一种测定再生丝素蛋白水溶液浓度的方法

摘要

本发明涉及一种测定再生丝素蛋白水溶液浓度的方法，在恒定温度下通过阿贝折光仪测定未知浓度的再生丝素蛋白水溶液的折光指数，根据再生丝素蛋白水溶液浓度——折光指数的函数关系能够直接方便地计算出所述再生丝素蛋白水溶液的浓度。再生丝素蛋白水溶液浓度——折光指数的函数关系由以下方法获得：在一定温度下通过将纯化浓缩后的再生丝素蛋白水溶液进行干燥称重，得到浓度值，然后测定此浓度下的折光指数，取不同浓度下的再生丝素蛋白水溶液依此法多次测量，以折光指数为自变量、浓度值为因变量做出上述温度下的折光指数——再生丝素蛋白水溶液浓度的函数关系拟合曲线，得到折光指数与再生丝素蛋白水溶液浓度之间的函数关系式。

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定再生丝素蛋白水溶液浓度的方法，尤其适用于浓度较高的再生丝素蛋白水溶液的浓度测量。

背景技术

蚕丝具有优良的性能，几千年来一直是高档的衣用材料。近几十年来，人们发现其分子结构与生物体具有良好的生物相容性，有望应用于人造肌腱、人造血管、手术缝合线等非纺织领域。为了适应上述非纺织领域内的各种特殊需求，或为了不受气候、地理等自然条件变化的影响，按人类意愿生产不同规格和产量的蚕丝产品，需对蚕丝进行再次成型。另外，在蚕丝的丝织加工过程中产生的下脚废料、回收物弃之不仅可惜，还会造成污染，故也要求对这些废蚕丝进行再生处理。因此，如文献【Gregory H.Altman，FrankDiaz et al.Silk-based biomaterials.Biomaterials，2003，24：401-416】；【Alrman G H，HoranR L，Lu H，Moreau J，Martin I，Richmond J C，Kaplan D L.Silk matrix for tissue engineeredanterior cruciate ligaments.Biomaterials，2002，23：4131-41】；【H J Jin，D L.Kaplan.Mechanism of silk processing in insects and spiders.Nature，2003，424：1057-1061】所述，近年来人们开始热衷于蚕丝蛋白的再次成型尤其是仿生纺丝研究。

在进行蚕丝再生处理时，首先应将已脱胶的蚕丝溶解后进行纯化、浓缩以形成一定浓度的再生丝素蛋白水溶液，然后再进一步制备样品。在这一过程中，准确测定再生丝素蛋白水溶液的浓度就成为不可回避的问题。对于蛋白质浓度的测定，生物化学中有经典的方法，如文献【余冰宾等编，生物化学实验指导.北京：清华大学出版社，2004】中介绍的定氮法、缩醛法、双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法(Bradford法)等，但这些方法适用的蛋白质浓度范围一般小于10mg/ml(约1％wt)。而对于再次成型用的再生丝素蛋白水溶液，其浓度一般较高(如10％以上)，此时溶液浓度的测定并不适合采用上述生化经典分析方法，如文献【WangM，Jin H J，KaplanD L et al.Mechanical Properties of Electrospun Silk Fibers.Macromolecules，2004，37(18)：68566856-6864.】中介绍一般只能采用传统的干燥称重法。但此法所需时间过长，无法快速反映溶液浓缩过程中浓度变化情况，从而易导致所制备溶液的浓度难以精确控制。

本发明以测定好的再生丝素蛋白浓度—溶液折光指数的函数关系为标准，然后通过测定未知浓度的再生丝素蛋白水溶液的折光指数就直接获知其溶液浓度。本法方便、快捷、准确、实用，适用于浓度较高的丝素蛋白水溶液体系的定量分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定再生丝素蛋白水溶液浓度的方法。

本发明所述的测定再生丝素蛋白水溶液浓度的方法，系在恒定温度下通过阿贝折光仪测出未知浓度的再生丝素蛋白水溶液的折光指数，根据上述折光指数和再生丝素蛋白水溶液浓度——折光指数的函数关系方便地计算出所述再生丝素蛋白水溶液的浓度。

上述的再生丝素蛋白水溶液浓度——折光指数的函数关系通过下述技术方案获得：

1.将再生丝素蛋白进行纯化处理，步骤如下：

将剥好的茧层置入煮沸的质量分数为0.02～1％的碳酸钠(或碳酸氢钠、马赛皂、十二烷基硫酸钠)水溶液中，茧层和水溶液的比例为1∶50～1∶150(W/V)，煮30～240分钟，除去表面丝胶，如此重复1～3次，然后用去离子水充分洗净，干燥得到脱胶丝素；将所得丝素在25-60℃下，溶解于8.7～9.5mol/L的溴化锂水溶液(或氯化钙-乙醇-水溶液、溴化锂-乙醇-水溶液，硝酸钙-甲醇-水溶液、硫氰酸锂水溶液)中，得到5％-20％的丝素溶液。将丝素溶液稀释2～6倍后过滤，并置于透析袋里连续透析3-4天以去除盐离子，透析完毕后的丝素稀水溶液经过浓缩处理，制得不同浓度的再生丝素蛋白水溶液。

2.用干燥称重法测定出所述再生丝素蛋白水溶液的浓度，步骤如下：用电子天平称量干净的载玻片重量记为W₁；在载玻片上面滴数滴丝素蛋白溶液，再称其重量得W₂，则溶液的质量为(W₂-W₁)；将上述滴有溶液的载玻片放入100～120℃烘箱中干燥至恒重取出，天平称重记为W₃，则溶液中丝素蛋白的质量为(W₃-W₁)；根据公式C％＝[(W₃-W₁)/(W₂-W₁)]×100％计算得到溶液中丝素蛋白的浓度。

3.在温度恒定条件下，取不同浓度下的纯化后浓缩的再生丝素蛋白水溶液，测定其对应的折光指数，做出上述温度下的再生丝素蛋白水溶液浓度——折光指数的函数关系拟合曲线，得到因变量再生丝素蛋白水溶液浓度与自变量折光指数之间的函数关系式。

改变温度条件，按照前述函数关系式的求取方法，即可得到不同温度下的再生丝素蛋白水溶液浓度——折光指数的函数关系式：y＝a+bx，其中y是重量百分浓度，x是折光指数；所述的截距a＝-640.92929～-647.00516，斜率b＝480.4954～485.38026。确立了恒定温度下的再生丝素蛋白水溶液浓度——折光指数的函数关系式后，对于未知浓度的再生丝素蛋白水溶液，通过测定其在同样温度下的折光指数，根据上述再生丝素蛋白水溶液浓度——折光指数的函数关系式即可方便地计算出所述再生丝素蛋白水溶液的浓度。

附图说明

图1不同温度下丝素蛋白水溶液浓度---折光指数函数关系。

附图中wt％表示重量百分浓度。

具体实施方式

通过以下实施例将有助于理解本发明，但不限于本发明的内容。

实施例1

1.将再生丝素蛋白进行纯化处理

将剥好的茧层置入煮沸的质量分数为0.5％的碳酸钠水溶液中，茧层和水溶液的比例为1∶50(W/V)，煮沸30分钟，除去表面丝胶，如此重复2次，然后用去离子水充分洗净，干燥得到脱胶丝素；将所得丝素在30℃下，溶解于9.3mol/L的溴化锂水溶液中，得到12％的丝素溶液。将丝素溶液稀释5倍后过滤，并置于透析袋里连续透析3天以去除盐离子，直到透析袋外去离子水的电导率基本不变为止。透析完毕后的丝素稀水溶液经过浓缩处理，制得一系列的不同浓度的再生丝素蛋白水溶液。

2.干燥称重法测定丝素蛋白水溶液的浓度

用电子天平称量干净的五个载玻片重量记为W₁；在载玻片上面滴数滴丝素蛋白溶液，再称其重量得W₂，则溶液的质量为(W₂-W₁)；将上述滴有溶液的载玻片放入100～120℃的烘箱中干燥至恒重取出，天平称重记为W₃，则溶液中丝素蛋白的质量为(W₃-W₁)；根据公式C％＝[(W₃-W₁)/(W₂-W₁)]×100％计算取平均值后得到溶液中丝素蛋白的浓度为39.48％。

  W₁  5.0411  5.1031  5.0781  5.0536  5.0453  W₂  5.0673  5.1278  5.106  5.0855  5.0756  W₃  5.0515  5.1128  5.089  5.066  5.0573  W₂-W₁  0.0262  0.0247  0.0279  0.0319  0.0303  W₃-W₁  0.0104  0.0096  0.011  0.0127  0.012  C％  39.69  38.87  39.43  39.81  39.6  平均C％                                 39.48

3.测得再生丝素蛋白水溶液浓度——折光指数的函数关系。

在室温下，利用恒温水浴控制温度为15±1℃、20±1℃、25±1℃和35±1℃，用阿贝折光仪下测定一系列不同浓度的再生丝素蛋白水溶液样品的折光指数，结果见下表。

           表1 不同温度下各种浓度丝素蛋白水溶液的折光指数

  浓度(wt％)                          折光指数  15±1℃  20±1℃  25±1℃  35±1℃  2.02  1.3385  1.3380  1.3377  1.3369  6.26  1.3477  1.3475  1.3474  1.3467  10.18  1.3559  1.3557  1.3553  1.3550  16.92  1.3687  1.3685  1.3685  1.3672  17.13  1.3695  1.3689  1.3685  1.3674  18.75  1.3720  1.3714  1.3709  1.3703  24.23  1.3831  1.3828  1.3823  1.3814  34.40  1.4066  1.4057  1.4045  1.4042  39.48  1.4154  1.4156  1.4159  1.4154  43.80  1.4262  1.4256  1.4255  1.4240

根据所得数据，可计算不同温度下丝素蛋白水溶液浓度---折光指数函数关系曲线(参见图1)。从图1可见，不同温度下对各种浓度的丝素蛋白水溶液所测得的折光指数数据点几乎重叠在一直线上，由此表明：在本发明研究的丝素蛋白浓度范围(2％～45％)内，丝素蛋白水溶液折光指数对温度不太敏感。因此，在较宽的温度范围内，可以直接依据折光指数来获得有关丝素蛋白溶液浓度的信息。

为了方便应用，本发明以折光指数为自变量x、浓度值为因变量y，对表1数据进行了线性拟合，得到拟合方程为y＝a+bx，并计算出了线性相关系数r和标准方差S_d。表2列出了不同温度下的拟合结果。其中y为重量百分浓度。

               表2 不同温度下丝素蛋白水溶液浓度---折光指数关系拟合结果

  温度  截距a  斜率b  线性相关  系数r  标准方差  S_d  拟和方程  15±1℃  -640.92929  480.4954  0.99969  0.40104  y＝-640.92929+480.4954x  20±1℃  -646.76627  484.9106  0.99961  0.44847  y＝-646.76627+484.9106x  25±1℃  -646.28565  484.64578  0.99948  0.51927  y＝-646.28565+484.64578x  35±1℃  -647.00516  485.38026  0.99947  0.52492  y＝-647.00516+485.38026x

4.未知浓度的再生丝素蛋白水溶液的测定

一种未知浓度的再生丝素蛋白水溶液，测定其在20℃下的折光指数为1.3860，根据20℃下的再生丝素蛋白水溶液浓度——折光指数的函数关系式，可计算出所述再生丝素蛋白水溶液的浓度为25.32％。