育成的恢复系就会因育性恢复不佳而失败。常用的方法只有在改良的F5～F6代群体中选择单株进行反复测交，才能初步确定恢复系的恢复性。这样的方法有诸多的缺点：其一、是育种时间长，工作量巨大，选择效率极低，收效甚微；其二、是由于复基因的恢复性常常受到环境因子的干扰影响，年度之间，甚至年度内由于抽穗时间的前后差异都将导致恢复性评价不准确，所以育种家不得不通过“初测”、“复测”、“再测”等多次重复来评价恢复株系的恢复性，即便如此也很难确保它的准确性，可见该项工作的繁琐和难度。

专家学者一致认为分子标记方法是实现作物快速、高效育种的手段。它不受环境因素变化的影响，结果可靠，其技术的核心是获得与育种目标性状紧密连锁的分子标记，通过PCR技术实现其辅助育种的目标。就水稻作物而言，现已获得了不少与质量性状紧密连锁的分子标记，并得到了广泛应用。在杂交水稻方面，通过许多努力也获得了一些与水稻恢复基因相关的分子标记，然而这些分子标记有的与恢复基因连锁不够紧密，有的只是针对于某个恢复系来源的恢复基因，所以缺乏代表性，很难有应用价值。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种与“三系”杂交稻的恢复系性状密切连锁的分子标记和快速培育“三系”杂交稻不育系的方法。

本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种利用分子标记快速培育“三系”杂交稻恢复系的方法，包括以下步骤：

1)、以待改良的亲本为母本和另一亲本为父本，进行常规有性杂交，并将杂种一代自交一次，获得F₂代分离群体，并进行种植；

2)、利用分子标记技术，以序列1：5’ATTTCTACGGCGTCCAATGA 3’和序列2：5’CTTGTAGGAAACCTCAAGATATTG 3’为特定的恢复分子标记，对上述植株在苗期实施分子标记辅助选育；

3)、选取分子标记反应为阳性的单株，待此单株成熟时，选取接近育种目标的单株类型，每个类型选出2～3个相对综合性状好的单株，收种；

4)、分别种植所选株系，每个株系各种植12～18株；待成熟时，选取相对综合性状好的10～20单株，编号收种；将收种后的单株留下20厘米稻桩，略施氮肥以保持湿润；待再生苗出现时，重复步骤2)进行分子标记检测，确定阳性株系，保留对应单株的种子；

5)、分别种植上述保留的株系，每株系种植8～18株，选取综合性状稳定、优良的株系，即为带有恢复基因的恢复系。

作为本发明的利用分子标记快速培育“三系”杂交稻恢复系的方法的一种改进，步骤2)具体为：植株的基因组DNA的提取；以序列1和序列2所述的核苷酸分子为引物，对上述基因组DNA进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行凝胶电泳，凡呈现DNA条带的样品记录即为阳性样品。

本发明的利用分子标记快速培育“三系”杂交稻恢复系的方法，在杂交后的第一个分离世代F₂开始，就对具有恢复能力的单株实施选择，以排除半恢或完全不恢的单株，提高效率。

本发明的利用分子标记快速培育“三系”杂交稻恢复系的方法，是一种利用特定的分子标记、配套常规PCR技术和常规育种技术所得的方法。

本发明的步骤2)是利用特定分子标记和常规分子标记方法，在苗期实施分子标记。其具体步骤如下：

DNA样品制备：

在F2苗期进行植株编号，分别取幼叶0.2～0.4克，加入DNA提取液300～400μl，研磨成匀浆，再加入300～400μl氯仿(氯仿∶异戊醇＝24∶1或23∶2)混匀；转入1.5毫升的离心管中，10000～12000转/分离心10～15分钟后，取上清液，加入2/3体积的异丙醇；再次10000～12000转/分离心10～15分钟，去掉上清液，用70％乙醇清洗沉淀物一次，让其自然干燥后，加入300～500μl双蒸水、溶解，待用。

PCR反应：

将上述DNA样品5.0μl与15.0μl PCR反应液(2.0μl 10x缓冲液，1.6μl25mM dNTP，2.0μl 25mM MgCl₂，0.1～0.3μl特定引物1(序列：5’ATTTCTACGGCGTCCAATGA 3’)，0.1～0.3μl特定引物2(序列：5’CTTGTAGGAAACCTCAAGATATTG 3’)，0.1～0.2μl 5U/μlTaq DNA聚合酶，双蒸水补足至15μl)混合，进行PCR反应：第一步94℃预变性三分钟；第二步94℃45秒，59℃60秒，72℃80秒，并依次循环32～36次；第三步72℃延伸5～10分钟，结束反应。

凝胶电泳：

配制0.8～1.2％葡聚糖凝胶，将20～25μl PCR反应后的样品放入凝胶孔中，5～7伏特/厘米的电压进行稳压电泳50分钟；取出凝胶，放入1.0～3.0μg/ml溴化乙锭溶液中，染色10～15分钟；放入254nm紫外灯下，记录样品DNA条带。

本发明的一种利用分子标记快速培育“三系”杂交稻恢复系的方法，具有如下优点：1)、本发明方法最重要的有点在于，它能有效地在第一个分离世代将含恢复基因的恢复系单株鉴别，并保留于育种株系中，排除不含恢复基因的株系，保证群体的有效性，常规方法是根本不可及的。2)、使用本发明方法能显著减少各世代群体，成倍提高提高育种效率；3)、本发明技术在一定程度上还能区分杂合子和纯合子单株，从而缩短恢复系的改良世代，加快育种速度，减少育种的盲目性。

具体实施方式

实施例1、一种利用分子标记快速培育“三系”杂交稻恢复系的方法，依次进行以下步骤：

1、杂交：

在对“明恢63”恢复系的改良过程中，将“明恢63”为母本与另一个农艺性状优良的亲本“9311”(不含恢复基因)杂交，将其F2种植100个单株。

2、分子标记：

1)、DNA样品制备：

在F2苗期进行植株编号，分别取幼叶0.3克，加入DNA提取液300μl，研磨成匀浆，再加入400μl氯仿(氯仿∶异戊醇＝24∶1)混匀；转入1.5毫升的离心管中，12000转/分离心15分钟后，取上清液，加入2/3体积的异丙醇；再次12000转/分离心15分钟，去掉上清液，用70％乙醇清洗沉淀物一次，让其自然干燥后，加入400μl双蒸水、溶解，待用。

2)、PCR反应：

将上述DNA样品5.0μl与15.0μl PCR反应液(2.0μl 10x缓冲液，1.6μl25mM dNTP，2.0μl 25mM MgCl₂，0.3μl特定引物1(序列：5’ATTTCTACGGCGTCCAATGA 3’)，0.3μl特定引物2(序列：5’CTTGTAGGAAACCTCAAGATATTG 3’)，0.2μl 5U/μlTaq DNA聚合酶，8.6μl双蒸水)混合，进行PCR反应：第一步94℃预变性三分钟；第二步94℃45秒，59℃60秒，72℃80秒，并依次循环36次；第三步72℃延伸10分钟，结束反应。

3)、凝胶电泳：

配制0.8％葡聚糖凝胶，将20μl PCR反应后的样品放入凝胶孔中，6伏特/厘米的电压进行稳压电泳50分钟；取出凝胶，放入1.0μg/ml溴化乙锭溶液中，染色10分钟；放入254nm紫外灯下，记录样品DNA条带；结果：有42份样品显现阴性，58份样品显现阳性。

3、种植选择：

将42份阴性样品对应的植株去除，保留58份阳性样品对应的植株；待此植株成熟时，选取接近育种目标的单株类型，每个类型选出两个相对综合性状好的单株，共收种6个单株。

4、继续选择：

将收种的6个单株，各种植18株，经过综合性状的田间选择，结果获得16株，及时收种、编号，保留20cm高的稻桩。略施氮肥以保持湿润；待再生苗出现时，并依次重复步骤2的DNA样品制备、PCR反应和凝胶电泳组成的分子选育步骤，确定了11个阳性株系，保留阳性单株的种子。同时，留下一株PCR反应阴性的植株作为对照。

5、自交和测交：

种植保留的11个株系和一个对照株系，每个株系种植8株。在抽穗时，再次选测综合性状好的10单株和两个对照株分别与珍汕97A和II-32A不育系杂交，获得杂种一代。经检测杂种一代的恢复性，结果显示分子标记改良的10个单株的20个杂交后代的平均结实率88.1％，而对照只有46％。

实施例2、一种利用分子标记快速培育“三系”杂交稻恢复系的方法，依次进行以下步骤：

1、杂交：

在对“明恢63”恢复系的改良过程中，将“明恢63”为母本与另一个农艺性状优良的亲本“多系一号”(半恢复性)杂交，将其F2种植100个单株。

2、分子标记：

1)、DNA样品制备：

在F2苗期进行植株编号，分别取幼叶0.2克，加入DNA提取液300μl，研磨成匀浆，再加入400μl氯仿(氯仿∶异戊醇＝24∶1)混匀；转入1.5毫升离心管中，10000转/分离心15分钟后，取上清液，加入2/3体积的异丙醇；再次10000转/分离心15分钟，去掉上清液，用70％乙醇清洗沉淀物一次，让其自然干燥后，加入300μl双蒸水、溶解，待用；

2)、PCR反应：

将上述DNA样品5.0μl与15.0μl PCR反应液(2.0μl 10x缓冲液，1.6μl25mM dNTP，2.0μl 25mM MgCl₂，0.2μl特定引物1(序列：5’ATTTCTACGGCGTCCAATGA 3’)，0.2μl特定引物2(序列：5’CTTGTAGGAAACCTCAAGATATTG 3’)，0.3μl 5U/μlTaq DNA聚合酶，8.7μl双蒸水)混合，进行PCR反应：第一步94℃预变性三分钟；第二步94℃45秒，59℃60秒，72℃80秒，并依次循环36次；第三步72℃延伸5分钟，结束反应。

3)、凝胶电泳：

配制1.0％葡聚糖凝胶，将20μl PCR反应后的样品放入凝胶孔中，7伏特/厘米的电压进行稳压电泳40分钟；取出凝胶，放入1.0μg/ml溴化乙锭溶液中，染色10分钟；放入254nm紫外灯下，记录样品DNA条带；其中有33份样品显现阴性，67份样品显现阳性。

3、种植选择：

将33份阴性样品对应的植株去除，保留67份阳性样品对应的植株；待种子成熟时，选取接近育种目标的单株类型，每个类型选出两个相对综合性状好的单株，共收种8个单株。

4、继续选择：

将收种的8个单株，各种植12株，经过综合性状的田间选择，结果获得15株，及时收种、编号，保留20cm高的稻桩。略施氮肥以保持湿润；待再生苗出现时，并依次重复步骤2的DNA样品制备、PCR反应和凝胶电泳组成的分子选育步骤，确定了11个阳性株系，保留阳性单株的种子。同时，留下一株PCR反应阴性的植株作为对照。

5、自交和测交：

种植保留的11个株系和一个对照株系，每个株系种植8株。在抽穗时，再次选测综合性状好的10单株和两个对照株分别与珍汕97A和II-32A不育系杂交，获得杂种一代。经检测杂种一代的恢复性，结果显示分子标记改良的10个单株的20个杂交后代的平均结实率89.71％，而对照只有63.4％。

对照例：

用普通“三系”杂交稻恢复系的选育方法，在相同群体条件下，几乎不可能获得高恢复力的恢复系。我们的对照结果显示：用“9311”(无恢复性)改良“明恢63”时，相同群体后代只获得结实率(恢复度)46％；用“多系一号”(半恢复性)改良“明恢63”时，相同群体后代获得结实率(恢复度)63.4％。

以上实验证明：使用本发明的技术能达到快速培育“三系”杂交稻恢复系的目的，而现有方法则不行。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

                  序列表

SEQ ID NO：1

atttctacgg  cgtccaatga            20

SEQ ID NO：2

cttgtaggaa  acctcaagat  attg      24