作为促性激素释放激素受体拮抗剂的嘧啶－2,4－二酮衍生物

摘要

本发明公开了GnRH受体拮抗剂，其具有治疗男性与女性的性激素相关疾病状态的用途。本发明化合物具有以下通式结构(I)，并包括其立体异构体、前药和药物可接受的盐：其中R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R3、R4、R5、R6、R7与X如本发明所定义。本发明还公开了包含与药物可接受的载体组合的本发明化合物的组合物，以及使用该组合物来拮抗个体内的促性腺激素释放激素的方法，该个体需要此拮抗。

说明书

政府利益声明

本发明工作的部分基金是由美国政府提供的，是由国立健康研究所资助的批准号为1-R43-HD38625与2R44-HD38625-02的课题。因此政府对本发明拥有一定的权利。

发明背景

发明领域

总体而言，本发明涉及促性腺激素释放激素(GnRH)受体拮抗剂，以及治疗病症的方法，该方法通过将这种拮抗剂对需要此治疗的恒温动物给药来实施。

相关技术领域的描述

促性腺激素释放激素(GnRH)也称为黄体生成素释放激素(LHRH)，为十肽(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂)，其在人类的繁殖中发挥重要作用。GnRH从下丘脑释放并作用于垂体来刺激黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的生物合成与释放。从垂体释放的LH负责男性与女性中性类固醇产生的调节，而FSH调节男性精子发生以及女性的卵泡发育。

由于其生物学重要性，GnRH的合成拮抗剂与激动剂受到相当的关注，特别是在前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜异位症、子宫平滑肌瘤(纤维瘤)、卵巢癌、前列腺肥大、辅助的生殖治疗和性早熟领域(The Lancet358：1793-1803，2001；Mol.Cell.Endo.166：9-14，2000)。例如，肽类GnRH  激动剂，如亮丙瑞林(leuprorelin)(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt)，已经被用于治疗这些疾病状态。这种激动剂通过对垂体促性腺激素中的GnRH受体的结合来发挥功能，从而诱导促性腺激素的合成与释放。长期给予GnRH激动剂可耗尽促性腺激素并随后下调该受体，一段时间后导致类固醇激素的抑制(例如，长期给药起始后2-3周)。

相比之下，认为GnRH拮抗剂能够抑制促性腺激素的作用，并因此在过去的二十年来受到极大的关注。目前，这种拮抗剂临床应用的主要障碍是其相对较低的生物利用度与组织胺释放产生的副作用。然而，已报道了一些具有低组织胺释放特性的肽拮抗剂，尽管由于其有限的生物利用度，它们仍需要通过缓释途径来进行传输(诸如皮下注射和鼻内喷雾)。

由于考虑到肽GnRH拮抗剂相关的限制，一些非肽的化合物已被提出。例如，仇(Cho)等(J.Med.Chem.41：4190-4195，1998)公开了用作GnRH受体拮抗剂的噻酚并[2，3-b]吡啶-4-酮；美国专利第5,780,437号与第5,849,764号教导了用作GnRH受体拮抗剂的取代吲哚(也参见公开号为WO 97/21704、98/55479、98/55470、98/55116、98/55119、97/21707、97/21703与97/21435的PCT国际申请)；公开号为WO96/38438的PCT国际申请公开了作为GnRH受体拮抗剂的三环三氮杂草(diazepine)；公开号为WO 97/14682、97/14697、99/09033号的PCT国际申请公开了作为GnRH拮抗剂的喹啉和噻吩并吡啶衍生物；公开号为WO 97/44037、97/44041、97/44321与97/44339的PCT申请国际教导了作为GnRH受体拮抗剂的取代的喹啉-2-酮；以及公开号为WO 99/33831的PCT国际申请公开了作为GnRH受体拮抗剂的某些苯基取代的稠合含氮双环化合物。最近公开的公开号为WO 02/066459和WO 02/11732号的PCT国际申请分别公开了吲哚衍生物和新的双环和三环吡咯烷衍生物作为GnRH拮抗剂的应用。

其它最近公布的公开了化合物及其作为GnRH拮抗剂的用途的PCT申请的公开号包括WO 00/69859、WO 01/29044、W0 01/55119、WO 03/013528、WO 03/011870、WO 03/011841、WO 03/011839及WO03/011293。

虽然在该领域中进行了有意义的研究，但该领域仍需要有效的小分子GnRH受体拮抗剂。同时也需要含有此GnRH受体拮抗剂的药物组合物，以及利用其来治疗诸如性激素相关的疾病状态的方法。本发明满足了这些需要，并提供了其它相关的优点。

发明概述

简而言之，本发明总体上涉及促性腺激素释放激素(GnRH)受体拮抗剂，同时还涉及它们的制备方法和用途，以及含有其的药物组合物。更特别地，本发明所述GnRH受体拮抗剂是具有以下通式结构(I)的化合物，并包括其立体异构体、前药和药物可接受的盐：

其中R_1a、R_1b、R_2a、R_2b、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇与X的定义如下文所述。

本发明的GnRH受体拮抗剂可应用于广泛的治疗用途，并可用来治疗男性和女性以及一般哺乳动物(本发明也称为“个体”)的各种性激素相关的疾病状态。例如，这种疾病状态包括，子宫内膜异位症、子宫平滑肌瘤、多囊性卵巢病、多毛症、性早熟，诸如前列腺、乳腺和卵巢的性腺类固醇依赖的肿瘤形成、垂体促性腺细胞腺瘤、睡眠失调、肠易激综合征、月经前期综合征、良性前列腺肥大、避孕和不育症(例如，诸如体外受精的辅助生殖治疗)。本发明的化合物也可用于生长激素缺乏和身材矮小的辅助治疗，并可用于治疗系统性红斑狼疮。所述化合物还可与雄激素、雌激素、黄体酮和抗雌激素与抗黄体酮组合用于治疗子宫内膜异位症、纤维瘤以及用于避孕，同时还可与血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素II-受体拮抗剂或血管紧张肽原酶(renin)抑制剂组合用于治疗子宫平滑肌瘤。此外，所述化合物还可与二磷酸脂以及其它试剂组合用于治疗和/或预防钙、磷和骨代谢失调，以及与雌激素、黄体酮和/或雄激素组合用于预防或治疗GnRH拮抗剂治疗中出现的骨遗失(bone loss)或诸如热潮红的性机能减退症状。

本发明的化合物，除具有GnRH受体拮抗剂活性外，其与肝脏中主要的代谢酶即细胞色素P450酶的相互作用较低。包括CYP2D6与CYP3A4亚型的这类酶家族负责药物与毒素的代谢，使其从体内排出。抑制这些酶会使其不能发挥功能，因而导致威胁生命的疾病状态。

本发明方法包括将有效剂量的GnRH受体拮抗剂对需要其的哺乳动物给药，优选以药物组合物的形式给药。因此，在进一步的实施方案中，公开了含有一种或多种与药物可接受的载体和/或稀释剂组合的本发明GnRH受体拮抗剂的药物组合物。

参考以下详细描述，本发明的这些以及其它方面是显而易见的。为此，本发明给出了各种参考文献，其更详细地描述某些背景信息、方法、化合物和/或组合物，本发明将其中每一篇都全部引入作为参考。

发明详述

如上所述，本发明总体涉及用作促性腺激素释放激素(GnRH)受体拮抗剂的化合物。

本发明化合物具有以下通式结构(I)，或为其立体异构体、前药或药物可接受的盐：

其中：

R_1a与R_1b相同或不同，并独立地为氢、卤素、C_1-4烃基或烃氧基；

R_2a与R_2b相同或不同，并独立地为氢、卤素、三氟甲基、氰基或-SO₂CH₃；

R₃为氢或甲基；

R₄为苯基或C_3-7烃基；

R₅与R₆相同或不同，并独立地为氢或C_1-4烃基；或

R₅及其相连的氮与R₄及其相连的碳一起共同形成1，2，3，4-四氢异喹啉或2，3-二氢-1H-异吲哚；

R₇为-COOH或酸同电子排列体；及

X为-O-(C_1-6亚烷基)或-O-(C_1-6亚烷基)-O-(C_1-6亚烷基)，其中每一C_1-6亚烷基任意地被1至3个C_1-4烷基取代。

本发明中所用术语具有以下的含义：

“C_1-6烃基”指含1-6个碳原子的直链或支链、非环状或环状、不饱和或饱和脂肪烃。代表性的饱和直链烃基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等等；而饱和的支链烃基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等等。代表性的饱和环烃基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等等；而不饱和的环烃基包括环戊烯基和环己烯基等等。

不饱和烃基在相邻的碳原子之间含有至少一个双键或三键(分别称为“烯基”和“炔基”)。代表性的直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基等等；而代表性的直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等等。

“C_1-4烃基”指含1-4个碳原子的、直链或支链的非环烃或环烃。代表性的直链烃基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基等等；支链烃基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基等等；而环烃基包括环丙基等等。

“C_3-7烃基”指含3-7个碳原子的直链或支链的非环烃或环烃。代表性的直链烃基包括正丙基、正丁基、正己基等等；而支链烃基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等等。代表性的环烃基包括环丙基、环戊基、环己基等等。

“C_1-6亚烃基”指从相同或不同的碳原子上脱除了两个氢原子的二价C_1-6烃基，例如-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂-、-CH(CH₃)CH₂CH₂-、-CH₂C(CH₃)₂CH₂-等等。

“卤素”指氟、氯、溴或碘，通常指氟和氯。

“羟基”指-OH。

“烃氧基”指-O-(C_1-6烃基)。

“氰基”指-CN。

“酸同电子排列体(Acid isostere)”指表现出与羧酸相似的特性，且其pKa低于8，并优选低于7的部分。代表性的酸同电子排列体包括四唑、3H-[1，3，4]噁二唑-2-酮、[1，2，4]噁二唑-3-酮、1，2-二氢-[1，2，4]三唑-3-酮、2H-[1，2，4]噁二唑-5-酮、被磺酰或亚砜基团取代的三唑、被磺酰或亚砜基团取代的咪唑、[1，2，4]-噁二唑烷(oxadiazolidine)-3，5-二酮、[1，2，4]-噻唑烷-3，5-二酮、咪唑烷-2，4-二酮、咪唑烷-2，4，5-三酮、吡咯烷-2，5-二酮以及吡咯烷-2，3，5-三酮。酸同电子排列体还包括-C(＝O)NHSO₂NR_aR_b、-C(＝O)NHSO₂R_b、-C(＝O)NHC(＝O)NR_aR_b和-C(＝O)NHC(＝O)R_b，其中Ra为氢或C_1-4烃基，且R_b为C_1-4烃基。

在一个实施方案中，R₄为苯基，且本发明代表性的GnRH拮抗剂包括具有以下结构式(II)的化合物。

在另一实施方案中，R₄为C_3-7烃基，且如以下结构式(III)中所示。C_3-7烃基可为例如结构式(IV)中所示的异丁基的直链或支链烷基，或者为例如结构式(V)中所示的环己基的环烷基：

在另一实施方案中，R₅及其相连的氮与R₄及其相连的碳一起共同形成分别如结构式(VI)和(VII)中所示的1，2，3，4-四氢异喹啉或2，3-二氢-1H-异吲哚。

在另一实施方案中，R_1a与R_1b为氢、烷氧基或卤素。代表性的烷氧基可以是甲氧基或乙氧基，而代表性的卤素通常为氟或氯。

在另一实施方案中，R_2a与R_2b为氢、三氟甲基、卤素(通常为氟或氯)或-SO₂CH₃。

进一步的实施方案中，X为-OCH₂CH₂-、-OCH₂CH₂CH₂-或-OCH₂CH₂CH₂CH₂-。

通过公知的有机合成技术可制备本发明的化合物，这些技术包括实施例中有更详细描述的方法。总体来讲，上述结构式(I)的化合物可通过以下的反应方案制备，其中除非另有说明，所有取代基如上述所定义。

反应方案1

利用适合的反应试剂如溶于THF的硼烷可以使适当取代的苯甲腈还原为相应的胺，并随后形成脲1。与诸如双烯酮的反应试剂环化可形成化合物2，其可用溶于乙酸的溴、N-溴代琥珀酰亚胺或其它溴化剂来溴化，以得到化合物3。烷基化得到化合物4，及与硼酸或硼酸酯进行Suzuki缩合可得到化合物5。利用常规反应试剂(例如在BOC基的情况下用溶于二氯甲烷的三氟乙酸)对所保护的胺进行脱保护，可得到化合物6，将其烷基化或在还原胺化作用条件下与醛缩合可得到通式7化合物。可以调整各还原胺化、烷基化、溴化以及Suzuki缩合步骤的顺序来制备本发明化合物。

反应方案2

在方案1的变体中，对化合物4脱保护得到化合物8，其在Suzuki条件下与适合的硼酸缩合得到化合物6。

反应方案3

使取代的苯乙酸酯9(制备自对应的酸或购买)与诸如二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛的试剂缩合得到化合物10。与尿素环化得到通式11的化合物。用例如取代的苄基溴进行烷基化得到化合物12，其可用适合的卤代烷、甲磺酸酯或、甲苯磺酸酯烷基化得到化合物5。

反应方案4

用诸如HBr或BBr₃的适合的酸对化合物13或化合物13的适当保护的叔丁氧羰基(Boc)或羧苄氧基(CBZ)形式进行脱烷基化得到化合物14。在用含有酸、酯和酸同电子排列体官能团的卤代烷烷基化之前，需要对胺官能团进行再次保护，以直接产生化合物15，或如果存在酯基，将酯基水解后产生化合物15。

本发明的化合物通常以游离酸或游离碱的形式使用。可选择地，本发明化合物可以酸或碱加合盐的形式使用。可用本领域公知的方法制备本发明的游离氨基化合物的酸加合盐，并可从有机酸和无机酸制备。适合的有机酸包括马来酸、反丁烯二酸、安息香酸、抗坏血酸、琥珀酸、甲磺酸、乙酸、三氟乙酸、草酸、丙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、扁桃酸、苯乙酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、乙二醇酸、谷氨酸和苯磺酸。适合的无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和硝酸。碱加合盐包括与羧酸根阴离子形成的盐，并包括与诸如选自碱金属离子、碱土金属离子(例如，锂、钠、钾、镁、钡、钙)以及铵离子的有机和无机阳离子形成的盐，及其取代的衍生物(例如，二苄基铵、苄基铵、2-羟基乙基铵等等)。因此，术语结构式(I)的“药物可接受的盐”应包括任何和所有可接受的盐形式。

此外，前药也包括在本发明的范围之中。前药是任何共价结合载体，当将该前药对患者进行给药时其在体内释放出接受式(I)的化合物。通常通过以某种方式修饰官能团来制备前药，该方式使所述的修饰能够通过常规的变换或在体内分解，得到母体化合物。

前药包括，例如羟基、氨基或巯基与任何基团结合的本发明化合物，其中当对患者给药时所述基团脱离从而得到羟基、氨基或巯基。因此，前药的代表性的例子包括(但不限于)结构式(I)化合物的醇和胺官能团的乙酸盐(酯)、甲酸盐(酯)和安息香酸盐(酯)衍生物。此外，在羧酸(-COOH)的情况下，可以包括诸如甲酯、乙酯等等的酯类。

对于立体异构体，结构式(I)的化合物可具有手性中心，并能以消旋体、消旋混合物，以及单独的对映异构体或非对映异构体的形式存在。所有同分异构的形式均包括在本发明之内，包括其混合物。此外，结构式(I)的化合物的某些晶形可以多形体的形式存在，其也包括在本发明中。此外，一些所述结构式(I)的化合物也可与水或其它有机溶剂形成溶剂化物。这种溶剂化物也类似地包括在本发明的范围之内。

通过多种分析技术可测定作为GnRH受体拮抗剂的化合物的效力。如下所述，本领域公知的分析技术包括使用培养的垂体细胞来检测GnRH的活性(维乐(Vale)等，Endocrinology 91：562-572，1972)，以及与大鼠垂体膜(佩兰(Perrin)et al.，Mol.Pharmacol.23：44-51，1983)，或者与来自表达克隆受体的细胞的膜结合的放射性配体的检测。其它的分析技术包括(但不限于)检测GnRH受体拮抗剂对GnRH-刺激的钙通量的抑制、磷酸肌醇水解的调节，以及去势动物中促性腺激素的循环浓度的作用的检测。以下对这些技术，放射性标记的配体的合成、放射性标记的配体在放射免疫分析中的应用，以及化合物作为GnRH受体拮抗剂的效力的检测进行了描述。

GnRH刺激的LH释放的抑制

适合的GnRH拮抗剂能够抑制GnRH对其受体的特异结合并拮抗与GnRH有关的活性。例如，根据Vilchez-Martinez(Endocrinology 96：1130-1134，1975)的方法，可检测在未成熟大鼠中GnRH刺激的LH释放的抑制。简而言之，通过口服强饲法，皮下注射或静脉注射对25天大的雄性Spraque-Dawley大鼠进行盐水中的GnRH拮抗剂或其它适合制剂的给药。随后皮下注射位于0.2ml盐水中的200ng的GnRH。最后一次注射的30分钟后，将所述动物断头，收集大动脉血液。离心后，分离的血浆保存在-20℃直到通过放免分析检测LH和/或FSH浓度(参见下文)。

GnRH拮抗剂的大鼠垂体前叶细胞培养分析

从7周大的雌性Sprague-Dawley大鼠中收集垂体前叶腺体并将所收集的腺体用胶原酶在分散烧瓶中在37℃消化1.5小时。胶原酶消化后，用神经氨(糖)酸苷酶进一步在37℃消化9分钟。随后用0.1％BSA/McCoy′s 5A培养液洗涤该消化的组织，洗涤的细胞重悬在3％FBS/0.1BSA/McCoy′s 5A培养液中，并在200μl培养液中以每孔40,000个细胞的密度接种在96孔组织培养板中。将所述细胞在37℃孵育3天。对于GnRH拮抗剂分析，首先用0.1％BSA/McCoy′s 5A培养液洗涤所述的孵育细胞一次，随后在三个孔中加入检测样品与溶在200μl0.1％BSA/McCoy′s 5A培养液中的1nM GnRH。在5个剂量水平分析每个样品来产生用于测定对GnRH刺激的LH和/或FSH释放的抑制效力的剂量反应曲线。在37℃孵育4小时后，收集培养液，通过RIA测定分泌到所述培养液中的LH和/或FSH水平。

膜结合分析1

收集用GnRH受体表达载体稳定或瞬时转染的细胞，重悬在5％蔗糖中，并用polytron匀浆器匀浆(2×15秒)。通过离心去除核(nucleii)(3000×g，共5分钟)，并将上清离心(20,000×g，共30分钟，4℃)来收集胞膜组分。将最终胞膜的制剂重悬在结合缓冲液(10mM Hepes(pH 7.5)，150mM NaCl，和0.1％BSA)并储存在-70℃。在MilliporeMultiScreen 96-孔过滤培养板中进行结合反应，该培养板组合有包被的聚氮丙啶GF/C膜。通过将胞膜(130μl结合缓冲液中的40μg蛋白)加入到50μl[¹²⁵I]-标记的GnRH肽(约100,000cpm)和20μl不同浓度的竞争剂中来起始所述反应。90分钟后，通过真空或用磷酸缓冲液洗涤(2×)来终止反应。利用96孔闪烁计数仪(Packard Topcount)或将滤膜从所述板中移出并直接进行伽马计数来检测结合的放射性。利用Prism软件包(GraphPad Software)用非线形最小平方回归(non-linear least squaresregression)由竞争结合数据计算K_i值。

膜结合分析2

对于其它膜结合分析，通过在坚硬的表面上吹打组织培养瓶来收获稳定转染的HEK293细胞，并通过1000×g离心5分钟来收集细胞。将细胞沉淀重悬在5％蔗糖中，并用polytron研磨器进行两次15秒的研磨步骤来研磨。在3000×g离心5分钟来去除细胞匀浆中的胞核，随后将该上清液44,000×g离心30分钟来收集胞膜组分。将该胞膜沉淀重悬于GnRH结合缓冲液中(10mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl和0.1％BSA)并将等分立即在液氮中速冻并保存在-80℃。利用Bio-Rad蛋白分析试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)来测定所述胞膜悬浊液的蛋白含量。

在有滤膜的Millipore 96孔过滤培养板中用胞膜制剂进行竞争放射配体结合分析，其中所述滤膜用200μl的0.1％聚氮丙啶预包被(Sigma，St.Louis.MO)。使用前，用磷酸盐缓冲液洗涤该培养板3次。将GnRH结合缓冲液中的胞膜组分(对于人和猕猴受体，130μl中含25μg蛋白，对于大鼠受体含12μg)与不同浓度的20μl竞争配体一同加入到孔中。通过加入放射性配体(在50μl GnRH结合缓冲液中0.1nM)来起始所述的结合反应。使所述反应在室温下在平台振荡器上进行90分钟，并通过将分析板放在Millipore真空岐管(manifold)(Millipore，Bedford，MA)上，吸出溶剂，并用200μl冷磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次来终止反应。移出孔中的滤膜并在伽马计数仪中计数。假定放射性配体亲和性为0.5nM，用非线性最小平方回归由每一竞争结合曲线计算K_i值，并用Cheng-Prusoff方程(Prism，GraphPad Software，San Diego，CA)修正放射配体浓度。从每一受体配体对的平均pKi值的反对数来计算平均的Ki值。

膜结合分析3

将稳定转染人GNRH受体的RBL细胞生长为融合单层。移出培养液，并用DPBS洗涤细胞单层一次。在所述的培养板中加入0.5mMEDTA/PBS(不含Ca⁺⁺、Mg⁺⁺)溶液，然后将其在37℃孵育10分钟。通过柔和刮该培养瓶，来移走细胞。通过在4℃、800g离心10分钟收集和沉淀细胞。

随后将该细胞沉淀重悬于缓冲液[添加有10mM MgCl₂，2mMEGTA的DPBS (1.5mM KH₂PO₄，8.1mM Na₂HPO₄，2.7mM KCl以及138mM NaCl)用NaOH调pH＝7.4]。随后通过在4℃加压细胞或应用压力900psi的N₂30分钟来对细胞进行裂解。通过在4℃，1200g离心10分钟去除未破裂的细胞和大的碎片。随后在45,000g离心细胞膜上清，并将所得到的胞膜沉淀重悬在分析缓冲液中，并在冰中用组织研磨器来研磨。

利用牛血清白蛋白作为标准，用Coomassie Plus Protein反应试剂盒(Pierce，Rockford，IL)来测定蛋白浓度。将沉淀(pellet)等分并保存在-80℃直到使用。利用蛋白浓度范围的滴定分析测定理想的蛋白浓度为15μg每孔的最终浓度。

利用蒸馏水中的0.5％聚乙烯亚胺溶液预处理UniFilter GF/C滤膜培养板(Perkin Elmer，Boston MA)30分钟。用200μl每孔的PBS，1％BSA(Fraction V)和0.01％Tween-20，pH＝7.4)借助细胞收集器(UniFilter-96 Filtermate；Packard)来预清洗滤膜。用快速真空过滤收集胞膜，并用冰冷的250μl缓冲液(PBS，0.01％Tween-20，pH＝7.4)洗涤3次。培养板用空气干燥，加入50μl闪烁液(Microscint 20；Packard)，随后利用TopCount NXT(Packard Instruments，IL)监测培养板的放射性活性。

在缓冲液中实施结合实验，该缓冲液中含10mM HEPES、150mMNaCl和0.1％BSA，pH＝7.5。将胞膜与50μl[¹²⁵I]His⁵、D-Tyr⁶ GnRH(终浓度为0.2nM)以及50μl浓度范围为30pM-10μM的小分子竞争剂孵育，每孔总容积200μl。在室温下孵育2小时。如前述，用GF/C滤膜的快速过滤来终止所述反应。利用Excel Fit软件(IDBS，Emeryville，CA)来进行曲线的拟合。利用程与普鲁少夫(Cheng and Prusoff，1973)的方法，设所述放射性配体的Kd值为0.7nM，计算Ki值，该Kd值预先在饱和的结合实验中测定。

Ca⁺⁺流测定

为测定表达人GnRH受体的细胞中GnRH刺激钙流的抑制，在96孔培养板中接种稳定转染人GnRH受体的密度为50,000细胞/孔的RBL细胞，并使该细胞附着过夜。在37℃将细胞加载在以下培养液中1小时：含20mM HEPES、10％FBS、2MFluo-4、0.02％pluronicacid(聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物酸)2.5mM丙磺舒(probenecid)的DMEM。加载后用洗涤缓冲液(Hanks平衡盐，20mM HEPES，2.5mM丙磺舒)洗涤细胞4次，最后一次洗涤后，每孔保留150μl。在含0.1％BSA的FLIPR缓冲液(Hanks平衡盐，20mM HEPES)中稀释GnRH至20nM的浓度，并分配入96孔培养板(低蛋白结合)。在第三96孔培养板中用0.1％BSA/FLIPR缓冲液制备不同浓度的拮抗剂。根据FLIPR系统(Molecular Devices，FLIPR384 system，Sunnyvale，CA)的厂商说明书，进行由GnRH刺激(50μl 20nM或4nM的终浓度)产生的Ca⁺⁺流的荧光检测，随后与不同浓度的50μl的拮抗剂孵育1分钟。

磷酸肌醇水解分析

该方法改进自发表的方案(W.周(Zhou)等；J.Biol.Chem.270(32)，pp18853-18857，1995)。简而言之，将稳定转染人GnRH受体的RBL细胞以200,000细胞/孔的密度接种入24孔培养板中，孵育24小时。用无肌醇的含10％透析的FBS的培养液洗涤细胞一次，随后加入标记的1uCi/mL的[myo-³H]肌醇。20-24小时后，用缓冲液(140nM NaCl，4mMKCl，20mM Hepes，8.3mM葡萄糖，1mM MgCl₂，1mM CaCl₂和0.1％BSA)洗涤细胞，并在37℃，用含或不含各种浓度的拮抗剂和10mMLiCl的相同缓冲液中的天然GnRH肽处理细胞1小时。在4℃用10mM甲酸提取细胞30分钟并加载在Dowex AG1-X8柱上，用1M甲酸铵和0.1M甲酸洗涤和洗脱。在闪烁计数仪中计数洗脱物。通过Prism程序(Graphpad，GraphPad Software，San Diego，CA)利用非线性最小二乘回归将PI水解分析的数据作图，从中计算剂量比值。通过线性回归，在4个独立的实验中获得的剂量比值中，产生Schild线性图，并且利用X-截取(intercept)来确定所述拮抗剂的亲和性。

去势动物研究

去势(castrate)动物的研究提供了敏感的GnRH拮抗剂作用的体内分析(Andrology 25：141-147，1993)。垂体腺体中的GnRH受体介导GnRH-刺激的LH释放入血。因生殖腺类固醇的负反馈降低导致GnRH刺激的LH释放的增加，因此去势导致循环LH水平升高。由此，在去势猕猴中循环LH水平抑制的检测能够用作GnRH拮抗作用的敏感的体内分析。因此，将雄性猕猴外科去势，并使其恢复4周，此时其LH水平升高。随后以口服或i.v.剂量对动物进行实验化合物的给药，采集一系列的血样用于LH分析。通过免疫分析或生物分析技术来测定这些动物血清中LH浓度(Endocrinology 107：902-907，1980)。

GnRH放射性配体的制备

通过氯阿明T(chloramine-T)方法来标记GnRH类似物。向pH 7.6的含10μg肽的20μl 0.5M硫酸钠缓冲液中加入1mCi的Na¹²⁵I，然后加入含22.5μg氯阿明T的15μl 0.05M硫酸钠缓冲液，将混合物涡旋20秒。通过加入含60μg偏亚硫酸氢钠的30μl 0.05M硫酸钠缓冲液来终止反应，将所述反应混合物通过C-8Sep-Pak柱(Millipore Corp.，Milord，MA)来去除游离的碘。用少量80％乙腈/水洗脱所述的肽。通过Beckman334梯度HPLC系统中的反相HPLC上的Vydac C-18分析柱(TheSeparations Group，Hesperia，CA)利用含梯度乙腈的0.1％TFA进一步回收标记的肽。纯化的放射性肽保存在-80℃、0.1％BSA/20％乙腈/0.1％TFA中使用前最多保存4周。

LH和FSH的RIA

为测定LH的水平，每一样品平行检测，并用RIA缓冲液(0.01M硫酸钠缓冲液/0.15M NaCl/1％BSA/0.01％NaN3，pH 7.5)来稀释并从NIDDK资助的国家激素和垂体计划获得分析试剂盒。向12×75mm的聚乙烯检测管中加入1∶5稀释的100μl样品培养液或RIA缓冲液中的rLH标准，以及100μl的[¹²⁵I]-标记的rLH(约30,000cpm)加上100μl的1∶187,500稀释的兔抗-rLH抗体和100μl RIA缓冲液。将所述混合物在室温孵育过夜。在第二天，加入1∶20稀释的100μl山羊抗兔IgG和100μl的1∶1000稀释的正常兔血清。在室温再孵育所述混合物3小时。随后将孵育后的小管在3,000rpm离心30分钟，通过抽吸移去上清。通过伽马计数仪计数所述小管中保留的沉淀。以与LH相似的方式来检测FSH的RIA，用1∶30,000稀释的FSH抗体替代LH抗体并用标记的rFSH替代标记的rLH。

GnRH受体拮抗剂活性

通常由从GnRH受体上替代50％的放射性标记配体所需的化合物浓度IC₅₀来计算GnRH受体拮抗剂活性，并用通过以下方程计算得到的“K_i”值表示：

$>>>K>i>>=>>>IC>50>>>1>+>L>/>>K>D>\; >\; >s>$

其中L＝放射性配体，且K_D＝放射性配体对受体的亲和性(程合普鲁少夫，Biochem.Pharmacol.22：3099，1973)。本发明的GnRH受体拮抗剂具有100μM或更低的Ki值。在本发明的优选实施方案中，所述GnRH受体拮抗剂的K_i低于10μM，更优选低于1μM，还更优选低于0.1μM(例如，100nM)。因此，所有实施例中具体公开的化合物的Ki值在所述膜结合分析1至3之中的一个或多个分析中低于100nM。

根据科瑞斯培(Crespi)等(Anal.Biochem.248：188-190；1997)所述的基于微滴定板荧光计方法体外评价GnRH拮抗剂对人肝脏内主要的药物代谢酶即CYP2D6和CYP3A4的抑制能力。使用Km浓度(即产生最大速度的一半的底物浓度)的AMMC(即3-[2-(N，N-二乙基-N-甲基铵)乙基]-7-甲氧基-4-甲基香豆素)和BFC(即7-苄氧基-4-(三氟甲基)香豆素)分别作为CYP2D6和CYP3A4的标志底物。简而言之，在有或无0.03、0.09、0.27、0.82、2.5、7.4、22、67和200μM的GnRH拮抗剂样品的情况下，在37℃将重组CYP2D6或CYP3A4与标志底物和NADPH产生系统(由1mM NADP+，46mM葡萄糖-6-磷酸酯和3单位/mL葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶组成)孵育。通过加入定量的乙腈来终止反应。通过离心来去除沉淀的蛋白，并利用微滴定板荧光仪来分析澄清的上清。本发明的GnRH拮抗剂优选具有高于250nM的K_i值，更优选高于1μM，最优选高于5μM。

如上所述，本发明的GnRH受体拮抗剂在各种治疗应用具有广泛的用途，并可被使用来治疗男性和女性以及一般哺乳动物的多种性激素相关的疾病状态，这种疾病状态包括子宫内膜异位症、子宫平滑肌瘤、多囊性卵巢病、多毛症、性早熟、诸如前列腺癌、子宫癌、乳腺癌的性腺类固醇依赖肿瘤形成、垂体促性腺细胞腺瘤、睡眠失调、红斑狼疮、肠易激综合征、月经前期综合征、良性前列腺肥大、避孕和不育症(例如，诸如体外受精的生殖治疗)。

本发明化合物还用于生长激素缺乏和身材矮小症的辅助治疗，并用于支链系统性红斑狼疮。

所述化合物还可与雄激素、雌激素、黄体酮和抗雌激素与抗黄体酮组合用于治疗子宫内膜异位症、纤维瘤以及用于避孕，同时还可与血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素II-受体拮抗剂或血管紧张肽原酶抑制剂组合用于治疗子宫平滑肌瘤。此外，所述化合物还可与二膦酸酯(bisphosphonate)以及其它试剂组合用于治疗和/或预防钙、磷和骨代谢失调，以及与雌激素、黄体酮和/或雄激素组合用于预防或治疗GnRH拮抗剂治疗中出现的骨遗失或诸如热潮红的性机能减退症状。

在另一实施方案中，公开了含有一种或多种GnRH受体拮抗剂的药物组合物。为了给药的目的，本发明的化合物可组方成药物组合物。本发明的药物组合物包括本发明的GnRH受体拮抗剂和药物可接受的载体和/或稀释剂。所述组合物中的GnRH受体拮抗剂的含量能够有效治疗特异病症，即足以达到GnRH受体拮抗剂活性的含量，且优选只有所述患者可接受毒性。典型的，根据给药途径本发明的药物组合物可包括每剂量0.1mg-250mg的GnRH受体拮抗剂，更典型的为1mg-60mg。本领域所属技术人员可容易地确定适合的浓度和剂量。

本领域所属技术人员熟悉药物可接受的载体和/或稀释剂。对组方成液态溶液的组合物，适合的载体和/或稀释剂包括盐和无菌水，并可选包括抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和其它常用添加剂。所述组合物还可组方成药丸、胶囊、颗粒和片剂，其除含GnRH受体拮抗剂外，还含有稀释剂、分散剂和表面活性剂、结合剂以及润滑剂。本领域所属技术人员根据适合的方式，和诸如雷明顿制药学(Remington′sPharmaceutical Sciences，Gennaro，Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA1990)中公开的已有实践，可进一步将GnRH受体拮抗剂组方成适当的形式。

在另一实施方案中，本发明还提供治疗如上述的性激素相关的疾病状态的方法。这种方法包括对恒温动物给予足以治疗所述疾病状态的本发明化合物。本文中，“治疗”包括预防性给药。这种方法包括本发明GnRH受体拮抗剂的系统给药，优选以如上述公开的药物组合物形式给药。本发明所用的系统给药包括口服和肠道外给药方法。对于口服给药，适合的GnRH受体拮抗剂药物组合物包括粉剂、颗粒、丸剂、片剂和胶囊，以及液体剂、糖浆剂、悬浮剂和乳剂。这些组合物也可包括调味剂、防腐剂、悬浮剂、增稠剂和赋形剂，以及其它药物可接受的添加剂。对于肠道外给药，本发明化合物可制备为水性注射液，其除GnRH受体拮抗剂外，还含有缓冲液、抗氧化剂、抑菌剂和其它常在此溶液中使用的添加剂。

以下给出的实施例仅为说明目的，而不是对本发明的限制。总之，本发明的GnRH受体拮抗剂可通过以上公开的通用方法来分析，而以下实施例公开了本发明代表性化合物的合成。

实施例

A.分析所述样品的HPLC方法

t_R保留时间，单位分钟

方法1-超临界流体色谱质谱(SFC-MS)

谱柱：来自Thermo-Hypersil-Keystone的4.6×150mm Deltabond Cyano5μM。

流动相：SFC级二氧化碳和1mM二乙基丙二酸二钠调节剂的最优级(optima grade)的甲醇。

温度：50℃

压力：120巴(bar)

流速：4.8mL/min

梯度：5％至55％甲醇1.7分钟，在55％停留0.8分钟，随后0.1分钟内返回至5％，总用时2.6分钟

方法2(HPLC-MS)

谱柱：水ODS-AQ，2.0×50mm

流动相：A＝含0.05％三氟乙酸的水；B＝含0.05％三氟乙酸的乙腈

梯度：95％A/5％B至5％A/95％B 13.25分钟，并在5％A/95％B停留2分钟，随后用0.25分钟返回至95％A/5％B。

流速：1mL/min

UV波长：220与254nM

方法3(HPLC-MS)

谱柱：BHK Lab ODS-O/B，4.6×50mm，5μM

流动相：A＝含0.05％三氟乙酸的水；B＝含0.05％三氟乙酸的乙腈

梯度：95％A/5％B 0.5分钟，随后至90％A/10％B 0.05分钟，从90％A/10％B至5％A/95％B共18.94分钟，随后至1％A/99％B共0.05分钟，并保持在1％A/99％B共2.16分钟。随后返回至95％/5％B 0.50分钟。

流速：2.5mL/min.

UV波长：220和254nM

方法4(HPLC-MS)

谱柱：水ODS-AQ，2.0×50mm

流动相：A＝含0.05％三氟乙酸的水；B＝含0.05％三氟乙酸的乙腈

梯度：95％A/5％B到10％A/90％B 2.25分钟，并在10％A/90％B保持1.0分钟，然后返回至95％A/5％B 0.1分钟。

流速：1mL/min

UV波长：220和254nM

方法5(HPLC)

谱柱：Agilent，Zorbax SB-C18，5μM，4.6×250mm.

流动相：A＝含0.05％三氟乙酸的水；B＝含0.05％三氟乙酸的乙腈

梯度：95％A/5％B至5％A/95％B共50分钟，随后5％A/95％B至1％A/99％B共0.1分钟，在1％A/99％保持0.8分钟，并返回至95％A/5％0.2分钟，保持此梯度4分钟。

流速2.0mL/min.

UV波长：220和254nM

方法6(HPLC-MS)

谱柱：Phenomenex Synergi 4Max-RP 80A，50.0×2.0mm

流动相：A＝含0.025％三氟乙酸的水；B＝含0.025％三氟乙酸的乙腈

梯度：95％A/5％B 0.25分钟，随后95％A/5％B至95％B/5％A共13分钟，维持95％A/5％B至95％B/5％A共2分钟，随后返回至95％A/5％B共0.25分钟。

流速：1mL/min

UV波长：220nM和254nM

实施例1

3-[2(R)-氨基-2-苯乙基]-5-(2-氟-3-甲氧苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

步骤1A：2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基胺1a的制备

在60℃向含2-氟-6-(三氟甲基)苄腈(45g，0.238mmol)的60mLTHF中缓慢加入1M BH₃:THF，产生的溶液回流过夜。将该反应混合物冷却至室温。缓慢加入甲醇(420mL)并搅拌好。随后蒸发溶剂，并将残留物在EtOAc与水之间分配。用Na₂SO₄干燥有机层。蒸发得到黄色油状的la(46g，0.238mmol)。MS(CI)m/z 194.0(MH⁺)。

步骤1B：N-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]脲1b的制备

向烧瓶中的2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基胺1a(51.5g，0.267mmol)加入尿素(64g，1.07mmol)、HCl(浓度，30.9mmol，0.374mmol)和水(111mL)。将混合物回流6小时。将混合物冷却至室温，用冰进一步冷却并过滤得到黄色固体。400mL EtOAc重结晶得到白色固体1b(46.2g，0.196mmol)。MS(CI)m/z 237.0(MH⁺)。

步骤1C：1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮1c的制备

将NaI(43.9g，293mmol)加入到含N-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]脲1b(46.2g，19.6mmol)的365mL乙腈中。用冰域冷却产生的混合物。通过滴液漏斗将双烯酮(22.5mL，293mmol)缓慢加入，并随后以相同的方式加入TMSCI(37.2mL，293mmol)。将所产生黄色悬浮液缓慢加热至室温并搅拌20小时。LC-MS显示，起始材料消失。将525mL水加入所述的黄色混合物中，并搅拌过夜。继续搅拌20小时后，通过Buchnner(布式)漏斗过滤沉淀，并用水和EtOAc来洗涤沉淀，得到白色固体1c(48.5g，16mmol)。

¹H NMR(CDCl₃)δ2.152(s，3H)，5.365(s，2H)，5.593(s，1H)，7.226-7.560(m，3H)，9.015(s，1H)；MS(CI)m/z 303.0(MH⁺)。

步骤1D：5-溴-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮1d的制备

溴(16.5mL，0.32mmol)加入到含1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮1c(48.5g，0.16mol)的145mL乙酸中。所产生的混合液在1小时内变得清澈并形成沉淀。搅拌2小时后，过滤黄色固体，并用冷EtOAc洗涤产生几乎白色的固体。用饱和的NaHCO₃洗涤滤液并用Na₂SO₄干燥。蒸发得到黄色固体并用EtOAC洗涤得到浅黄色固体。将两种固体合并得到总量59.4g的1d(0.156mol)。¹HNMR(CDCl₃)δ2.422(s，3H)，5.478(s，2H)，7.246-7.582(m，3H)，8.611(s，1H)；MS(CI)m/z 380.9(MH⁺)。

用相同的方法制备5-溴-1-[2，6-二氟苯甲基]-6-甲基嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮1d.1。

步骤1E：5-溴-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-3-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-2-苯乙基]-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮1e的制备

向含5-溴-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮1d(15g，39.4mmol)的225mL THF中加入N-叔丁氧基-D-苯基甘氨醇(glycinol)(11.7g，49.2mmol)和三苯基膦(15.5g，59.1mmol)，随后加入二-叔丁基偶氮二甲酸酯(azodicarboxylate)(13.6g，59.1mmol)。搅拌所得到的黄色溶液过夜。蒸发挥发物并借助硅胶用3∶7的EtOAc/己烷对残余物进行纯化，得到白色固体的1e(23.6g，39.4mmol)。MS(CI)m/z500.0(MH⁺-Boc)。

步骤1F：3-[2(R)-氨基-2-苯乙基]-5-(2-氟-3-甲氧苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮1f的制备

向压力管中的含5-溴-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-3-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-2-苯乙基]-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮1e(15g，25mmol)的30mL/90mL H₂O/二噁烷中加入2-氟-3-甲氧苯基硼酸(4.25g，25mmol)和碳酸钠(15.75g，150mmol)。鼓泡通入N₂气10分钟。加入四(三苯膦)钯(2.9g，2.5mmol)，将所述小管封口，并将所产生的混合物90℃加热过夜。冷却至室温，通过过滤去除沉淀。通过蒸发去除蒸发物，并将所产生的残余物在EtOAc/饱和NaHCO₃间分配。将有机溶剂蒸发，并用2∶3 EtOAc/己烷层析分离所述的残余物得到13.4g(20.8mmol，83％)黄色固体。

将此黄色固体(6.9g，10.7mmol)溶解在20mL/20mL的CH₂Cl₂/TFA中。在室温将所产生的黄色溶液搅拌2小时。蒸发挥发物并将残余物在EtOAc/饱和NaHCO₃间分配。用Na₂SO₄干燥有机相。蒸发得到1f的黄色油(4.3g，7.9mmol，74％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ2.03(s，3H)，3.72-4.59(m，6H)，5.32-5.61(m，2H)，6.74-7.56(m，11H)；MS(CI)m/z 546.0(MH⁺)。

根据此实施例相同的方法制备3-[2(R)-氨基-2-苯乙基]-5-(2-氟-3-甲氧苯基)-1-[2，6-二氟苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮1f.l。

实施例2

3-[2(R)-氨基-2-环己基乙基]-5-(2-氟-3-甲氧苯基)-1-[2，6-二氟苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

步骤2A：叔-丁基1-环己基-2-羟基乙基氨基甲酸酯2a的制备

将含N-(叔丁氧羰基)环己基氨基乙酸(2.0g，7.77mmol)的无水THF(10mL)溶液冷却至0℃。缓慢加入硼烷溶液(1M在THF中，15.5mL，15.5mmol)，然后将所述的反应混合物加热至室温，并搅拌2小时。用MeOH(5mL)终止所述反应，蒸发挥发物，将残余物在水与之间分配。用饱和的NaHCO₃/水、盐水洗涤有机层，干燥(硫酸钠)，蒸发得到叔-丁基1-环己基-2-羟乙基氨基甲酸2a(1.26g，66.7％)，MS(CI)m/z144.20(MH⁺-Boc)。

步骤2B：5-溴-3-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-2-环己基乙基]-1-[2，6-二氟苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮2b的制备

室温下用5-溴-1-(2，6-二氟苯甲基)-6-甲基嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮1d.1(869mg，2.62mmol)和三苯膦(1.03g，3.93mmol)处理含叔丁基1-环己基-2-羟乙基氨基甲酸4a(638mg，2.62mmol)的THF(10mL)溶液，随后加入二-叔丁基偶氮二甲酸酯(906mg，3.93mmol)。在室温将反应混合物搅拌16小时，并蒸发挥发物。将残余物在NaHCO₃/H₂O与EtOAc之间分配。干燥所述有机层(硫酸钠)，蒸发，用快速层析(二氧化硅，25％EtOAc/己烷)得到化合物2b(1.39g，95.4％)。MS(CI)m/z 456.10，458.10(MH⁺-Boc)。

步骤2C：3-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-2-环己基乙基]-5-(2-氟-3-甲氧苯基)-1-[2，6-二氟苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮2c的制备

向含5-溴-3-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-2-环己基乙基]-1-[2，6-二氟苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮2b(1.0g，1.79mmol)的苯/EtOH/乙二醇二甲醚(20/2/22mL)中加入2-氟-3-甲氧苯基硼酸(382mg，2.24mmol)和饱和的Ba(OH)₂/水(约-0.5M，15mL)。用N₂对所述的反应混合物脱氧10分钟，加入四(三苯膦)钯(0)(208mg，0.18mmol)，然后将所述的反应混合物在N₂存在下，80℃加热过夜。将所述的反应混合物在盐水与EtOAc之间分配。干燥有机层(硫酸钠)，蒸发，用用快速层析(二氧化硅，30％EtOAc/己烷)得到化合物2c(348mg，32.3％)。MS(CI)m/z 502.20(MH⁺-Boc)。

步骤2D：3-[2(R)-氨基-2-环己基乙基]-5-(2-氟-3-甲氧基苯基)-1-[2，6-二氟苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮2d的制备

向含化合物2c(300mg，0.5mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液中加入TFA(2mL)，并将反应混合物在室温搅拌1小时。蒸发挥发物，然后将残余物在NaHCO₃/水和EtOAc之间分配。干燥有机层(硫酸钠)，蒸发，用反相HPLC(C-18柱，15-75％ACN/水)纯化得到化合物2d。MS(CI)m/z 502.20(MH⁺)。

实施例3

3-[2(R)-氨基-2-苯乙基]-5-(2-氯-3-甲氧苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

步骤3A：2-氯-3-甲氧基苯甲醛3a的制备

在搅拌下向含3-羟基苯甲醛(20.12g，160mmol)的HOAc(40mL)中小心加入tBuOCI(20mL，176mmol)。反应物变成清澈的溶液并产生得到强热。冷却并搅拌16小时，得到白色的沉淀。过滤该固体，用水洗涤并干燥得到2-氯-3-羟基苯甲醛(13.77g，55％)，GCMS(EI)m/z156，158(M⁺)。

向含2-氯-3-羟基苯甲醛(4.55g，29mmol)的DMF(30mL)中加入K₂CO₃(4.8g，34.9mmol)，然后加入MeI(2.7mL，43.6mmol)，并将该混合物在室温搅拌16小时。真空浓缩后，将残余物加入乙酸乙酯，用水、盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，浓缩。用1/5的乙酸乙酯/己烷通过硅胶柱层析来纯化，得到无色油状的静置会凝固的2-氯-3-甲氧基苯甲醛3a(4.68g，94％)。GCMS(EI)m/z 170，172(M⁺)。

步骤3B：2-氯-1-甲氧基-3-[2-(甲基硫烷基)-2-(甲基亚磺酰基)乙烯基]苯3b的制备

向含2-氯-3-甲氧基苯甲醛3a(4.65g，27.3mmol)和甲基(甲基硫)甲基亚砜(4.3mL，43.9mmol)的THF(25mL)中加入40％Triton B的甲醇(methanolic)溶液(6.2mL，13.6mmol)，然后将得到的溶液回流16小时。去除THF后，将残余物加入乙酸乙酯，用1N HCl、H₂O和盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，随后浓缩，用二氯甲烷进行硅胶柱层析来纯化该残余物，得到黄色油状的2-氯-1-甲氧基-3-[2-(甲基硫烷基)-2-(甲基亚磺酰基)乙烯基]苯3b(3.61g，48％)。GCMS(EI)m/z 225(M⁺-Cl-16)，210(M⁺-Cl-OMe)。

步骤3C：(2-氯-3-甲氧基苯基)乙酸乙酯7c的制备

向含2-氯-1-甲氧基-3-[2-(甲基硫烷基)-2-(甲基亚磺酰基)乙烯基]苯3b(3.58g，12.9mmol)的乙醇(20mL)溶液加入5M HCl的乙醇溶液(5.2mL)并将得到的溶液回流3小时。蒸发后，用二氯甲烷进行硅胶柱层析来纯化该残余物，得到黄色油状的(2-氯-3-甲氧基苯基)乙酸乙酯3c(2.78g，94％)。GCMS(EI)m/z 228，230(M⁺)。

步骤3D：2-(2-氯-3-甲氧基苯基)-3-(二甲基氨基)丙烯酸乙酯3d的制备

将含(2-氯-3-甲氧基苯基)乙酸乙酯3c(2.78g，12mmol)的DMFDMA(16mL，120mmol)溶液回流16小时。蒸发后，用1/21/1的乙酸乙酯/己烷进行硅胶柱层析来纯化该残余物，首先得到未反应的(2-氯-3-甲氧基苯基)乙酸乙酯3c(1.8g，65％)，随后得到黄色糖浆状的2-(2-氯-3-甲氧基苯基)-3-(二甲基氨基)丙烯酸乙酯3d(1.1g，32％；90％基于回收的起始材料)。MS(CI)m/z 284.0，286.0(MH⁺)。

步骤3E：5-(2-氯-3-甲氧苯基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮3e的制备

向含(2-氯-3-甲氧基苯基)-3-(二甲基氨基)丙烯酸乙酯3d(1.7g，6mmol)、尿素(1.08g，18mmol)和NaI(2.7g，18mmol)混合物的乙腈(20mL)中加入TMSCI(2.3mL，18mmol)。将所得到的混合物回流16小时，冷却至室温，并加入1.0M NaOH(30mL)。将所得到的溶液搅拌20小时，随后真空去除乙腈。用乙醚洗涤该水溶液，用冰浴冷却，用1N HCl(30mL)中和。过滤沉淀，再用水洗涤，干燥得到浅黄色固体的5-(2-氯-3-甲氧苯基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮3e(1.24g，82％)。MS(CI)m/z 253.1，255.1(MH⁺)。

步骤3F：5-(2-氯-3-甲氧基苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮3f的制备

向含5-(2-氯-3-甲氧苯基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮3e(2.2g，8.7mmol)的乙腈(25mL)悬浮液中加入双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(4.3mL，17.4mmol)，然后回流所得到的溶液1.5小时。将混合物冷却至室温，加入2-氟-3-三氟甲基苯甲基溴化物(2.7g，10.5mmol)，再回流16小时。加入MeOH(25mL)终止该反应，随后搅拌2小时。浓缩后，用含乙酸乙酯/己烷1/1的硅胶柱层析纯化该残余物得到白色固体的5-(2-氯-3-甲氧基苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮3f(3.3g，88％)。MS(CI)m/z 429.0，431.0(MH⁺)。

步骤3G：3-[2(R)-(叔丁氧基羰基氨基)-2-苯乙基]-5-(2-氯-3-甲氧苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]嘧啶2，4(1H，3H)-二酮3g的制备

将含5-(2-氯-3-甲氧基苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮3f(75mg，0.175mmol)、K₂CO₃(72mg，0.525mmol)和N-(叔丁氧基羰基)-D-α-苯基苷氨醇甲磺酸酯(0.11g，0.35mmol，(制备自THF中的N-(叔丁氧基羰基)-D-α-苯基苷氨醇，随后加入甲烷磺酰氯和三乙胺)混合物的DMF(2mL)在75℃加热16小时。用乙酸乙酯稀释该反应物，用水和盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，并浓缩。用2/3的乙酸乙酯/己烷进行硅胶柱层析来纯化该残余物，得到白色固体化合物3g(82mg，72％)。MS(CI)m/z 548.0，550.0(MH⁺-Boc)。

步骤3H：3-[2(R)-氨基-2-苯乙基]-5-(2-氯-3-甲氧苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮3h的制备

将化合物3g(2.7g，4.2mmol)溶解在二氯甲烷(10mL)中，加入TFA(14mL，175mmol)，然后将该混合物在室温搅拌4.5小时。浓缩后，将该残余物用DCM提取，并加入饱和NaHCO₃水溶液。用DCM萃取水层。合并有机萃取物，用Na₂SO₄干燥，浓缩得到化合物3h(2.2g，96％)。MS(CI)m/z 548.0，550.0(MH⁺)。

采用上述步骤通过适合的起始材料的替代制备3-[2(R)-氨基-2-苯乙基]-5-(2-氯-3-甲氧苯基)-1-[2，6-二氟苯甲基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮3h.1。

实施例4

3-[2(R)-氨基-2-(异丁基)乙基]-5-(2-氯-3-甲氧苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

步骤4A：3-[2(R)-{叔丁氧基羰基-氨基}-2-(异丁基)乙基]-5-(2-氯-3-甲氧苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮4a的制备

向含N-(叔丁氧基羰基)-D-α-亮氨醇(1.21g，5.57mmol)的嘧啶(6mL)中加入甲苯磺酰氯(1.6g，8.35mmol)。在室温将该反应混合物搅拌3小时，用EtOAc稀释，随后用1N HCI、H₂O、饱和NaHCO₃水溶液和盐水洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层，用1/3的乙酸乙酯/己烷进行硅胶柱层析来纯化，得到[3-甲基-1-[[[(4-甲基苯基)磺酰基]氧基]甲基]丁基]-1，1-二甲基乙基氨基甲酸酯(1.66g，80％)，MS(CI)m/z 272.2(MH⁺-Boc)。

将含5-(2-氯-3-甲氧苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮3f(56mg，0.13mmol)、K₂CO₃(754mg，0.39mmol)和[3-甲基-1-[[[(4-甲基苯基)磺酰基]氧基]甲基]丁基]-1，1-二甲基乙基氨基甲酸酯(97mg，0.26mmol)混合物的DMF(2mL)在95℃加热16小时。用乙酸乙酯稀释反应混合物，用水和盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，并浓缩。用1/1的乙酸乙酯/己烷进行硅胶柱层析来纯化残余物，得到回收的[3-甲基-1-[[[(4-甲基苯基)磺酰基]氧基]甲基]丁基]-1，1-二甲基乙基氨基甲酸酯(30mg，54％)和化合物4a(30mg，37％)，MS(CI)m/z528.0，530.0(MH⁺-Boc)。

步骤4B：3-[2(R)-氨基-2-(异丁基)乙基]-5-(2-氯-3-甲氧苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮4b的制备

向含化合物4a(30mg，0.048mmol)的DCM(1mL)溶液加入TFA(0.1mL，1.3mmol)并在室温搅拌1.5小时。浓缩后，将残余物加入DCM，随后加入饱和NaHCO₃水溶液。用DCM萃取该水层。合并有机提取物并用Na₂SO₄干燥，浓缩得到化合物4b。MS(CI)m/z 528.0，530.0(MH⁺)。

实施例5

3-[2(R)-氨基-2-苯乙基]-5-(2-氟-3-甲氧苯基)-1-[2-氟-6-甲基磺酰基苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

步骤5A：3-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-2-苯乙基]-5-(2-氟-3-甲氧苯基)-1-[2，6-二氟苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮5a的制备

向含化合物1f.l(28g，56mmol)的二氯甲烷(200mL)中通过漏斗逐滴加入含二-叔丁基重碳酸酯(di-tert-butyldicarbonate)(12g，56mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液。将该反应混合物在室温搅拌2小时，LC-MS起始材料耗尽。通过真空浓缩该反应混合物得到浅黄色固体的所需产物5a。

步骤5B：3-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-2-苯乙基]-5-(2-氟-3-甲氧苯基)-1-[2-氟-6-甲硫基苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮5b的制备

向含化合物5a(33g，56mmol)的干躁DMSO(100mL)溶液中在氮气下加入硫代甲醇钠(4.0g，56mmol)。在氮气下将该反应混合物加热至100℃，1小时。再加入0.28当量的硫代甲醇钠(1.1g，16mmmol)，并在氮气下该反应混合物加热至100℃，1小时。冷却该反应混合物，并在乙醚和水之间分配。用饱和的碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。用硅胶快速层析通过含50％乙酸乙酯的己烷洗脱来纯化粗产物，得到浅黄色固体的化合物5b(27g，44mmol，78％)。

步骤5C：3-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-2-苯乙基]-5-(2-氟-3-甲氧苯)-[2-氟-6-甲硫基苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮5c的制备

向含化合物5b(27g，44mmol)的二氯甲烷(400mL)水溶液中加入3-氯过氧化安息香酸(mCPBA，30g，180mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌过夜。将该反应混合物在二氯甲烷与水之间分配。用饱和的碳酸氢钠和盐水洗涤该有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。用硅胶快速层析通过含50％乙酸乙酯的己烷洗脱来纯化粗产物，得到所需的浅黄色固体的化合物5c(15g，24mmol，53％)。

步骤5D：3-[2(R)-氨基-2-苯乙基]-5-(2-氟-3-甲氧苯基)-1-[2-氟-6-甲基磺酰基苯甲基]-6-甲基-嘧啶-(1H，3H)-二酮5-1的制备

向含化合物5c(10g，15mmol)的无水二氯甲烷溶液(60mL)中加入三氟乙酸(TFA，16mL)。将该反应混合物在室温搅拌4小时。将该反应混合物浓缩，并在乙酸乙酯与稀NaOH水溶液之间分配。

用饱和的碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤该有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到棕褐色的固体5-1(8.0g，14mmol，94％)。

实施例6

3-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-2-苯基乙基]-5-(3-羟基苯基)-1-[2-氯-6-氟苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

步骤6A：3-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-2-苯基乙基]-5-溴-1-[2-氯-6-氟苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

将含N-Boc-D-苯基甘氨醇(2.61g，11.0mmol)、5-溴-1-[2-氯-6-(氟)苯甲基]-6-甲基嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮(3.48g，10.0mmol)、PPh3(3.95g，15.0mmol)和二-叔丁基偶氮二甲酸酯(3.45g，15.0mmol)的40mL无水THF在氮气和室温条件下，搅拌16小时。真空去除溶剂，并用EtOAc/己烷(从10％至30％EtOAc递增)作为洗脱剂通过硅胶(约300g)纯化得到4.29g(76％产率)发泡固体形式的6a。MS(M+H)⁺：466.0/468.1.NMR(CDCl₃)，δ，7.41-7.25(m，7H)，7.03-6.97(m，1H)，5.60(d，J＝16.3Hz，1H)，5.55-5.40(m，1H)，5.31(d，J＝16.3Hz，1H)，5.18-4.78(m，1H)，4.24-4.34(m，1H)，4.09(dd，J＝13.2 & 3.0Hz，1H)，2.46(s，3H)，1.37(s，9H)。

步骤6B：3-[2(R)-叔-丁氧基羰基氨基-2-苯基乙基]-5-3-羟基苯基)-1-[2-氯-6-氟苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

化合物6a(4.00g，7.06mmol)、3-羟基苯基硼酸频哪醇酯(pinacolester)(2.33g，10.59mmol)，K₂CO₃(7.8mL，2N溶液，15.5mmol)，andBa(OH)₂(2.6mL饱和溶液)悬浮在管中的130mL甲苯和50mL EtOH中。用N₂将该混合物通气15分钟，加入Pd(PPh₃)₄(404mg，0.35mmol)，封闭该小管，并加热至100℃，16小时。将该混合物冷却至室温后，过滤固体，并蒸发溶液。用硅胶(30-40％EtOAc/己烷)来纯化所得到的残余物得到浅棕色的发泡固体6b(3.96g，98％产率)。MS(M-Boc+H)⁺：480.2/482.2。NMR(CDCl3)，δ，7.38-7.17(m，8H)，7.05-6.96(m，1H)，6.74(d，J＝7.8Hz，1H)，6.68(d，J＝7.8Hz，1H)，6.63(s，1H)，5.85-4.86(m，4H)，4.40-4.23(m，1H)，4.15-3.95(m，1H)，1.22(s，3H)。

通过相同的方法制备化合物3-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-2-苯基乙基]-5-(3-羟基苯基)-1-[2-氟-6-三氟甲基苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮6b.1。

实施例7

3-[2(R)-氨基-2-苯基乙基]-5-(2-氟-3-([4-羟基羰基]-1-丁氧基)苯基)-1-[2，6-二氟苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

步骤7A：3-[2(R)-叔-丁氧基羰基氨基-2-苯基乙基]-5-(2-氟-3-羟基苯基)-1-[2，6-二氟苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮的制备

在-78℃在N₂下，向干二氯甲烷(20mL)中的1f.1盐酸盐(2.13g，4mmol)中缓慢加入溶于二氯甲烷中的BBr₃(1M，16mL，4当量)。然后将该混合物搅拌过夜，同时温度逐步提升至室温。通过N₂净化来去除溶剂和过量的BBr₃，其可得到黄色固体。将该固体溶解在MeOH中来破坏残留的BBr₃并随后再次用N₂净化来浓缩。将所得到的固体悬浮在二氯甲烷(50mL)，并加入TEA直到pH＞8。加入Boc酐(698mg，0.8当量)，并搅拌几小时。TLC与HPLC-MS表明反应完成。将该混合物浓缩并在水与乙酸乙酯分配。分离有机层，干燥并浓缩，并用硅胶层析将残余物纯化得到7a(1.5g)。MS(M-Boc+H)⁺：518.4。

步骤7B：3-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-2-苯基乙基]-5-(2-氟-3-([4-羟基羰基]-1-丁氧基)苯基)-1-[2，6-二氟苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)二酮的制备

向含Boc保护的苯酚7a(581mg，1.0mmol)的无水DMF(5L)中加入5-溴戊酸甲酯(234mg，1.2mmol)和K₂CO₃(690mg，5.0mmol)。在50℃将该混合物剧烈搅拌5小时。向搅拌的混合物加入LiOH(240mg，10mmol)，随后加入MeOH(10mL)和水(10mL)。将该混合物在80℃加热1小时。将该混合物冷却至室温，用饱和的柠檬酸溶液酸化至pH＝3，用乙酸乙酯提取。用水洗涤该有机层，干燥并浓缩得到油状物，其用层析(己烷/乙酸乙酯＝1/1)来纯化得到7b(0.68g，泡沫状)。MS(M-Boc+H)⁺：582.1。NMR(CDCl₃)，δ，7.39-6.79(m，11H)，5.76(d，J＝7.5Hz，1H)，5.45 & 5.40(2m，1H)，5.35-4.879(m，2H)，4.41-4.28(m，1H)，4.10-4.5(m，3H)，2.46-2.42(m，2H)，2.13(s，3H)，1.88-1.80(m，4H)，1.38(s，9H).

步骤7C：3-[2(R)-氨基-2-苯基乙基]-5-(2-氟-3-([4-羟基羰基]-1-丁氧基)苯基)-1-[2，6-二氟苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮的制备

将化合物7b(0.68g)在含4N HCl的二噁烷(5mL)中处理2小时。用制备HPLC将反应混合物浓缩并纯化。所需的化合物7-1起初以TFA的盐形式获得，随后在HPLC上去盐得到游离的氨基酸产物。通过将7-1游离碱悬浮在50mL水中制备钠盐，随后逐步加入0.2NaOH直到所有材料溶解。该溶液的pH约为9。将该溶液冻干得到化合物7-1钠盐(395mg)。MS(M+1)⁺：582.3。NMR(DMSO-d₆)，δ：7.47-7.37(m，1H)，7.27-7.03(2m，9H)，6.75-6.71(m，0.5H)，6.61-6.57(m，0.5H)，5.22-5.20(m，2H)，4.15-4.04(m，1H)，4.06(t，J＝5.7Hz，2H)，3.96-3.82(m，2H)，2.30(t，J＝7.5Hz，2H)，2.13(s，3H)，1.78-1.63(m，4H)。

根据上述步骤制备以下化合物：

用诸如化合物6b和6b.1的羟基化合物作为起始，随后实施步骤7B与7C的步骤，制备以下化合物：

实施例8

3-[2(R)-甲基氨基-2-苯基乙基]-5-(2-氟-3-([4-羟基羰基]-1-丁氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

步骤8A：N-Boc-N-甲基-D-苯基甘氨醇

在氮气下向圆形烧瓶中加入LAH(1.62g，5.0当量)，随后缓慢加入无水THF(200mL)。加入N-Boc-D-苯基甘氨醇(10g，42.7mmol)，在N₂下将该反应混合物回流过夜。将该混合物冷却至室温，随后至0℃并加入NaOH(10％溶液)直到没有气泡产生。在中和过程中再加入200mLTHF，随后加入50g NaSO₄。搅拌后，过滤该混合物，并用THF洗涤该固体。将该合并的溶液浓缩得到6.2g无色油状物。向该油状物加入二-叔-丁基重碳酸酯(Boc₂O，13.8g，5mmol)。立刻形成气泡，用甲苯(10mL)稀释该混合物，然后在100℃加热0.5小时。首先用己烷/乙酸乙酯(8/2)，随后用己烷/乙酸乙酯(2/8)进行短柱层析来洗去Boc₂O，得到化合物8a(9.0g，产率＝85％)。MS(M-Boc+H)⁺：152.2。NMR(CDCl₃)，δ，7.38-7.22(m，5H)，5.25-5.15(m，1H)，4.05-4.00(m，2H)，2.70(s，3H)，1.66(br，1H)，1.48(s，9H)。

步骤8B：3-[2(R)-{N-叔丁氧基羰基-N-甲基氨基}-2-苯基乙基]-5-溴-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

向干燥THF中的Boc-N-甲基-D-苯基甘氨醇8a(8.9g，35mmol)和5-溴-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮1d(12g，31.5mmol)中加入三苯基膦(12g，45.6mmol)，随后加入二-叔丁基偶氮二碳酸酯(10.5g，45.6mmol)。在室温将该混合物搅拌过夜。浓缩该混合物，并用柱层析来纯化得到21g的白色泡沫8b。NMR显示其含50％的副产物(t-BuO₂CNHNHCO₂-tBu)。MS(M-Boc+H)⁺：512.2，514.2.NMR(CDCl₃)，δ，7.55(d，J＝7.8Hz，1H)，7.45-7.20(m，7H)，5.90-5.18(m，3H)，4.95-4.80(m，1H)，4.28(dd，J＝17.1 & 5.4Hz，1H)，2.56(s，1.5H)，2.50(s，3H)，2.41(s，1.5H)，1.42(s，9H)。

步骤8C：3-[2(R)-{N-叔丁氧基羰基-N-甲基氨基}-2-苯基乙基]-5-(2-氟-3-甲氧基苯基)-1-(2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

向30mL二噁烷和6mL水混合物中的溴化物8b(2.7g，4.4mmol)中加入2-氟-3-甲氧基苯基硼酸(1.48g，2.0当量)和Na₂CO₃(3.3g，7当量)。用N₂气将该混合物净化15分钟，随后加入Pd(PPh₃)₄(500mg)。利用剧烈搅拌在100℃搅拌12小时。并浓缩去除二噁烷。将该混合物在乙酸乙酯与水之间分配。分离有机层。用Na₂SO₄干燥，随后通过柱层析纯化得到885mg的8c(33％)。MS(M-Boc+H)⁺：560.3。

步骤8D：3-[2(R)-{N-叔丁氧基羰基-N-甲基氨基}-2-苯基乙基]-5-(2-氟-3-羟基苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

将化合物8c(885mg，1.34mmol)溶解在二氯甲烷(50mL)中，随后在N₂下冷却至-78℃，并缓慢加入BBr₃(1M在二氯甲烷中，5.2mL，4.0当量)。通过搅拌过夜将该混合物缓慢升温至室温。用N₂流浓缩该混合物，用MeOH(10mL)处理，再次浓缩来去除HBr。加入THF(50mL)和三乙胺直到混合物为碱性。加入Boc₂O(2.33g，0.8当量)搅拌该混合物直到在TLC和HPLC上没有观察到游离的胺。过滤该混合物，浓缩并在EtOAc/H₂O之间分配。分离有机层并浓缩得到油状物，其通过柱层析得到64mg的8d(53％产率)。MS(M-Boc+H)⁺：546.3。NMR(CDCl₃)，δ，7.55(1H，d，J＝7.8Hz，1H)，7.46-7.38(m，1H)，7.37-7.22(m，6H)，7.17-6.92(m，2H)，6.76-6.68(m，1H)，6.08-5.36(m，3H)，5.36-5.18(m，1H)，4.87-4.83(m，1H)，3.31-4.20(m，1H)，2.70(s，3H)，2.16-2.10(m，3H)，1.42(s，9H).

步骤8E：3-[2(R)-{N-叔丁氧基羰基-N-甲基氨基}-2-苯基乙基]-5-(2-氟-3-([4-羟基羰基]-1-丁氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

将化合物8d(400mg，0.62mmol)溶解在DMF(5mL，无水)，随后加入5-溴戊酸甲酯(107微升，1.2当量)，随后加入粉状K₂CO₃(430mg，5.0当量)。50℃加热该混合物3小时。加入MeOH(10mL)和水(10mL)，随后加入LiOH(148mg，10当量)。将该混合物加热至80℃，几小时。将该混合物冷却至室温，用无水NaHSO₄酸化至pH＝3。将该粗产物在乙酸乙酯/H₂O之间分配。分离有机层，用柱层析纯化(己烷/乙酸乙酯4/6)得到7e(300mg，65％)。MS(M-Boc+H)⁺：646 3。

步骤8F：3-[2(R)-甲基氨基-2-苯基乙基]-5-(2-氟-3-([4-羟基羰基]-1-丁氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

将化合物8e溶解在1.5mL的二氯甲烷中，并加入1.5mL的TFA。在室温将该混合物搅拌该混合物1小时，浓缩去除TFA，在EtOAc/H₂O分配，然后加入饱和的NaHCO₃来得到中性水溶液。分离有机层，浓缩，并用层析来纯化(以二氯甲烷/MeOH 90/10洗脱剂)。将所得到的化合物8-1悬浮在水(20mL)，然后逐步加入0.1N NaOH至pH＝9，连续超声直至所有材料溶解。将该溶液冻干得到120mg钠盐形式的8-1。MS(M+H)⁺：646.4.NMR(CDCl₃)，δ，7.40(d，J＝7.5Hz，1H)，7.37-7.14(m，8H)，6.98-6.81(m，2H)，6.69(t，J＝7.5Hz，0.5H)，6.58(t，J＝6.0Hz，0.5H)，5.38(s，2H)，4.32-4.20(m，1H)，4.10-3.81(m，2H)，3.81-3.75(m，2H)，2.65-2.35(br，2H)，2.18-2.04(m，3H)，1.95(s，3H)，1.78-1.50(m，4H)。t_R＝1.330(方法1)

实施例9

3-[(1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(3-([5-羟基羰基]-1-戊氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

步骤9A：5-溴-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-3-[N-(苯甲氧基羰基)-1(R)-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮9a

用N-(苯甲氧基羰基)-R-1-羟基甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉(1.96g，6.6mmol，通步骤2A的硼烷还原制备自(R)-1，2，3，4-四氢-1-异喹啉羧酸)和三苯膦(2.36g，9.0mmol)在室温处理含5-溴-1-(2-氟-6-三氟甲基苯甲基)-6-甲基尿嘧啶1d(2.29g，6.0mmol)的THF(20mL)，随后在5分钟内分几次加入二-叔丁基偶氮二甲酸酯(2.07g，9.0mmol)。在室温将混合物搅拌16小时，浓缩，利用2/3的乙酸乙酯/己烷进行硅胶柱层析来纯化，得到化合物9a(3.96g，100％)，MS(CI)m/z 660.2，662.2(MH⁺)。

步骤9B：5-(3-羟基苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-3-[N-(苯甲氧基羰基)-1(R)-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮9b的制备

向含化合物9a(3.3g，5.0mmol)的二噁烷/水(90/10mL)中加入3-羟基苯基硼酸(1.38g，10mmol)和Na₂CO₃(3.18g，30mmol)。用氮气对该混合物脱氧15分钟，加入四(三苯基膦)钯(0)(0.58g，0.5mmol)，然后将该混合物在90℃加热16小时。蒸发该反应混合物，并在EtOAc与水之间分配。用盐水洗涤该有机层，用Na₂SO₄干燥，浓缩，并用2/3的乙酸乙酯/己烷进行硅胶柱层析来纯化，得到化合物9b(3.12g，93％)。MS(CI)m/z 674.0(MH⁺)。

步骤9C：3-[N-(苯甲氧基羰基)-(1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(3-([5-羟基羰基]-1-戊氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮9c

向含化合物9b(168mg，0.25mmol)的DMF(1mL)中加入6-溴几酸乙酯(0.053mL，0.3mmol)和K₂CO₃(172mg，1.25mmol)。将该混合物在80℃加热并剧烈搅拌5小时。随后加入NaOH(0.1g，2.5mmol)和MeOH/H₂O (1∶1，4mL)，并在80℃加热1小时。蒸发反应混合物，并在EtOAc和1N HCl(使水相的pH为3)之间分配。用盐水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥，浓缩，用2/1的乙酸乙酯/己烷进行硅胶柱层析来纯化，得到化合物9c(0.14g，70％)。MS(CI)m/z 788.3(MH⁺)。

步骤9D：3-[(1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(3-([5-羟基羰基]-1-戊氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮9-1的制备

将化合物9c(0.14g，0.18mmol)溶解在80％AcOH(10mL)中，并在1个大气压下，在Pd/C(14mg)存在下，用H₂在室温氢化12小时。经Celite过滤该混合物，蒸发，在EtOAc和饱和NaHCO₃溶液之间分配(使水相pH为6-7)。用水和盐水来洗涤该有机层，用Na₂S0₄干燥，浓缩得到化合物4(0.114g，98％)。MS(CI)m/z 654.4(MH⁺)。

根据上述步骤制备以下化合物：

实施例10

3-[(N-甲基-1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(3-[(5-羟基羰基}-1-戊氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

步骤10A：3-[(N-甲基-1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-3-([5-羟基羰基]-1-戊氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮10-1的制备

在室温下将含化合物9-1(10mg，0.015mmol)和甲醛(7.5M水溶液；4μL，0.03mmol)的THF搅拌5分钟。加入硼烷吡啶混合物(8M；7.5μL)并搅拌1小时。浓缩后，用制备的LCMS纯化残余物得到化合物10-1。MS(CI)m/z 668.4(MH⁺)。

根据上述步骤制备以下化合物：

实施例11

3-(1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(2-氟-3-([4-羟基羰基]-1-丁氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

步骤11A：5-(2-氟-3-甲氧基苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-3-[N-(苯甲氧基羰基)-1(R)-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮11a

向含化合物9a(0.66g，1.0mmol)的二噁烷/水(18/2mL)中加入2-氟-3-甲氧基苯基硼酸(0.34g，2.0mmol)和Na₂CO₃(0.64g，6.0mmol)。用氮将混合物脱氧15分钟，加入四(三苯基膦)钯(0)(0.12g，0.1mmol)，将该反应混合物在90℃加热16小时。蒸发所述反应混合物，并在EtOAc与H₂O之间分配。用盐水洗涤该有机层，干燥，浓缩，并用2/3至1/1的乙酸乙酯/己烷进行硅胶柱层析来纯化，得到化合物11a(0.57g，81％)。MS(CI)m/z 705.9(MH⁺)。

步骤11B：5-(2-氟-3-羟基苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-3-[1(R)-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-嘧啶-2，4(1H，3H))-二酮11b的制备

在-78℃向含化合物11a(1.51g，2.14mmol)的干燥二氯甲烷(15mL)中加入BBr₃(1M在二氯甲烷中，10.7mL，10.7mmol)。将该混合物搅拌16小时，同时将温度逐步升高至室温。通过用氮净化将该反应混合物蒸发。加入MeOH并再次用氮蒸发。将该残余物加入二氯甲烷(5mL)中，并加入己烷(100mL)。过滤所得到的黄色固体，用己烷洗涤，并干燥得到粗化合物11b。MS(CI)m/z 558.0(MH⁺)。

步骤11C：5-(2-氟-3-羟基苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-3-[N-(叔丁氧基羰基)-1(R)-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮11c的制备

向含化合物11b的二氯甲烷(15mL)中加入Et₃N(约1.2mL)直到pH＞8，随后加入Boc₂O(0.37g，1.7mmol)。将该混合物搅拌12小时，蒸发并在EtOAc与H₂O之间分配。用盐水洗涤该有机层，用Na₂SO₄干燥，浓缩，用2/3至1/1的乙酸乙酯/己烷进行硅胶柱层析来纯化，得到化合物11c(1.2g，85％)。MS(CI)m/z 558.0(MH⁺-Boc)。

步骤11D：3-[N-(叔-丁氧基羰基)-1(R)-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(2-氟-3-([4-羟基羰基]-1-丁氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮11-1的制备

向含化合物11c(0.17g，0.26mmol)的DMF(1mL)中加入5-溴戊酸甲酯(0.044mL，0.31mmol)和K₂CO₃(0.18，1.3mmol)。将该混合物在80℃加热并剧烈搅拌5小时。随后加入NaOH(0.1g，2.6mmol)和MeOH/H₂O(1∶1，4mL)，并在80℃加热1小时。蒸发该反应混合物，并在EtOAc和1N HCl之间分配(使水相pH为3)。用盐水洗涤该有机层，用Na₂SO₄干燥，浓缩，用3/1的乙酸乙酯/己烷进行硅胶柱层析来纯化，得到化合物11d(0.15g，77％).MS(CI)m/z 658.0(MH⁺-Boc)

步骤11E：3-[(1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(2-氟-3-([4-羟基羰基]-1-丁氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮的制备

向含11d(0.15g，0.2mmol)的DCM(2mL)溶液中加入TFA(0.4mL，5.2mmol)，然后将该混合物在室温下搅拌1.5小时。浓缩后，将该残余物加入EtOAc中，然后加入饱和的NaHCO₃水溶液。分离有机层，用盐水洗涤该有机层，用Na₂SO₄干燥，浓缩得到化合物11-1(0.11g，84％).MS(CI)m/z 658.0(MH⁺)。

根据上述步骤制备以下化合物：

实施例12

3-[N-甲基-1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(2-氟-3-([4-羟基羰基]-1-丁氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

步骤12A：3-[(N-甲基-1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(2-氟-3-([4-羟基羰基]-1-丁氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮12-1的制备

将含化合物11-1(15mg，0.023mmol)和甲醛(7.5M含水溶液；6μL，0.045mmol)的THF溶液在室温下搅拌5分钟。加入硼烷嘧啶复合物(8M；12μL)并搅拌1小时。浓缩后，用制备LCMS纯化得到化合物12-1。MS(CI)m/z 672.0(MH⁺)。

根据上述步骤制备以下化合物：

实施例13

3-[(1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(2-氯-3-([4-羟基羰基]-1-丁氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

步骤13A：N-苯甲氧基羰基-1-羟基甲基-D-1，2，3，4-四氢异喹啉13a的

制备

5分钟内向含N-苯甲氧基羰基-D-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-羧酸(3.11g，10mmol，制备自商业销售的D-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-羧酸和O-苯甲氧基羰基-N-羟基琥珀酸胺)的THF(10mL)中加入BH₃(THF中的1M溶液；30mL，30mmol)，随后将该反应混合物搅拌3小时。加入含乙酸(9mL)的MeOH(90mL)并将混合物搅拌30分钟。蒸发溶剂，将残余物加入EtOAc并用饱和的NaHCO₃(90mL，水相pH 7-8)溶液和盐水洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层并浓缩得到化合物13a(2.97g，100％)。MS(CI)m/z253.9(MH⁺-CO₂)，297.9(MH⁺)；t_R＝2.695min(方法4)。

步骤13B：N-苯甲氧基羰基-1-(甲烷磺酰氧基甲基)-D-1，2，3，4-四氢-异喹啉13b的制备

向含化合物13a(6.15g，20.7mmol)的二氯甲烷(69mL)溶液中加入Et₃N(3.17mL，22.8mmol)，然后加入甲烷磺酰氯(1.76mL，22.8mmol)。在室温下搅拌该反应物过夜，蒸发并在EtOAc和H₂O之间分配。用盐水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥，浓缩得到化合物13b(7.8g，100％)。MS(CI)m/z 376.0(MH⁺)；t_R＝2.666分钟(方法4)。

步骤13C：3-[(1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(2-氯-3-甲氧基苯基)-1-[9-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮13c的制备

根据步骤3G的程序，N-苯甲氧基羰基-1-(甲烷磺酰氧基甲基)-D-1，2，3，4-四氢-异喹啉13b(6.57g，17.52mmol)与5-(2-氯-3-甲氧基苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮3f(5.14g，12mmol)形成3-[(1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(2-氯-3-甲氧基苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮13c(5.73g，68％)。MS(CI)m/z 708.0，710.0(MH⁺)。

步骤13D：3-[(1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(2-氯-3-([4-羟基羰基]-1-丁氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮13-1的制备

根据步骤7A至7C所列出的方法，利用3-[(1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(2-氯-3-甲氧基苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮13c作为起始材料，合成以下化合物。

实施例14

3-[(1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(2-氟-3-([羟基羰基]甲氧基-1-丙氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

步骤14A：3-[(1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(2-氟-3-([3-羟基-1-丙氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮14a的制备

向含化合物11c(170mg，0.26mmol)的DMF(1mL)中加入溴丙醇(43mg，0.31mmol)和K₂CO₃(180mg，1.30mmol)。将该混合物在80℃加热过夜。蒸发该反应混合物，并在EtOAc和H₂O之间分配。用盐水洗涤该有机层，用Na₂SO₄干燥，浓缩，并在制备TLC板上用3/2的乙酸乙酯/己烷来纯化，得到化合物14a(0.13g，70％)。MS(CI)m/z 616.0(MH⁺-Boc)。

步骤14B：3-[(1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(2-氟-3-([叔丁氧基羰基]甲氧基-1-丙氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮14b的制备

向含化合物14a(130mg，0.18mmol)的甲苯(1mL)中加入叔丁基溴化乙酸酯(0.04mL，0.27mmol)、四丁基胺硫酸氢盐(hydrogensulfate)(3mg，0.009mmol)和粉末状NaOH(32mg，0.81mmol)。在室温将该混合物剧烈搅拌24小时并在EtOAc与H₂O之间分配。用盐水洗涤该有机层，用Na₂SO₄干燥，浓缩得到粗化合物14b。MS(CI)m/z 674.0(MH⁺-Boc-tBu)，730.1(MH⁺-Boc)。

步骤14C：3-[(1-R-1，2，3，4-四氢异喹啉)甲基]-5-(2-氟-3-([羟基羰基]甲氧基-1-丙氧基)苯基)-1-[2-氟-6-(三氟甲基)苯甲基]-6-甲基-嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮14-1的制备

在室温下用TFA(0.36mL，4.67mmol)处理含化合物14b的二氯甲烷(3mL)过夜，浓缩，并在制备TLC板上用含10％MeOH的DCM纯化，得到化合物14-1(60mg，49％两步)。MS(CI)m/z 674.0(MH⁺)。

根据上述步骤合成以下化合物：

No. R_la R₃ 质谱 M.W. t_R(方法)14-1 F CH₃ 674.0 673.63 6.033(6)14-2 Cl H 676.1 676.06 22.40(5)

应理解，尽管为了说明目的，本文描述了本发明的具体实施方案，但在不偏离本发明精神和范围的前提下，可对其作出多种修改。因此，除所附的权利要求外，本发明并不受到其它限制。