一种查尔酮肟及其组合物、制备方法和应用

摘要

本发明涉及下述式(1)表示的查尔酮肟，还涉及该化合物的组合物、制备方法和在治疗肿瘤的应用。本发明式(1)化合物通过2′，4′－二羟基－6′－甲氧基－3′，5′－二甲基查尔酮与盐酸羟胺在吡啶中经加热回流反应得到。该化合物溶解性好，可以直接注射给药，并且经试验表明，能显著抑制血管内皮生长因子受体、HER2受体、PDGFR受体酪氨酸激酶的活性，抑制乳腺癌、肝癌等细胞的体外生长，对ECV304细胞中KDR磷酸化、MDA－MB－453细胞中HER2磷酸化、C6细胞中PDGFR受体磷酸化均有明显的抑制作用，呈现浓度效应关系，而KDR受体、HER2受体、PDGFR受体蛋白表达水平不受其影响，因而显示了良好的抗肿瘤活性，可用于治疗肿瘤。

说明书

技术领域

本发明涉及一种查尔酮肟，具体来说是涉及2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查尔酮肟，并涉及其制备方法，以其为活性成分的组合物和在治疗肿瘤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是一种严重危害人类健康的常见病，已成为人类仅次于脑血管病的第二位死因。细胞毒类的肿瘤化疗药物已发展几十年，治疗肿瘤已接近或达到平台期，迫切需要新的治疗药物或方法。

许多肿瘤中存在信号转导途径的异常，如血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)在血管生成在多种肿瘤的发生、发展中起重要作用，上皮细胞肿瘤中常见EGFR家族受体的过度表达，乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌等常见上皮生长因子受体2(HER2受体)的扩增和过度表达，胶质瘤中常见血小板衍生性生长因子受体(PDGFR)家族的过度表达等。这些受体的过度表达或生长因子的过度表达导致受体的过度激活以及胞内激酶突变激活等，导致其下游信号途径的增强，激活Ras/MAPK、PI3K/AKT等信号途径，最终导致细胞的转化、增殖和抵抗细胞凋亡、促进细胞存活。因此，许多学者致力于从阻断信号转导途径角度来研究新的抗肿瘤药物，并且已取得了巨大的突破，如针对HER2受体的人源化抗体Herceptin^TM已被美国FDA批准用于HER2过表达的乳腺癌的治疗、针对EGFR酪氨酸激酶的Iressa治疗非小细胞肺癌等，针对VEGF的抗体Avastin治疗晚期转移性结肠癌。血管生成是指从已存在的血管床产生新血管的过程，许多疾病如肿瘤，可出现持续的、不可控制的血管生成。血管生成不仅是肿瘤生长所必需的，而且也是导致肿瘤向远处转移的原因。肿瘤血管生成，是肿瘤防治研究中的一个新领域。VEGF是血管生成的强烈刺激因子，其受体的激活是血管生成步骤中重要的一步，干扰血管内皮生长因子受体(VEGFR)信号转导途径已成为肿瘤治疗的新策略。目前进入临床试验的针对血管内皮生长因子及其受体的抗血管生成抑制剂有SU5416、SU6668、ZK222584等，其中SU5416在进入临床试验后由于疗效不佳被终止。SU11248同样是针对PDGFR、VEGFR、FLT3、KIT等多种受体酪氨酸激酶抑制剂对白血病、实体瘤表现有明显的效果，很可能于近期批准为新的抗肿瘤药物。血管生成是一个复杂的过程，除了VEGF/VEGFR信号途径外，许多受体酪氨酸激酶参与血管生成，EGFR、HER2、PDGFR、FGFR等均能促进血管生成，因此靶向多种受体酪氨酸激酶的抑制剂的多靶点药物在临床上表现更好的疗效，具有着更好的前景，是当代国际上抗肿瘤新靶点药物研究的主要方向。抑制多种受体酪氨酸激酶不仅能更好地抑制与肿瘤发生发展密切相关的血管生成，同时对高表达酪氨酸激酶受体的肿瘤细胞具有很好的生长抑制作用，即抑制血管生成又能抑制肿瘤细胞本身的生长，因此作为抗肿瘤药物具有显著的优势。

国际上已发现查尔酮衍生物具有抗血管生成作用(参考文献：WO 01/46110)。国内，我们从植物中发现了一个抗血管生成天然查尔酮衍生物(2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查尔酮，DMD)并证明其具有显著的体内抗瘤作用(参考文献：Mol Pharmacol，2005，67：1444-1450)。但天然查尔酮普遍溶解性较差，难以通过注射给药，而口服的生物利用度较低。

发明内容

本发明的目的在于开发出一种具有抗癌作用且溶解性好的查尔酮衍生物，另一目的是提供这种化合物的制备方法，进一步的目的是提供以这种化合物为活性成分的组合物，另一目的是提供这种化合物及其组合物在预防和治疗肿瘤中的应用。

本发明通过2′，4′-二羟基-6’-甲氧基-3′，5′-二甲基查尔酮与盐酸羟胺在吡啶中经加热回流反应得到2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查尔酮肟，该化合物溶解性好，并且以这种化合物为活性成分制成了有抗肿瘤作用的组合物，从而实现了本发明的目的。

本发明的一种查尔酮肟，其特征是结构由式(1)表示：

式(1)

本发明的一种查尔酮肟的制备方法，其特征是2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查尔酮与盐酸羟胺在吡啶中溶解，加热回流，分离，纯化得到产物。

所述的2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查尔酮可以用常规的方法制备，例如参考文献：张凤仙等，植物学报，1990，32(6)：469-472，所述的回流时间可以是2小时，所述的分离可以采用通常的方法，例如将回流液在水中或酸性水中沉淀，然后过滤收集沉淀，所述的纯化是将上述沉淀用乙酸乙酯溶解，溶液用水洗后减压浓缩至干，上硅胶柱，以体积比6∶1石油醚-丙酮洗脱分离。

本发明的组合物含有治疗有效量的上述式(1)的化合物为活性成分，以及含有一种或一种以上药学上可以接受的载体。

上文所述药学上可以接受的载体是指药学领域常规的药物载体，本发明的组合物可以使用通常的药物剂型，例如注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液、悬浮剂或乳剂的形式，通过口服、静脉、肌肉、皮肤给药用于预防和治疗恶性肿瘤，各种剂型可以按照药物领域的常规方法制备。

本发明上述式(1)的化合物及其组合物可用于治疗肿瘤。

本发明的查尔酮肟溶解性好，可以直接注射给药，并且经试验表明，能显著抑制血管内皮生长因子受体、HER2受体、PDGFR受体酪氨酸激酶的活性，抑制乳腺癌、肝癌等细胞的体外生长，对ECV304细胞中KDR磷酸化、MDA-MB-453细胞中HER2磷酸化、C6细胞中PDGFR受体磷酸化均有明显的抑制作用，呈现浓度效应关系，而KDR受体、HER2受体、PDGFR受体蛋白表达水平不受其影响。

附图说明

图1：DMDO对血管内皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化(phospho-KDR)的抑制作用

图2：DMDO对上皮生长因子受体2酪氨酸激酶磷酸化(phospho-HER2)的抑制作用

图3：DMDO对血小板衍生性生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化(phospho-PDGFR)的抑制作用

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：式(1)的化合物的制备

取2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查尔酮100mg、盐酸羟胺100mg，加入7mL吡啶溶解，加热回流2小时，将反应液倒入50mL 1mol/L的盐酸水溶液中，过滤收集沉淀，用乙酸乙酯溶解，将乙酸乙酯溶液转入一分液漏斗中用水洗三次，减压浓缩至干，上硅胶柱，以石油醚-丙酮(体积比6∶1)洗脱分离获得产物。

实施例2：实施例1产物的鉴定

黄色粉末状固体。正离子HRTOFMS(m/z)：314.1398[C₁₈H₁₉NO₄+H]⁺(计算值：314.1392)。正离子ESIMS：352[M+K]⁺，336[M+Na]⁺，314[M+H]⁺，296[M-H₂O+H]⁺，280，220，208，193，103。¹H NMR(400MHz，acetone-d₆)：7.42(2H，d，J＝8.0Hz，H-2和H-6)，7.30(2H，t，J＝8.0Hz，H-3和H-5)，7.22(1H，t，J＝8.0Hz，H-4)，7.05(1H，d，J＝16Hz，H-β)，6.41(1H，d，J＝16Hz，H-α)，3.53(3H，s，OCH3)，2.11(3H，s，CH₃)，2.09(3H，s，CH₃)；¹³C NMR(100MHz，acetone-d₆)：155.8(C×2)，155.1(C)，151.2(C)，137.6(C)，134.6(CH)，129.4(CH×2)，128.8(CH)，127.5(CH×2)，127.0(CH)，110.0(C)，108.4(C)，107.0(C)，61.0(OCH₃)，9.3(CH₃)，9.2(CH₃)。通过分析，证实实施例1得到的产物是式(1)的化合物，即2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查尔酮肟(DMDO)。

实施例3：DMDO对受体酪氨酸激酶磷酸化的抑制作用

取对数生长期的ECV304(VEGFR2或KDR)、MDA-MB-453(HER2)、C6(PDGFR)细胞，用培养液配成5×10⁵/mL，再将其加入12孔板中，每孔加入1mL。第2天，将培养液吸出，并加入无血清培养液，再加入受试不同浓度DMDO处理30分钟，分别应用抗KDR、抗HER2、抗PDGFR的抗体进行免疫沉淀，再用抗磷酸酪氨酸抗体Western blot检测KDR、HER2、PDGFR磷酸化水平。结果见附图1～3。

实施例4：DMDO对乳腺癌细胞MDA-MB-453、肝癌细胞Hep3B等体外生长的抑制作用

取对数生长的乳腺癌细胞MDA-MB-453、肝癌细胞Hep3B加入96孔板中，每孔100μL含有2000～4000个细胞。再加入药物，每组设3个平行孔，置37℃培养72小时，实验终止前4h加入10μL 5mg/mL MTT液，再培养4h，弃去培养液加入0.2mL DMSO，待结晶溶解后在酶联检测仪上检测570nm波长的每孔的0D值。按下列公式求出生长抑制率，再按BLISS法计算机程序求出半数抑制率(IC50值)。结果见表1。

表1 DMDO对人乳腺癌细胞MDA-MB-453、肝癌细胞Hep3B的体外生长抑制作用

药物浓度(μg/mL)  细胞株及抑制率(％)  MDA-MB-453  Hep3B  0  0.78  1.56  3.125  6.25  12.5  25.0  -  27.8  48.8  66.1  74.9  79.6  83.4  -  -  4.2  10.7  16.3  30.9  84.0