抗人CD154单克隆抗体及其应用

摘要

本发明涉及抗人CD154单克隆抗体1B1和4F1，其制备方法以及基于这些单克隆抗体配对制备的可溶性人CD154酶联检测试剂盒。本发明进一步涉及使用所说的试剂盒定性和定量检测人生物学样品中存在的可溶性人CD154，借以诊断自身免疫性疾病和鉴定血小板活化程度。

说明书

发明的领域

本发明涉及抗人CD154单克隆抗体1B1和4F1，其制备方法以及基于这些单克隆抗体配对制备的可溶性人CD154酶联检测试剂盒。本发明进一步涉及使用所说的试剂盒定性和定量检测人生物学样品中存在的可溶性人CD154，借以诊断自身免疫性疾病和鉴定血小板活化程度。

发明的背景

在特异性免疫应答中，T细胞的活化需要双信号。当T细胞表面TCR/CD3识别抗原递呈细胞表达的MHC-抗原肽复合物并与之发生特异性结合时，即产生T细胞活化的第一信号。第二信号则由多对共刺激分子的相互作用产生。作为主要的共刺激分子，CD40-CD154信号在免疫应答中的作用越来越受到关注。

CD154(CD40L、gp39、TRAP-1)是分子量约33kDa的II型跨膜糖蛋白，为肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员并主要在活化的CD4⁺T细胞和活化的血小板表面上表达。此外，Th0、Th1、Th2、CD8⁺T、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞、上皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞也能表达CD154。CD154的表达受到严格调控，其特征是瞬时性。业已表明，CD154有膜型和可溶性CD154(sCD154)两种存在形式。它们均能与CD40特异性结合，但sCD154因结构不稳定而易于被降解。其受体CD40分子属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，可表达于树突状细胞、单核巨噬细胞、B细胞、血管内皮细胞、肌纤维细胞及某些肿瘤细胞表面。

CD40-CD154信号传导在不同细胞可产生截然不同的效应，可以是导致细胞增殖或分化的正性调节，也可以是导致细胞生长抑制和/或凋亡的负性调节。研究表明，CD40-CD154信号途径参与调节B细胞的发育、增殖和分化、浆细胞的形成、抗体合成、分泌和类型转换、记忆性B细胞的形成、生发中心的形成和维持、树突状细胞的分化与成熟、T淋巴细胞的活化和增殖、记忆性T细胞的形成、内皮细胞粘附分子的改变、炎症因子的释放、白细胞在炎症部位的聚集等多种细胞或体液免疫反应。因此，CD40-CD154分子结合对倍受人们的关注。

近年来，有关可溶性CD154的功能活性及其可能的临床应用研究不断深入。业已证实，在炎症反应中，血小板在活化的数分钟内即高水平表达CD154分子。该分子与炎症部位的血管内皮细胞、巨噬细胞表面的CD40分子相互作用，介导血管内皮细胞、巨噬细胞的炎症反应。CD40-CD154相互作用的数分钟至1小时内，膜型CD154分子通过蛋白质水解作用形成sCD154。此外，某些血小板活化因子如肾上腺素、凝血酶活化的血小板亦可表达CD154分子并释放sCD154(Viallard JF，et al.Blood.2002；99：2612)。血清sCD154水平与血小板数量及血小板的活化程度密切相关，例如原发性血小板增多症和动脉粥样硬化患者的血清sCD154水平常常明显高于正常人。某些自身免疫疾病如系统性红斑狼疮患者的血清sCD154水平异常升高。这种现象可能是由于活化的CD4⁺T细胞表达的膜型CD154被水解后形成sCD154所至。

鉴于CD40-CD154相互作用和共刺激途径在免疫系统中重要作用，人们试图通过阻断CD40-CD154相互作用所产生的信号，为各种自身免疫病、过敏反应、炎症甚至肿瘤的治疗提供一类新的生物制剂。另一方面，也可望通过对可溶性CD154分子的生物学特性及其实际应用的研究，为血小板功能相关性疾病以及自身免疫性疾病的诊断和治疗提供实验室依据。

发明目的

本发明的一个目的是提供选自1B1和4F1的抗人CD154单克隆抗体。

根据本发明的优选实施方案，如上限定的抗人CD154单克隆抗体1B1和4F1是抗可溶性人CD154单克隆抗体，并且是分别由保藏编号为CGMCC No.1162和CGMCC No.1163的杂交瘤细胞产生并分泌的。

本发明的另一个目的是提供制备如上限定的抗人CD154单克隆抗体的方法，该方法包括：

1.用预制备的高表达人CD154分子的转基因细胞作为免疫原免疫动物；

2.分离被免疫动物的脾淋巴细胞并在适于生产杂交瘤细胞的条件下与适当的骨髓瘤细胞融合；

3.筛选并培养如上得到的杂交瘤细胞；

4.从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化所需的单克隆抗体。

本发明的再一个目的是提供基于本发明单克隆抗体的可溶性CD154检测试剂盒及其在血小板功能鉴定和自身免疫疾病诊断中的组合应用。

附图简要说明

图1显示以间接免疫荧光法流式细胞术分析抗人CD154单克隆抗体1B1和4F1对L/CD154分子的识别。其中灰色峰为阴性对照(鼠纤维母细胞)，一抗为小鼠IgG，二抗为荧光素FITC标记的羊抗鼠IgG。透明峰显示L/CD154与抗人CD154单克隆抗体反应的结果，其中第一抗体分别是商品化抗人CD154单克隆抗体TRAP-1(阳性对照)及我们制备的2株抗人CD154单克隆抗体1B1和4F1，第二抗体是荧光素FITC标记的羊抗鼠IgG。

图2显示1B1和4F1杂交瘤细胞株染色体的核型分析(×1000倍)。

图3显示Western blot免疫印迹结果。抗人CD154单克隆抗体1B1和4F1能特异性识别分子量约为18kDa的重组人sCD154蛋白。

图4显示采用流式细胞术完成的抗人CD154单克隆抗体1B1和4F1识别抗原位点的竞争性抑制实验。A为所选定的待测L/CD154细胞；B为阴性对照(小鼠IgG-PE)；C为阳性对照(CD154-PE，TRAP-1)；D显示L/CD154细胞与1B1反应后加入CD154-PE；E显示L/CD154细胞与4F1反应后加入CD154-PE。

图5显示sCD154标准工作曲线。以1B1为包被抗体，4F1为检测抗体，然后加入不同浓度的标准品rhCD154重组蛋白作为检测抗原，绘制标准工作曲线。X轴代表抗原剂量，Y轴代表光密度OD值。

图6显示健康供血员血浆和血清sCD154水平。X轴代表标本种类，Y轴代表sCD154浓度。

图7显示健康献血员、再生障碍性贫血(AA)和原发性血小板减少性紫癜(ITP)患者血清及血浆sCD154含量的对比分析。

图8显示健康献血员和类风湿性关节炎(RA)患者血清及血浆sCD154含量的对比分析。

发明的具体内容

本发明涉及肿瘤坏死因子超家族成员的结合蛋白质或多肽，更具体地说，本发明涉及抗人CD154单克隆抗体1B1和4F1的制备方法、基于所说的单克隆抗体的可溶性CD154(sCD154)检测试剂盒，以及所说的单克隆抗体在自身免疫性疾病诊断和血小板功能鉴定中的组合应用。

本说明书中所说的“CD154”是指抗原活化的CD4⁺T细胞表面上表达的蛋白质；CD154是某些哺乳动物细胞上表达的可与CD40受体特异结合的蛋白质。

术语“CD154”包括完整的CD154、可溶性CD154及包括CD154之功能活性部分的融合蛋白。术语“抗CD154抗体”可以是CD154特异性单克隆或多克隆抗体或它们的免疫学活性部分。本发明中，优选的是单克隆抗体，特别是小鼠抗人CD154单克隆抗体。

可以按照本领域已知的常规方法制备本发明的抗人CD154单克隆抗体1B1和4F1(参见Kohler and Milrtein，Nature 256：495-96，1975；Harlow and Lane，Aatibodies，A Laboratory，Cold Spring Harbor Laboritory，1988)。必要时，也可以按照美国专利5,585,089中所述的方法制备相应的人源化形式的抗CD154单克隆抗体。

根据本发明的优选实施方案，最好使用被携带人CD154基因的表达载体转化的并可在适当的培养条件下高效表达人CD154多肽的重组体细胞作为制备本发明单克隆抗体的免疫原。

因此，为了制备本发明的抗人CD154单克隆抗体，首先构建高表达人CD154的转基因细胞(L/CD154)。高表达人CD154分子的转基因细胞具有较强的免疫原性，并且所表达的抗原分子的空间构型能以自然状态暴露于细胞膜表面，从而可更有效地激发机体的免疫反应。另外，由于L细胞是鼠源性的纤维母细胞，细胞表面其他分子具有相对较弱的抗原性，因此用该细胞作为免疫原将会减少非特异性抗体的产生，使单克隆抗体的筛选更为方便并大大提高阳性检出率。

为了制备L/CD154细胞，可以按照本领域技术人员熟知的DNA操作技术(例如参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbour，1989)进行基因的分离、核苷酸片段的切割与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和扩大培养等操作。例如，可以首先使用RT-PCR技术从活化的T细胞中扩增出人CD154基因。将CD154基因装入逆转录载体pEGZ-Term，得到重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD154。然后，使用重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD154与辅助病毒pHIT456和pHIT60一起共转染293T细胞。48小时后，收集含病毒颗粒的293T细胞培养物上清，以其感染L细胞，连续感染3天。最后，用含Zeocin的选择培养基筛选并培养抗性细胞。待抗性单克隆生长至足够大，挑取单克隆集落进行扩大培养。按上述方法获得的转基因细胞的CD154表达率高达98％以上。

本发明的杂交瘤细胞株分别被命名为SI CD 154.1(1B1)和SI CD 154.2(4F1)，并已按照布达佩斯条约和中国专利法实施细则第25条的规定，于2004年6月2日将这些杂交瘤细胞系样品保藏在中国北京中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号分别为CGMCC No.1162和CGMCC No.1163。

可以按照本领域已知的常规方法(Kohler and Milstein，Nature 265：495-497，1975)制备本发明的抗人CD154单克隆抗体1B1和4F1。简单地说，用转基因细胞L/CD154免疫Balb/C小鼠。当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，分离动物的脾细胞并制备单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞。例如，可以将脾细胞悬液加到CD154抗原蛋白质包被的平板或小孔内，表达CD154多肽特异性免疫球蛋白的B细胞即结合到平板上，而不能被其余的悬液洗掉。收集所得到的B细胞或所有解离的脾细胞，在适当的融合剂如聚乙二醇的诱导下与骨髓瘤融合以形成杂交瘤，并在选择性培养基如HAT培养基中培养以筛选融合的杂交瘤细胞。用流式细胞术、Western印迹法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。于体外(例如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(作为小鼠腹水)培养所选择的分泌抗人CD154抗体的杂交瘤，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化所需的抗体。

流式细胞仪分析结果显示，本发明提供的抗人CD154单克隆抗体1B1和4F1均能识别L/CD154细胞表面上表达的CD154分子。竞争抑制试验结果进一步显示，本发明的抗人CD154单克隆抗体1B1和4F1识别抗原分子上不同的结合位点。

因此，可以利用本发明的1B1和4F1抗体制备用于检测可溶性人CD154蛋白的试剂盒。可使用基于本发明单克隆抗体制备的试剂盒检测细胞或组织、正常人或病人血液或其它体液样品中CD154分子的存在及其含量。所说的试剂盒除包括本发明的抗人CD154单克隆抗体外，还可包括微量测定板、包被抗体1B1或4F1、阳性和阴性对照标准品、已知浓度的可溶性CD154抗原、抗原或抗体样品稀释液或包被液、酶或荧光素或放射性核素标记的1B1或4F1抗体、酶或荧光素或放射性核素标记的第二抗体，以及酶的相应底物和洗液等。

由于许多疾病特别是免疫系统疾病条件下均存在细胞膜型或可溶性的CD154蛋白水平的异常改变，所以有可能使用本发明的试剂盒作为某些免疫系统疾病特别是自身免疫性疾病的实验室诊断手段。某些自身免疫疾病如系统性红斑狼疮患者的血清sCD154水平异常升高，推测可能是由于活化的CD4⁺T细胞表面表达的膜型CD154被水解而形成sCD154所至。我们在使用本发明的试剂盒检测类风湿性关节炎患者血清sCD154水平的实践中，令人惊奇地发现，类风湿性关节炎患者的血清sCD154水平显著高于健康成年人(数据未示出)。因此我们推测，有可能使用基于本发明单克隆抗体的试剂盒，通过检测患者血清或血浆中的sCD154水平为临床诊断类风湿性关节炎等自身免疫性疾病提供实验室参考数据。

另一方面，已知某些血小板活化剂如肾上腺素、凝血酶活化的血小板均表达CD154分子并释放出sCD154，而且血清sCD154水平与血小板数量和血小板的活化程度成正相关。例如，原发性血小板增多症和动脉粥样硬化病人的血清sCD154水平明显升高，并提示这些病人的血小板分化和活化均不完善。因此，有可能应用本发明的单克隆抗体检测病人外周血中的sCD154水平，借以为诊断这些疾病和判断预后提供参考数据。

众所周知，在进行成分输血特别是血小板输注的医疗实践中，待输入的血小板细胞的活化程度将直接影响治疗的效果。然而，目前尚没有建立一种简便快速地检测血小板细胞活化程度的方法。

在使用本发明的单克隆抗体进行大面积人群sCD154水平检测中，本发明人首次发现人血清和血浆的可溶性CD154水平存在明显差异，并证明血小板活化释放的sCD154是血清sCD154的主要来源。因此可以认为，血清和血浆的可溶性CD154水平的差异在很大程度上反映了同一个体的外周血血小板细胞的平均数量和活化状态。一般说来，血清和血浆可溶性CD154水平的相对值越高，前者相对于后者的比值越大，说明同一个体的活化的外周血血小板数目越多而且细胞活化程度也越高。

我们的初步研究显示，在使用本发明的抗体检测的情况下，血小板活化程度高的个体的血清中可溶性CD154水平可以比血浆中可溶性CD154水平高2-4倍。本发明人基于上述发现，使用我们制备的单克隆抗体，通过检测个体的血清可溶性CD154水平并与同一个体的血浆可溶性CD154水平相比较，即可间接判断该个体的血小板活化程度，从而可以为选择性地使用血小板，提高或改善成分输血特别是血小板输注的效果提供实验室参考数据(参见实施例3)。

以下借助非限制性实施例举例详细描述本发明。本领域技术人员可以在不背离本发明的基本精神和原则前提下，改变或改动本说明书中描述的某些技术内容或技术环节。但人们可以理解到，这些平行的改变或改动均将包括在本发明的待批权利要求范围之内。

实施例1：抗人CD154单克隆抗体的制备

本实施例描述本发明的抗人CD154单克隆抗体1B1和4F1的制备。

1.转基因细胞L/CD154和L/mock的建立

1.1CD154基因的克隆。使用TRIZOL试剂(Gibco，BRL)抽提抗原诱导成熟的DC的总RNA。按照MBI逆转录试剂盒使用说明书推荐的方法，将mRNA逆转录成cDNA。PCR引物为：P15’-GA GCT GAA TTC ATG ATC GAA ACAACC-3’(SEQ ID NO：1)和P25’-GA GCT GGA TCC TCA GAG TTT GAG TAAGCC AAA GG-3’(SEQ ID NO：2)进行PCR扩增(94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃延伸5分钟)。纯化后，在T₄DNA连接酶作用下直接将PCR产物与pMD18-T载体连接过夜。用所得连接产物转化感受态细菌TOP10，并对筛选的阳性克隆进行PCR和酶切鉴定以及DNA测序。结果显示，所获得的cDNA序列与GenBank中注册的人CD154cDNA序列完全一致。

1.2重组逆转录病毒载体的构建。分别用核酸内切酶EcoRI和BamHI消化测序正确的pMD18-T/CD154质粒和逆转录病毒载体pEGZ-Term(现代免疫学，2004，24(2)：99-103)(37℃，4小时)。回收含目的基因的片段，并用连接产物转化感受态细菌。用上述方法鉴定证实后，将所获得的重组逆转录病毒载体定名为pEGZ-Term/CD154。

1.3稳定表达人CD154的L转基因细胞的构建。首先以试剂盒操作手册推荐的脂质体法，用重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD154和辅助病毒pHIT456与pHIT60(现代免疫学，2004，24(2)：99-103)(体积比2∶1∶1)共转染6孔板中60-70％汇合生长成片的293T细胞。48小时后收集含病毒颗粒的293T培养上清，以其感染L细胞。加入polybrene至终浓度为8ng/ml，继续37℃感染6小时。再加入含10％胎牛血清(FCS)的1640培养基(2ml/孔，隔天换液)。重复感染3次后收集细胞，将1∶6稀释的细胞培养物置于含Zeocin(Invitrogen，500μg/ml)的选择培养基中筛选培养2周。待抗性单克隆生长至足够大，挑取单克隆菌落进行扩大培养。同时制备用作阴性对照的转基因细胞L/mock。流式细胞仪检测显示，L/CD154细胞膜上人CD154蛋白的表达率约为97％。

2.抗人CD154单克隆抗体的制备

使用如上得到的高表达CD154分子的转基因细胞(L/CD154)作为免疫原，三次免疫接种Balb/c小鼠(10⁷/500μl/只，每次间隔3周)。末次免疫后第四天，取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞株进行细胞融合(共20块96孔板)。以高表达CD154分子的L/CD154为阳性对照及表达CD154分子的L/mock为阴性对照，用间接免疫荧光法对杂交瘤培养物上清进行初步筛选、蛋白鉴定及Ig亚类鉴定(参见图1)。阳性克隆经3次有限稀释后，克隆的阳性率达到约95％。经复筛及亚克隆后获得稳定地分泌特异性鼠抗人CD154的杂交瘤细胞株，并分别被命名为1B1和4F1。这些杂交瘤细胞经体外持续传代(40代)后，仍能稳定地分泌特异性抗体。对杂交瘤细胞株1B1和4F1的染色体分析显示，这两株杂交瘤细胞的染色体数目分别为96、102(参见图2)。

3.抗人CD154单克隆抗体的生产与特性鉴定

3.1采用本室建立的腹水体内诱生方法生产单克隆抗体。取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，腹腔内注入Pristane(0.5ml/只)。14天后腹腔内接种杂交瘤细胞(1×10⁷/只)，同时腹腔内注射Pristane与福氏不完全佐剂的等体积混合物(0.2ml/只)。10天后收获腹水，并离心取上清于-80℃保存。

3.2腹水型单抗的纯化和定量分析。腹水液经去除纤维蛋白和盐析处理后，以蛋白G亲和柱层析法纯化。收集蛋白峰流出液，对磷酸盐缓冲液(PBS)透析后用751紫外分光光度计测定抗体蛋白浓度为0.8～10mg/ml。间接免疫荧光法分析表明，纯化后单抗的效价为1/1000以上。

3.3Ig亚鉴定。采用试纸快速测定法(Argen公司)，鉴定Ig亚类，结果显示1B1和4F1的重链均为小鼠IgG1型，轻链均为小鼠κ型。

3.4抗体识别抗原位点的竞争性抑制试验。在L/CD154细胞(5×10⁵/管)悬液分别加入CD154单克隆抗体1B1或4F1，4℃孵育45分钟。洗细胞后依次加入PE标记的单克隆抗体(CD154-PE，TRAP-1)，并分别4℃孵育30分钟。再次洗涤后用流式细胞仪分析，同时设阳性和阴性对照。如图4所示，单抗1B1不影响单抗CD154-PE(TRAP-1)与L/CD154细胞上CD154分子的结合，单抗4F1完全阻断单抗CD154-PE(TRAP-1)与L/CD154细胞上CD154分子的结合。由此表明，1B1与4F1识别的CD154分子抗原位点不完全相同。

3.6单抗的Western印迹鉴定。重组人可溶性CD154经12％SDS-PAGE电泳，并电转移(0.65mA/cm²)至硝酸纤维膜上，用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜。翌日加入纯化的抗体室温孵育1小时。用TBST溶液洗去未结合的抗体，加入AP标记的二抗，30分钟。孵育后加入底物显色。1B1和4F1均能与分子量约为18kDa的CD154蛋白特异性结合，形成阳性条带(参见图3)。

实施例2：本发明的sCD154酶联检测试剂盒的制备

A.用于本发明试剂盒的材料和试剂包括：

(1)聚苯乙烯微孔板(8×12，Costar，USA)；

(2)包被液(0.01mol/L、Tris-HCl pH8.9)；

(3)包被抗体：用包被液稀释的单克隆抗体1B1，终浓度为2.0μg/ml；

(4)磷酸盐缓冲液：0.01mol/L PBS、pH7.4；

(5)封闭液和抗体稀释液：含20％胎牛血清和0.01g NaN₃的PBS；

(6)标准抗原：sCD154(Peprotech，USA)的系列稀释液；

(7)检测抗体：碳酸盐缓冲液(CBS，0.01mol/L，pH9.3)稀释的4F1(200μg/ml)经生物素标记(加琥珀酰羟基生物素-二甲基亚砜40μl(1mg/ml))后再用抗体稀释液稀释至工作浓度1μg/ml；

(8)亲和素辣根过氧化物酶：用抗体稀释液稀释至工作浓度1μg/ml；

(9)反应底物：辣根过氧化物酶的反应底物邻苯二胺；

(10)底物缓冲液：柠檬酸缓冲液(0.4mol/L，pH4.8)；

(11)底物反应液：邻苯二胺溶于底物缓冲液(1mg/ml)；

(12)洗涤液：含0.1％Tween-20的0.01mol/LPBS(pH7.4)；

(13)终止液：1.0mol/LH₂SO₄；

B.sCD154标准曲线的绘制

将包被抗体1B1(2.0μg/ml)加于96孔微孔板中(100μl/孔)4℃过夜；然后加封闭液37℃放置2h。洗涤后加人重组sCD154标准品的倍比稀释液(0.4-50ng/ml，100μl/孔)，37℃孵育2h。洗涤5次后加生物素标记的4F1(1μg/ml，100μl/孔)，37℃孵育1h。洗涤后加亲和素辣根过氧化物酶(1μg/ml，100μl/孔)，37℃孵育1h。洗涤5次后加反应底物100μl/孔(1mg/ml)，37℃孵育15min。然后加终止液(50μl/孔)终止酶与底物反应。用酶标检测仪(Biorad，USA)测定OD₄₉₀值。以sCD154的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制sCD154的标准工作曲线。试验结果显示，该检测方法在抗原浓度0.8-50.0ng/ml区间具有良好的线性关系，其灵敏度为0.2ng/ml(如图5所示)。

3.检测方法的稳定性分析

将1B1包被后的酶标检测板置4℃保存0、30、60、90天，重复1.2的步骤，按公式CV＝S/X(S为标准差，X为均值)，分析标准曲线中部分测定点(5.0、10.0、15.0和20.0ng/ml)的变异系数。统计学处理结果显示，试剂盒在放置不同时间后，其离散度(CV％)＜6.9％，检测结果之间无显著性差异(P＞0.05)，证明该检测系统具有较好的稳定性。

4.检测方法的准确性分析

采用加入法在5份已知sCD154浓度的血清标本稀释液中分别加入sCD154的标准品5.00ng。按公式回收率＝(样品检出量+标准品加入量)/总检出量×100％计算回收率。回收率为94.7-104.8％，由此证明该检测方法具有较高的准确度。

实施例3：本发明的sCD154酶联检测试剂盒的应用

A.200例健康成年人血清血浆sCD154水平的测定

采集200名健康成年人(其中男性126例，女性74例，年龄26～47岁)的外周静脉血(苏州大学附属第一医院提供)各2ml，等分置塑料管中。其中一管为自然凝固的血清，另一管为己二胺四乙酸二钾(EDTA-K₂)抗凝血浆。经血球计数仪测定，其血小板计数为104-257×10⁹/L。应用该检测系统测定健康成年人外周血血清和血浆中的sCD154水平。

结果显示，血清sCD154含量为9.56±4.71ng/ml，明显高于同一个体的血浆sCD154的含量(2.98±1.13ng/ml)，两者之间差异显著(P＜0.05)，这种差异反映了外周血血小板的数量和活化状态。EDTA-K₂是血小板活化的强抑制剂，其抗凝的血浆sCD154直接反映体内循环sCD154的基准水平。血清sCD154除了体内循环sCD154外，还包括在外周血自然凝固的过程中活化的血小板释放出的sCD154。由此提示，活化的血小板释放的sCD154是血清sCD154的主要来源(参见图6)。

B.再生障碍性贫血和原发性血小板减少性紫癜患者血清及血浆sCD154含量的测定

标本(苏州大学附属第一医院提供)分别得自20例再生障碍性贫血(AA)患者(其中男性7例，女性13例，年龄8-39岁)和30例原发性血小板减少性紫癜(ITP)患者(其中男性9例，女性21例，年龄17-52岁)。血清和血浆标本采集方法同上，外周血小板计数分别为21-46×109/L、18-39×109/L。AA和ITP为血液系统疾病，外周血血小板减少是其显著特征。实验发现，反映体内循环sCD154基准水平的AA患者血浆sCD154(2.72±0.86ng/ml)、ITP患者血浆sCD154(2.56±0.95ng/ml)与健康成年人血浆sCD154(2.98±1.13ng/ml)三者之间无统计学上的显著性差异(P＞0.05)。AA患者血清sCD154含量为3.61±1.26ng/ml，ITP患者血清sCD154含量是3.25±1.05ng/ml，两者之间虽无显著性差异(P＞0.05)，但均明显低于健康成年人血清sCD154水平(9.56±4.71ng/ml)(参见图7)。此外，AA和ITP患者的血清与血浆sCD154含量相近，并与其外周血较低的血小板数量相关，进一步证明血小板活化释放的sCD154是血清sCD154的主要来源。

C.类风湿性关节炎患者血清及血浆sCD154含量的测定

标本(苏州大学附属第一医院提供)分别得自50例类风湿性关节炎(RA)患者(其中男性18例，女性32例，年龄33-69岁)。血清和血浆标本采集方法同上，外周血小板计数为69-361×10⁹/L。与健康成年人血浆sCD154(2.98±1.13ng/ml)比较，类风湿性关节炎患者具有较高的血浆sCD154基准水平(4.47±2.56ng/ml)，两者之间差异显著(P＜0.05)。而类风湿性关节炎患者的血清sCD154含量(16.46±7.51ng/ml)亦明显高于健康成年人血清sCD154水平(9.56±4.71ng/ml)。由此，我们推测类风湿性关节炎患者较高的循环sCD154基准水平，可能与其外周血及病变组织CD4⁺T细胞的CD154异常表达相关。CD4⁺T细胞表达的CD154通过蛋白质水解作用形成的sCD154可能是导致患者血浆sCD154升高的主要原因(参见图8)。

                        序列表

<110>苏州大学生物技术研究所

<120>抗人CD154单克隆抗体及其应用

<140>

<141>

<160>6

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>1

GAGCTGAATT CATGATCGAA ACAACC

<210>2

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>2

GAGCTGGATC CTCAGAGTTT GAGTAAGCCA AAGG