口蹄疫的诊断方法及诊断试剂盒

摘要

本发明提供了一种诊断口蹄疫病毒感染的方法，包括下列步骤：将预定量的试样施加于试纸条的加样区；将一种包括既定标记试剂的检测试剂偶联于试样中的所研究的分析物，从而形成复合物；将该复合物展开到芯吸膜上；以及观测在芯吸膜的预定区域上具有选自来源于FMDV或者可通过免疫反应由FMDV获得的抗原、抗体或半抗原中的至少一种以上的固定相的反应区的外观改变，以确定是否存在口蹄疫病毒感染。本发明还提供了一种用于诊断口蹄疫病毒感染的试剂盒，该试剂盒包含：试纸条1，其包括设置于芯吸膜9的预定区域上的一含有选自来源于FMDV或者可通过免疫反应由FMDV获得的抗原、抗体或半抗原中的至少一种以上的固定相的反应区13，以及一用于确定试剂盒的正常操作的对照区14；和一防止试纸条1被各种污染物污染的壳体20，其包括至少一试样施加口2和一标记窗4，用于观测试纸条上的反应区13和对照区14中的反应结果。

说明书

技术领域

本发明涉及用于诊断受试者口蹄疫病毒(FMDV)感染的方法和试剂盒，更具体地说，通过观测含有选自由FMDV得到的，或者可经由免疫反应由FMDV获得的抗原、抗体或半抗原中的至少一种以上的固定相(其可与作为目标物的动物试样进行免疫反应)的反应区的外观变化而快速检测受试者的FMDV感染的方法和试剂盒。

背景技术

口蹄疫(FMD)是牲畜的破坏性疾病，并且被世界动物卫生组织(Office International des Epizooties)列举为A级病。所有偶蹄类动物物种(牛、猪、绵羊和山羊)均易感，并且该疾病的传染性极强。由于FMD所导致的财政损失可能是巨大的。直接损失是低龄动物死亡、牛奶损失、肉类损失和产出效率下降。与根治或控制有关的成本高，另外，还有由于施加了贸易限制而导致了间接损失。

病原体是口蹄疫病毒(FMDV)，小RNA病毒科(Picornaviridae)口疮病毒属(Aphthovirus)(Bittle等人，1982和Fross等人，1984)。FMDV基因组由大约8,000个核苷酸碱基的单一RNA正链组成。RNA在感染细胞内首先翻译为单一多肽，随后通过病毒编码的蛋白酶裂解，产生四种壳体蛋白(VP1-VP4)和非结构多肽(2C，3A，3ABC和3D)。图3示出了结构和非结构蛋白的编码区。

FMD病毒是抗原异质性的。7种不同血清型已经被识别，即O、A、C、ASIA1，SAT1，SAT2和SAT3(SAT＝南部非洲地区)。FMDV的每一种血清型的抗原不同于其它6种血清型。血清型A病毒的变异性最大，具有30个以上亚型。此外，各血清型可以再分为抗原不同的多个亚型。FMD病毒的血清型是最初通过动物的交叉免疫实验来鉴定的。从被一种血清型感染中恢复过来的动物可抵抗相同血清型的侵袭，但对任何其它血清型仍然是易感的。FMDV的不同血清型具有不同的地理分布。在亚洲，A、O和Asia血清型是最常见的。在欧洲和南美，发现了A、O和C血清型。在非洲，A、O和SAT血清型是占主要的。非洲、亚洲和南美的一些国家是地方性流行区。

FMD的初步诊断通常包括感染动物的典型临床体征的识别。在所有种属中，FMD的临床体征基本相似，但严重程度可以变化很大。主要体征是发热，随后口蹄形成水疱，导致流涎和跛行。通过测定疑似动物中的FMDV-特异性抗原或抗体的存在来进行血清学诊断，通常是通过ELISA和病毒中和试验来进行。

在动物感染FMDV之后，结构蛋白(SPs)和非结构蛋白(NSPs)的特异性抗体开始出现，滴定度增高，并保持很久。因此，特异性FMD病毒抗体在血清中的存在表明，采集样品的动物已经接触了FMD病毒或抗原。

FMD病毒的血清抗体的检测具有几种用处。抗体检测显示了动物的先前感染，此时还没有出现水疱物质。用临床体征诊断FMD可能是困难的，尤其对于绵羊和山羊，它们的临床体征常常是温和的(Barnett，P.V.等人，1999和Callens，M.，K.等人，1998)。此外，几种其它水疱性病毒感染，包括由猪水疱病(SVD)病毒、水疱性口腔炎病毒等引起的那些病毒感染，不能通过临床表现将之与FMDV感染区分开来。FMDV可以在反刍动物建立稳定(persistent)或携带(carrier)阶段，它们不显示FMD的征象。此类携带者动物可以成为该疾病的新爆发的来源。因为这些问题，需要一种快速血清学方法来鉴别感染动物和/或无症状病毒携带动物，并且将它们与接种疫苗的动物分开。该抗体检测方法还能够用于流行病学调查，测定接种的效力。

疫苗接种和感染诱发了结构壳体蛋白的抗体。因此，如果在诊断分析中单独使用壳体蛋白，这将根据结构蛋白的抗体的检测来检测接种疫苗和感染的动物。为此，结构蛋白的抗体试验只能在无疫苗地区，比如美国和英国使用，而不能在建立了疫苗接种的地区使用。但即使在动物接种疫苗的地区，FMD也常常发生。在这种地区，需要可以区分感染与接种疫苗的诊断试验。几个研究报道过，使用FMDV的非结构蛋白，比如2C和3ABC，可以根据检测该病毒的一种或多种非结构蛋白的抗体将已经感染了FMDV的动物与已接种疫苗的动物区分开来(Rodriguez A等人，Mackey Dk等人，Sorensen KJ等人)。

检测FMDV的另一种方法是PCR(聚合酶链式反应)。为了检测FMDV的特异性RNA序列，已经有人开发了RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)分析(Munez等人)。该技术能够提供特异性和高灵敏度，所以当该保存不好的样品中的病毒数量不足以引起组织培养物感染时，它仍可以检测该样品中的FMD病毒RNA。但该方法需要PCR设备和电，这使得它在现场分析中不实用，并且如果PCR反应的抑制物质存在于一些样品中，那么含有病毒或病毒基因组的一些样品将不会获得PCR阳性结果。

发明内容

因此，鉴于以上问题做出了本发明，本发明的目的是提供一种诊断目标动物被口蹄疫病毒感染的方法，该方法使得可以通过采用由动物获得的生物学样品简单而快速地鉴别动物是否感染了病毒。

本发明的另一个目的是提供一种用于实现上述方法的诊断试剂盒。

根据本发明，以上和其它发明目的可以通过提供一种诊断口蹄疫病毒感染的方法来实现，该方法包括下列步骤：

(1)将预定量的试样施加于试纸条的加样区；(2)将一种包括既定标记试剂的检测试剂偶联于试样中的所研究的分析物，从而形成复合物；(3)将该复合物展开到芯吸膜(wicking membrane)上；以及(4)观测在芯吸膜的预定区域上具有选自来源于FMDV或者可通过免疫反应由FMDV获得的抗原、抗体或半抗原中的至少一种以上的固定相的反应区的外观改变，以确定是否存在口蹄疫病毒感染。

根据本发明的诊断方法包括一夹心试验或竞争试验。

作为一种为了实现如上所述的诊断方法的诊断试剂盒，本发明提供了一种用于诊断口蹄疫病毒感染的试剂盒，其包含：

一试纸条1，其包括一含有选自来源于FMDV或者可通过免疫反应由FMDV获得的抗原、抗体或半抗原中的至少一种以上的固定相的反应区13，以及一用于确定试剂盒的正常操作的对照区14，其设置在芯吸膜9的预定区域上；以及

一防止试纸条1被各种污染物污染的壳体20，其包括至少一试样施加口2和一标记窗4，用于观测试纸条1上的反应区13和对照区14中的反应结果。

试样优选是从身体分泌出来的体液，包括血液、血清、血浆、尿、眼泪、唾液、乳等。

此外，所要分析的试样中含有的分析物可以包括含有特异性结合成份的任何物质，其可以是天然形成的或人工赋予的，例如包括抗原呈递物质、抗体(包括单克隆和多克隆抗体)、半抗原和它们的结合物。

另外，固定相(或捕集试剂)是一种特异性结合于分析物的未标记特异性结合成份、指示试剂、辅助特异性结合成份或者类似物，然后捕集该分析物，并且被直接或间接固定于试纸条1的芯吸膜9上。

检测试剂可以扩散或非扩散方式结合于一个垫上，并且包括一种标记试剂，该辅助特异性结合成份和/或一种信号产生系统的组分。该信号产生系统至少包括一种催化剂和溶液。该溶液可以通过催化成员来催化，诱发一种反应，并且由膜表面或内部产生一种可识别的信号。该催化剂可以是酶或非酶。溶液可以进行由该催化剂催化的反应。这种反应产生了大量的信号产生化合物，所述化合物可以被直接或间接检测到。可被这些组分检测到的信号包括光谱、可见信号，电化学信号和其它可电学检测的信号。

具体实施方式

现在，参考附图来详细说明本发明。

图1a-b分别是作为用于本发明的优选实施方式的示例诊断试剂盒的不同的立体图。

该诊断试剂盒包括试纸条1和外壳20。该外壳是将试样由试样施加口2和显色剂施加口3加到滤垫(或染色垫：它是指含有检测试剂的垫)上所必需的。该试剂盒还包括一具有外罩5的主体7，该外罩5包括用于显示试验结果的标记窗4，以及用于适当放置和固定试纸条1的试纸条安装元件6。

外罩5和主体7经由固紧元件8互连。它们是固定试纸条1以及防止与反应区接触或防止其污染所必需的，并且优选由不与在试验中采用的任何其它试剂发生反应的非反应性材料，比如塑料等制成。

如在根据本发明的第一个方面的图1a的构造中所示，如果试样通过施加口2加到滤垫11(还用作染色垫)上，需要单独的显色剂施加口3。显色剂施加口3被设置成具有杯样形状的曲率，以便接收预定量的显色剂。此外，它的下部优选与储藏垫(reservoir pad)10紧密接触，以便防止显色剂流出到试验设备的其它区域。

与图1a的构造不同，如果试样施加口2’刚好位于构成试纸条的储藏垫10’的上部，以便即时将试样加到储藏垫10’上(在这种情况下，储藏垫还具有如在以下实施例中的滤垫的功能，从而，不需要独立的显色剂施加口)，如在根据本发明的第二个方面的图1b的构造中所示，施加口2’被设置成具有杯样形状的曲率，以便接收预定量的试样。此外，它的下部优选与储藏垫紧密接触，以便防止试样流出到试验设备的其它区域。在该情况下，垫11’是一含有检测试剂的染色垫，或者一第二滤垫，或者可以省略。

标记窗4被设计用于从外部观测在构成试纸条1的芯吸膜9上的反应区13和对照区14中发生的改变，并且设置于外罩5上，以便在反应区13和对照区14上即时定位。

此外，外罩5上可以设置既定识别符号，例如，试验日期的符号“日期”，受试者的符号“ID 0000”，对照区的符号“C”，反应区的符号“T”(试验)，样品施加口的符号“S”，显色剂的符号“D”等，这样就可以容易区分试验日期、受试者、试样施加口、显色剂施加口、显示试验结果的标记窗等。这些符号可以是任何字母、数字、图标或类似物，或者是不同于上述那些的它们的任何结合物。

现在，作为优选的实施方式，参考图1a-b和图2来描述构成根据本发明的诊断设备的试纸条的结构。

图1a显示了根据本发明的第一个方面的一个实施方式。本发明试纸条1包括了一芯吸膜9、一储藏垫10、一滤垫11(还用作染色垫)、一吸收垫12，以及在该芯吸膜9上设有的一反应区13和一对照区14。在试纸条1的背面附着用于将试纸条1固定于主壳体7的固定元件6的基底元件15。基底元件15优选由塑料或玻璃板制成。

图1b示出了根据本发明的第二个方面的另一个实施方式。除了一储藏垫10’和一滤垫11’(它还可以用作染色垫)以外，本发明试纸条1’具有与图1a所示的试纸条相同的构造。其各自构造的详细说明是以图1a所示的本发明的第一个方面为基础，而仅仅提到了二者之间的差别。

滤垫11与用于色谱法的芯吸膜9的背面接触，形成用于流体流入到芯吸膜9中的连接通路。滤垫11的背面与储藏垫10接触，形成用于流体在其中流动的一个连接通路。吸收垫12附着于芯吸膜9的上部。在芯吸膜9的预定区域上隔开了一反应区13和一用于确定该试剂盒是否正常操作的对照区14，该反应区13含有至少一个以上的固定相，其特异性结合于一待测分析物、一标记试剂、一辅助特异性结合成份及类似物。

储藏垫10吸收试样，或其它试验所必需的溶液，例如显色剂及类似物，还包括一用于将分析物转移到滤垫或芯吸膜上的毛细管膜。储藏垫10需要具有足以接收试样或显色剂的空间和体积。适于制备储藏垫的材料优选是低分子量蛋白结合物质，包括具有0.45-60μm的孔径的纤维素、聚酯、聚氨酯、玻璃纤维等。

滤垫11过滤出试样中不必要的成分，并且可能含有检测试剂(在该情况下，该滤垫还可以用作染色垫)。如果在滤垫中含有检测试剂，其优点是省略了将检测试剂与试验用试样预混的步骤。作为适于该滤垫11的材料，可以为聚酯、聚氨酯、聚乙酸酯、纤维素、玻璃纤维、具有0.45-0.60μm的孔径的尼龙等。如果适当的话，该储藏垫10和滤垫11可以由相同的材料制成，在这种情况下，检测试剂可以被包含在一个长滤垫11的底部内。

该检测试剂设有一标记试剂、辅助特异性结合成份、和/或一信号产生系统的组成成分，这使得其可以通过肉眼或外部其它仪器来鉴定有意义的分析物的存在。标记检测试剂是本领域技术人员所公知的。此类标记的实例包括催化剂、酶(例如，磷酸酶、过氧化物酶等，更具体地，碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶或类似物，其与酶的底物结合使用)，酶的底物(例如，氮蓝四唑、3，5’，5，5’-四硝基联苯胺(tetranitrobenzidine)、4-甲氧基-1-萘酚、4-氯-1-萘酚、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、酶的化学发光底物，例如，二氯乙烷(dioxethane)，以及它们的衍生物和类似物)，荧光化合物(例如，荧光素、藻胆蛋白、若丹明、它们的衍生物和类似物)，化学发光化合物，放射元素，及类似物。除了这些以外，还可以提到如在第5,728,587号美国专利中所公开的金属溶胶、染料溶胶、颗粒胶乳、颜色指示剂、脂质体中含有的颜料、碳溶胶和非金属溶胶比如硒。此外，该专利的第8-10栏公开了大量的免疫化学标记，作为可用于本发明的诊断方法的标记。

上述标记试剂可以与一种既定辅助特异性结合成份形成缀合物(conjugate)，该既定辅助特异性结合成份具有易结合于所研究的分析物的性能。该辅助特异性结合成份无需特别限制的，包括抗原、抗体、半抗原或类似物，例如蛋白G、蛋白A、蛋白G/A，在分析物是抗体的情况下被认为是充分结合于抗体的材料，以及各种被认为是充分结合于其它抗体IgG和IgM的抗体。这些材料目前可作为重组体从Sigma等公司购得。

从以上可以看出，该检测试剂不是必需包括在滤垫11中。该检测试剂可以设置于显示检测结果的芯吸膜上的反应区13和试样施加口之间的任何位置。该检测试剂可以干燥或冻干状态施加于滤垫11或芯吸膜9的任何上部或内部。然后，如果需要，为了增强试验的灵敏度，反应性等，可以添加多种辅助试剂，比如缓冲剂、洗涤剂、抗凝固储备溶液，或类似物。

另外，试纸条1可以进一步包含一用于确定试剂盒是否正常操作的既定对照试剂。与检测试剂类似，该既定对照试剂还可以设置在滤垫11或芯吸膜9上的反应区13和试样施加口之间的任何位置。该对照试剂可以选自标记蛋白、抗原、抗体及类似物，该物质特异性结合于一固定相(例如，蛋白质、抗原、抗体或类似物)而在芯吸膜9上形成一对照区(或对照带)。这些固定相和对照试剂是本领域的技术人员所公知的。作为可以在对照试剂中包含的标记试剂，可以应用在检测试剂中所述的那些试剂。辅助特异性结合成分不是特别限制的，包括选自抗生物素蛋白、生物素、异硫氰酸荧光素(FITC)、抗FITC小鼠抗体、小鼠免疫球蛋白或抗小鼠免疫球蛋白抗体中的一种物质。

芯吸膜9应该具有充分的空间，并且能够吸收已通过滤垫11的大部分的试样。作为适合于这种芯吸膜的材料的例子，可以是选自尼龙、聚酯、纤维素、聚砜、聚偏二氟乙烯、醋酸纤维素、聚氨酯、玻璃纤维、硝基纤维素或类似物中的至少一种以上材料。

如果使用显色剂，适于显色剂的材料的实例可以包括磷酸盐缓冲剂、盐水、Tris-HCl、水等。需要显色剂的位置为试样施加口2刚好位于滤垫11的上部，以便加样。因此，如在根据图1b的第二个方面的实施方式中那样，如果试样施加口2’位于储藏垫10’上，以便在其上加上预定量的试样，那么显色剂就不是特别需要的。

如果标记检测试剂的复合物含有待测的分析物，该复合物与位于芯吸膜9的反应区13上的固定相相结合，然后导致外部可识别的变化。可以用作这种固定相的材料可以包括选自抗原、抗体或半抗原中的至少一种以上，该抗原、抗体或半抗原构成了口蹄疫病毒，或者可以通过免疫反应由此获得。

可以用作抗原的材料包括非结构和/或结构蛋白。结构蛋白包括灭活FMDV分解材料或其成分、VP1-VP4多肽。非结构蛋白可以包括选自前导肽(Lb)、2B、2C、3A、3D、3AB和3ABC中的至少一种以上的多肽。图3示出了包括结构和非结构蛋白的聚蛋白前体的图谱。

具有相同名称的结构蛋白还可以在组成氨基酸上显示一些差别，这取决于FMDV的血清学分类。优选地，本发明中采用的结构蛋白不是特别限制的，只要它们可以特异地与用所有血清型形成的抗体产生反应。这些结构蛋白的实例包括、但不限于用SEQ ID NO：118表示的VP1。

然而，即使在上述结构蛋白单独用作构建诊断试剂盒的固定相的时候，也存在这样的情况，那就是，对于未接种疫苗的牛可以精确地诊断该牛是否感染了口蹄疫病毒，但难以区分感染病毒的牛与接种疫苗的牛。除了结构蛋白以外，在疫苗生产中采用的抗原的实例包括非结构蛋白3D。因此，即使当非结构蛋白3D用作固定相时，也存在如上所述的相同限制。非结构蛋白3D的例子在SEQ ID NO：121中示出。

非结构蛋白(除了3D以外)是没有在传统疫苗生产中使用的蛋白，这些蛋白的抗体仅仅可以在病毒感染的动物中观测到。因此，当该蛋白作为固定相应用时，可以做出对感染动物的准确诊断。当然，这种非结构蛋白也在其组成氨基酸上具有一些差别，这取决于FMDV的各血清型。可用的非结构蛋白不是特别限制的，优选为只要它们可以与用所有血清型生产的抗体发生特异反应。这些结构蛋白的实例包括用SEQ IDNO：119表示的2C和用SEQ ID NO：120表示的3ABC。

图4示出了非结构蛋白作为单一固定相应用的实例。T表示其中非结构蛋白(2C或3ABC)被固定的反应区，该反应区迄今为止从未在疫苗生产中采用。C表示对照区。具有变色T和C的试剂盒(图4a)表示感染动物，而仅具有变色C的试剂盒(图4b)表示疫苗接种之前的阴性动物或接种疫苗的动物。如果C在任何情况下都没有变色，这意味着所研究的试剂盒没有正常起作用，这样获得的结果是不可靠的。

如果仅使用如上所述的非结构蛋白作为固定相，那么在任何情况下，都难以区分疫苗接种前的阴性动物和接种疫苗的动物。因此，本发明的最优选的实施方式提供了一种诊断方法和试剂盒，这使得可以区分FMDV感染的动物与接种疫苗的动物。为此，优选提供一第一反应区和一第二反应区，在第一反应区中，作为固定相，可用于迄今已知的疫苗生产中的抗原被固定在芯吸膜的特定位置上，以及在第二反应区中，作为固定相，已知以前从未曾用于疫苗生产的非结构蛋白在芯吸膜的不同于第一反应区的特定位置被间隔和固定。因此，通过由在这些第一和第二反应区和一标记复合物之间的结合反应所产生的外观变化，可以诊断动物是否接种疫苗、病毒感染或者为疫苗接种前的阴性。

结合于对照试剂的固定相在与反应区相隔的不同位置形成了对照区。作为这种固定相，可以采用其它市购诊断试剂盒所用的各种试剂和固定相。其中的细节如在以下实施例中所述。

现在，将参考优选实施方式来描述一种采用具有如以上所述的构造的试剂盒来诊断FMDV感染的方法。在外罩上形成的试样施加口2加上试样比如动物血清(或血浆、全血)。构成试纸条的滤垫10位于施加口2的下端。滤垫10还含有蛋白G-金缀合物作为检测试剂。蛋白G-金缀合物可以与存在于试样中的所有抗体形成复合物。将预定量的显色剂加在显色剂施加口3，其中构成试纸条的储藏垫10位于其下端。显色剂的施加导致了在标记缀合物和在试样中的抗体之间的复合物的形成。然后，该复合物沿芯吸膜9(优选为硝基纤维素膜)的纵轴进行层析。预先将FMDV重组抗原(其构建参考以下实施例详细描述)加样并固定于芯吸膜9的反应区13上，这样，如果该复合物含有该重组抗原的特异性抗体，其将进行反应，然后以红线的形式显示了变色。

如果重组抗原包括结构和非结构蛋白，在此举例描述一种诊断动物是否疫苗接种、病毒感染或为接种疫苗之前的阴性的方法。

图5示出了该实施例。T1表示了一条线，其上已固定有迄今已经在疫苗生产中引入的抗原(结构蛋白或非结构蛋白3D)。T2表示一条线，其上已固定有以前未曾在疫苗生产中使用的非结构蛋白(2C或3ABC)。C表示一对照线。首先，其中T1、T2和C全部变色的试剂盒(图5a)表示病毒感染动物。其次，其中只有T1和C变色的试剂盒(图5b)表示疫苗接种动物。最后，试剂盒(图5c)是指疫苗接种前的阴性动物，因为只有C变色。如果C在任何情况下都不变色，这意味着该试剂盒没有正常操作，这样获得的结果是不可靠的。

如上所述，可用于本发明的诊断设备可以由如在第5,728,587号美国专利所公开的各种构造和变型所制成，并且在该单独设备中试纸条构造(即，垫的排列)的特定公开没有构成本发明的实质。因此，垫的排列不限于上述那些，还可以考虑其它排列方式，比如储藏垫/第一滤垫/第二滤垫/芯吸膜/吸收垫。在该情况下，第一滤垫或第二滤垫用于从血液中过滤和分离单独的血细胞，或者过滤和除去样品试验所不需要的外来物质。

虽然通过以构成口蹄疫病毒的结构和非结构蛋白作为在反应区中含有的固定相为例便于解释本发明，但本发明的范围和精神应该被认为是包括了在提交本发明时已作为疫苗生成的抗原或者在不久的未来作为抗原的任何材料，以及某些能够体内诱导抗体(包括半抗原)的材料，或者通过免疫反应由FMDV获得的各种抗体。

附图简述

图1a示出了根据本发明的第一个方面的一种诊断受试动物的口蹄疫病毒感染的设备(快速试剂盒)的立体图。

图1b示出了根据本发明的第二个方面的一种诊断受试动物的口蹄疫病毒感染的设备(快速试剂盒)的立体图。

图2示出了构成根据本发明的诊断设备的试纸条的构造；

图3示出了由口蹄疫病毒表达的聚蛋白的结构；

图4示出了单线试验(one-line test)试剂盒的示例性试验结果；

图5示出了双线试验试剂盒的示例性试验结果；

图6示出了质粒pBM-VP1Tw97F的图谱；

图7示出了质粒pBM-2CTw97F的图谱；

图8示出了质粒pBM-3ABCTw97F的图谱；和

图9示出了质粒pBM-3DTw97F的图谱。

实施例

现在，参考以下实施例来更详细地说明本发明。这些实施例仅用来说明本发明，但不应被认为是对本发明的范围和精神的限制。

材料

在ResGen公司(亨茨维尔，阿拉巴马州)合成用于基因构建和测序的寡核苷酸。除非另有指示，否则DNA测序也在ResGen进行。

对于聚合酶链式反应(PCR)，从纽英伦生物技术有限公司(NewEngland Biolabs，Inc.)(贝弗利，马萨诸塞州)购买Vent DNA聚合酶和缓冲剂，从安发玛西亚公司(Amersham-Pharmacia)(皮斯卡塔韦，新泽西)购买dNTPs的混合物，除非另有规定，根据生产商的说明来使用。PCR扩增是在珀金--埃尔默公司(Perkin-Elmer Corporation)(福斯特城，加利福尼亚州)的GeneAmp 2400热循环仪上进行的。使用生产商所推荐的Qiagen PCR离心柱(Qiagen公司，沙斯沃斯，加利福尼亚州)纯化该PCR产物。除非另有规定，从纽英伦生物技术有限公司购买限制性酶，以及用琼脂糖(Sigma-Aldrich)凝胶分离DNA片段，用限制性酶处理，然后用于克隆。

切取所需片段，如由生产商所推荐的那样用QIAEX II凝胶提取试剂盒提取DNA。将DNA再悬浮(resuspend)于水或TE(1mM乙二胺四乙酸(EDTA；pH8.0；Sigma-Aldrich)，10mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐(Tris-HCl；pH8.0；Sigma-Aldrich)。如由生产商所推荐，采用DNA连接酶(宝灵曼公司(Boehringer Mannheim Corporation)，印第安纳波利斯，印第安州)进行连接。连接反应在16℃下孵育过夜。使用大肠杆菌(E.coli)XLl-Blue感受态细胞进行细菌转化。除非另有规定，将转化物和细菌再划线(bacterial restreaks)平板接种在补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox)板上。所有细菌孵育(板和液体培养物)在37℃下进行一夜(16小时)。

通过用限制性酶消化微量制备的DNA和/或通过PCR克隆来完成转化体的筛选，以鉴定所需克隆。除非另有规定，微量制备DNA是根据分子克隆：实验室手册来制备。来自转化板的含有所需克隆的菌落进行繁殖，或者在-70℃下在甘油中储存。

抗原生产

实施例1

重组FMDV VP1抗原的制备

A、FMDV VP1表达载体的构建

(i)合成VP1基因的构建

由NCBI GenBank数据库获取口蹄疫病毒台湾型O 97序列的VP1蛋白，以及在ResGen公司(亨茨维尔，阿拉巴马州)合成用于合成基因的寡核苷酸。在合成寡核苷酸过程中，改变天然FMDV密码子，使之符合大肠杆菌密码子偏倚，以便提高该重组蛋白在大肠杆菌中的表达水平。例如，参见M.Gouy和C.Gautier，《核酸研究》(Nucleic AcidsResearch)10：7055(1982)；H.Grosjean和W.Fiers，《基因》(Gene)18：199(1982)；J.Watson等人(eds.)，《(基因分子生物学》(MolecularBiology of the Gene)，4^th Ed.，Benjamin Kumming Publishing Co.，第440页(1987)。使用回归PCR方法来将寡核苷酸组装到全长VP1基因中。基因构建策略涉及系列具有互补末端的重叠寡核苷酸的合成。当退火时，这些末端用作延伸互补链的引物。这些片段然后通过过量外部引物来扩增。

寡核苷酸被设计成含有一个用于克隆到表达载体pGEX-4T-1的BamHI限制位点。

反向寡核苷酸含有一翻译终止密码子(TAA)和EcoRI限制位点。当采用外部引物TW97-1(SEQ ID NO：1)和TW97-16(SEQ ID NO：16)时，合成整个VP1(213个氨基酸)基因(SEQ ID NO：118)。

以下详细描述了回归PCR的这些步骤。

PCR反应(100μl体积)如下设置：

Vent DNA聚合酶(1U)和1×缓冲液，以及25μM的各种dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，50pmol的各寡核苷酸TW97-1(SEQ IDNO：1)和TW 97-16(SEQ ID NO：1)，以及0.25pmol各种寡核苷酸TW97-2(SEQ ID NO：2)到TW97-15(SEQ ID NO：15)。

该反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时15秒、58℃时15秒和72℃时60秒的30个循环扩增，随后在72℃下孵育5分钟。PCR获得的产物用Qiagen PCR离心柱纯化。

(ii)PCR产物的克隆

如上所述扩增的PCR产物用限制性内切酶Bam HI+Eco RI消化，连接于已经用Bam HI+Eco RI消化并凝胶分离的载体pGEX-4T-1。该连接产物用来转化XL-1 Blue感受态细胞。将转化后的细胞平板接种于补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB板上。由菌落的过夜培养物制备微量制备DNA，并用Bam HI+Eco RI消化，以筛选所需克隆。具有正确插入的克隆被命名为pBM-VP1Tw97F(图6)。

pBM-VP1Tw97F克隆用寡核苷酸引物pGEX 5(SEQ ID NO：116)和pGEX3(SEQ ID NO：117)测序。

B.具有VP1质粒的大肠杆菌(E.coli)菌株的生长和诱导

在补充了100μg/ml氨苄青霉素的500ml无菌LB中制备各大肠杆菌克隆的过夜种子培养物，并投入37℃的振荡回转培养箱(shakingorbital incubator)中。

将50ml的来自种子培养物的接种体转移到含有补充了100μg/ml氨苄青霉素的0.5L无菌LB的烧瓶内。在37℃下孵育培养物，直到培养物达到中-对数期生长为止，然后用1mM ITPG(异丙基硫代半乳糖苷)在37℃下诱导3小时。在诱导期之后，通过离心来使细胞成粒，按照标准工序收获。粒化细胞在-70℃下储存，直到进一步处理为止。

C.VP1抗原的制备

将由实施例B获得的冷冻细胞再悬浮于具有1mM PMSF的PBS中。

通过超声破碎(必能信(Branson))来碎解细胞。通过离心将包含体与可溶性蛋白分离。将粒化包含体在(1)PBS；和(2)水中顺次洗涤。用简短的超声处理将洗涤的包含体再悬浮于PBS和5M脲的溶液中。再次，将离心造粒的包含体完全溶解在7M胍-HCl中。溶解的重组抗原通过离心来澄清，再通过0.2μm滤器。

将胍-HCl溶解的融合蛋白在水中稀释以变性，通过离心来沉淀该变性蛋白。将该颗粒用水洗涤，并再悬浮于水中。添加2M NaOH溶液，以完全溶解变性蛋白，然后中和蛋白溶液的pH。

实施例2

重组FMDV 2C抗原的制备

A.FMDV 2C表达载体的构建

从NCBI GenBank数据库(GI：5921457，O菌株Chu-Pei)获取FMDV2C蛋白的基因组序列，在ResGen(亨茨维尔，阿拉巴马州)合成用于整个2C基因的合成和测序的寡核苷酸。编码DNA序列长达954个核苷酸，其编码318个氨基酸(SEQ ID NO：119)。

(i)合成全长2C基因的构建

为了获得FMD病毒的2C基因，在Resgen合成24个寡核苷酸引物，各自具有互补末端。

我们采用回归PCR方法来将寡核苷酸组装成完整2C基因。基因构建策略涉及合成一系列具有互补末端的重叠寡核苷酸。当退火时，这些末端用作延伸互补链的引物。这些片段然后通过过量外部引物来扩增。因为所要合成的2C基因较大，将寡核苷酸分为三组，进行各自的回归PCR。所产生的DNA被称为A、B和C片段。B和C片段用PCR连接，然后将B-C片段与A片段连接，形成完整2C基因。寡核苷酸之一被设计成含有用于克隆到表达载体pGEX-4T-1的BamHI限制位点。

该反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时30秒、53℃时30秒和73℃时100秒的35个循环扩增，随后在73℃下孵育5分钟。反应混合物的等份试样通过在琼脂糖微凝胶上的电泳来分析。

(ii)PCR产物的克隆

用限制性内切酶Bam HI+Hind III消化如上所述扩增的PCR产物，将之连接于预先用Bam HI+Hind III消化的载体pGEX-4T-1。该连接产物用来转化大肠杆菌XL-1 Blue感受态细胞。将经转化后的细胞平板接种于补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB板上。采用QIAprep质粒DNA微量制备试剂盒从转化菌落的过夜培养物制备微量制备DNA，并用BamHI+Hind III消化，以筛选所需克隆。具有正确插入的克隆被命名为pGEX-2CTw97F(图7)。

pGEX-2CTw97F克隆用寡核苷酸引物pGEX 5(SEQ ID NO：116)、pGEX3(SEQ ID NO：117)、2C-25(SEQ ID NO：41)和2C-26(SEQ ID NO：42)测序。

B.带有2C质粒的大肠杆菌菌株的生长和诱导

在补充了100μg/ml氨苄青霉素的500ml无菌LB中制备pGEX-2CTw97F的过夜种子培养物，并投入37℃的振荡回转培养箱中。将50ml的来自种子培养物的接种体转移到含有补充了100μg/ml氨苄青霉素的0.5L无菌LB的烧瓶内。培养物在37℃下孵育，直到培养物达到中-对数期生长为止，然后用1mM ITPG(异丙基硫代半乳糖苷)在37℃下诱导3小时。在诱导期之后，通过离心来使细胞成粒，按照标准工序收获。粒化细胞在-70℃下储存，直到进一步处理为止。

C.FMDV 2C抗原的制备

将由实施例2B获得的冷冻细胞再悬浮于具有1mM PMSF和TritonX-100洗涤剂的PBS中，然后通过超声破碎(Branson)来碎解。通过离心将包含体与可溶性蛋白分离。通过3-4轮的洗去污染物和将细胞溶解产物颗粒溶解在尿素或胍-HCl中来获得富含2C的蛋白部分。重组2C通过尺寸排阻色谱法(FPLC，Sephacryl S 200HR)在变性条件下(5NGuHCl，PBS(pH7.4))纯化，含有2C的洗脱部分通过SDS-PAGE鉴定，用20mM磷酸盐缓冲剂(pH9.0)渗析。在添加叠氮化钠至0.05％之后冰冻储存蛋白溶液。为了保存更久(超过1个月)，将蛋白溶液取等份试样，在-70℃下冰冻。

实施例3

重组FMDV3ABC抗原的制备

A.FMDV3ABC表达载体的构建

从NCBI GenBank数据库(GI：5921457，O菌株Chu-Pei)获取FMDV3ABC蛋白的基因组序列，在ResGen(亨茨维尔，阿拉巴马州)合成用于整个3ABC基因的合成和测序的寡核苷酸。编码DNA序列长达1281个核苷酸，其编码427个氨基酸(SEQ ID NO：120)。

(i)合成全长3ABC基因的构建

为了获得FMD病毒的3ABC基因，在Resgen合成33个寡核苷酸引物，各自具有互补末端。

我们采用回归PCR方法来将寡核苷酸组装成完全3ABC基因。基因构建策略涉及合成具有系列互补末端的重叠寡核苷酸。当退火时，这些末端用作延伸互补链的引物。这些片段然后通过过量外部引物来扩增。

因为所要合成的3ABC基因较大，将寡核苷酸分为四组，进行各自的回归PCR。所产生的DNA被称为A、B、C和D片段。通过PCR，将A和B片段连接，将C和D片段连接。然后将A-B片段与C-D片段连接，形成完整3ABC基因。

寡核苷酸之一被设计成含有用于克隆到表达载体pGEX-4T-1的Bam HI限制位点。该反义寡核苷酸含有一翻译终止密码子(TAA)和EcoRI限制位点。当采用N-和C-末端引物，3ABC-1(SEQ ID NO：43)和3ABC-33(SEQ ID NO：75)，合成了全长3ABC(427个氨基酸)基因。

PCR反应(100μl体积)如下设置：

Vent DNA聚合酶(1U)和1×缓冲剂，以及25μM的各dNTP(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)，4ul 100mM MgSO₄和100pmol的各寡核苷酸。模板是上述A-B片段和C-D片段的混合物。

反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时30秒、60℃时30秒和73℃时120秒的35个循环扩增，随后在73℃下孵育5分钟。PCR获得的产物在琼脂糖凝胶上跑胶，切取DNA带，使用Quigen凝胶提取试剂盒将之从凝胶上洗脱。

(ii)PCR产物的克隆

用限制性内切酶Bam HI+Hind III消化如上所述扩增的PCR产物，将之连接于预先用Bam HI+Hind III消化的载体pGEX-4T-1。该连接产物用来转化大肠杆菌XL-1Blue感受态细胞。将经转化的细胞平板接种于补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB板上。采用QIAprep质粒DNA微量制备试剂盒从转化的菌落的过夜培养物制备微量制备DNA，并用BamHI+Hind III消化，以筛选所需克隆。具有正确插入的克隆被命名为pBM-3ABCTw97F(图8)。

pBM-3ABCTw97F克隆用寡核苷酸引物pGEX 5(SEQ ID NO：116)、pGEX3(SEQ ID NO：117)、3ABC-36(SEQ ID NO：78)和3ABC-37(SEQ IDNO：79)测序。

B.具有E3ABC质粒的大肠杆菌菌株的生长和诱导

在补充了100μg/ml氨苄青霉素的500ml无菌LB中制备pGEX-3ABCTw97F的过夜种子培养物，并投入到37℃的振荡回转培养箱中。将50ml的来自种子培养物的接种体转移到含有补充了100μg/ml氨苄青霉素的0.5L无菌LB的烧瓶内。培养物在37℃下孵育，直到培养物达到中-对数期生长为止，然后用1mM ITPG(异丙基硫代半乳糖苷)在37℃下诱导3小时。在诱导期之后，通过离心来使细胞成粒，按照标准工序收获。粒化细胞在-70℃下储存，直到进一步处理为止。

C.FMDV 3ABC抗原的制备

将由实施例3B获得的冷冻细胞再悬浮于具有1mM PMSF和TritonX-100洗涤剂的PBS中，然后通过超声破碎(Branson)来碎解。通过离心将包含体与可溶性蛋白分离。通过3-4轮洗去污染物和将细胞溶解产物颗粒溶解在尿素中来获得富含3ABC的蛋白部分。重组3ABC通过离子交换色谱法(FPLC，Q-Sepharose FF)在变性条件下(8M尿素，10mM DTT，20mM磷酸钾，pH7.0)纯化，用NaCl梯度洗脱。洗脱部分用20mM磷酸盐缓冲剂(pH9.0)渗析。在用布拉德福(Bradford)方法测定蛋白浓度和添加叠氮化钠至0.05％之后，冰冻储存蛋白溶液。为了保存更久(超过1个月)，将该蛋白溶液取等份试样，在-70℃下冰冻。

实施例4

重组FMDV 3D抗原的制备

A.FMDV 3D表达载体的构建

(i)合成全长3D基因的构建

为了获得FMD病毒的3D基因，在Resgen合成36个各自具有互补末端的寡核苷酸，。我们采用回归PCR方法来将寡核苷酸组装成完整3D基因(SEQ ID NO：121)。基因构建策略涉及合成系列具有互补末端的重叠寡核苷酸。当退火时，这些末端用作延伸互补链的引物。这些片段然后通过过量外部引物来扩增。

因为所要合成的3D基因较大，将寡核苷酸分为三组，进行回归PCR。所产生的DNA被称为A、B和C片段。用PCR将B和C片段连接，然后将B-C片段与A片段连接，形成完整3D基因。

寡核苷酸被设计成含有一用于克隆到表达载体pGEX-4T-1的BamHI限制位点。

反义寡核苷酸含有翻译终止密码子(TAA)和EcoRI限制位点。当采用N-和C-末端引物，3d-1A(SEQ ID NO：80)和3d-36A(SEQ IDNO：115)，合成了全长3D(470个氨基酸)基因。

以下详细描述了这些步骤：

1.3DA片段PCR

PCR反应(100μl体积)如下设置：

Vent DNA聚合酶(1U)和1×缓冲剂，以及25μM的各dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，4ul 100mM MgSO₄、100pmol的各寡核苷酸3d-1A(SEQ ID NO：80)和3d-14(SEQ ID NO：93)。模板是0.83pmol的各寡核苷酸3d-1A到3d-14的混合物。

该反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时30秒，53℃时30秒和73℃时100秒的35个循环扩增，随后在73℃下孵育5分钟。通过在琼脂糖微凝胶上的电泳来分析反应混合物的等份试样。

2.3DB片段PCR

PCR反应(100μl体积)如下设置：

Vent DNA聚合酶(1U)和1×缓冲剂，以及25uM的各dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，4ul 100mM MgSO₄，100pmol的各寡核苷酸3d-13(SEQ ID NO：92)和3d-24(SEQ ID NO：103)。模板是0.83pmol的各寡核苷酸3d-13到3d-24的混合物。

该反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时30秒，55℃时30秒和72℃时90秒的35个循环扩增，随后在72℃下孵育5分钟。通过在琼脂糖微凝胶上的电泳来分析反应混合物的等份试样。

3.3DC片段PCR

PCR反应(100μl体积)如下设置：

Vent DNA聚合酶(1U)和1×缓冲剂，以及25uM的各dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，4ul 100mM MgSO₄，100pmol的各寡核苷酸3d-25(SEQ ID NO：104)和3d-36A(SEQ ID NO：115)。模板是0.83pmol的各寡核苷酸3d-25到3d-36A的混合物。

该反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时30秒、53℃时30秒和73℃时100秒的35个循环扩增，随后在73℃下孵育5分钟。通过在琼脂糖微凝胶上的电泳来分析反应混合物的等份试样。

4.3DB-C片段PCR

PCR反应(100μl体积)如下设置：

Vent DNA聚合酶(1U)和1×缓冲剂，以及25uM的各dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，4ul 100mM MgSO₄，100pmol的各寡核苷酸3d-13(SEQ ID NO：92)和3d-36A(SEQ ID NO：115)。模板是上述B和C片段的混合物。

该反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时30秒、55℃时30秒和73℃时90秒的35个循环扩增，随后在73℃下孵育5分钟。通过在琼脂糖微凝胶上的电泳来分析反应混合物的等份试样。

5.全长3D(ABC)片段PCR

PCR反应(100μl体积)如下设置：

Vent DNA聚合酶(1U)和1×缓冲剂，以及25uM的各dNTP(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)，4ul 100mM MgSO₄，100pmol的各寡核苷酸3d-1A(SEQ ID NO：80)和3d-36A(SEQ ID NO：115)。模板是上述A、B和C片段的混合物。

该反应在95℃下孵育5分钟，然后进行95℃时30秒、60℃时30秒和73℃时120秒的35个循环扩增，随后在73℃下孵育5分钟。PCR获得的产物在琼脂糖凝胶上跑胶，由该凝胶切取DNA带，使用Quigen凝胶提取试剂盒洗脱DNA。

(ii)PCR产物的克隆

用限制性内切酶Bam HI+Eco RI消化如上所述扩增的PCR产物，将之连接于已经用Bam HI+Eco RI消化的载体pGEX-4T-1，进行凝胶分离。该连接产物用来转化XL-1 Blue感受态细胞。将经转化的细胞平板接种于补加了100μg/ml氨苄青霉素的LB板上。由菌落的过夜培养物制备微量制备DNA，并用Bam HI+Eco RI消化，以筛选所需克隆。具有正确插入的克隆被命名为pGEX-3Df(图9)。

B.具有pGEX-3Df的大肠杆菌菌株的生长和诱导

为了表达重组GST-3D蛋白，将pGEX-3Df质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，将该转化体涂布在补加了100ug/ml氨苄青霉素的LB-琼脂板上。

在补加了100μg/ml氨苄青霉素的500ml无菌LB中制备pGEX-3Df克隆的过夜种子培养物，并投入到37℃的振荡回转培养箱中。将50ml的来自种子培养物的接种体转移到含有补充了100μg/ml氨苄青霉素的0.5L无菌LB的烧瓶内。培养物在37℃下孵育，直到培养物达到中-对数期生长为止，然后用1mM ITPG(异丙基硫代半乳糖苷)在37℃下诱导3小时。在诱导期之后，通过离心来使细胞成粒，按照以下标准工序收获。在-70℃下储存该粒化细胞，直到进一步处理为止。

C.GST-3D蛋白的制备

将由实施例获得的冷冻细胞再悬浮于含有1mM PMSF的PBS中。

细胞通过超声破碎(Branson，S-125型)来溶解。通过离心细胞溶解产物(10,000rpm，30分钟)制备可溶性粗溶解产物，再用0.45um针头式过滤器(赛多利斯(Sartorius))过滤。

进行谷胱甘肽亲和层析，以纯化rGST-3D蛋白。将可溶性细胞溶解产物加载到用PBS平衡的谷胱甘肽sepharose4B(法玛西亚)柱子中。在用三个床体积的PBS洗涤柱子之后，用10mM还原型谷胱甘肽洗脱GST-3D，50mM Tris-HCl，pH8.0缓冲溶液洗脱。在8％SDS-PAGE上分析该洗脱部分。含有融合蛋白的部分在PBS中过夜渗析。

试剂盒分析

实施例5

FMDV抗体检测试剂盒配方

A.抗原印膜(antigen printed membrane)的制备

由储备溶液将重组2C和3ABC调节和混合至0.5mg/ml，用0.22μm过滤单元Millex-GV(密理博(Millipore))过滤。在过滤后，使用在PBS中的抗生物素蛋白溶液(pH7.4)作为内对照。采用Bio-Dot设备(Bio-Dot)将抗原混合物和对照溶液施加于硝基纤维素膜上。在低湿度房间中过夜干燥后，该膜用在PBS中的3％BSA封闭20分钟，然后用风扇干燥至少2小时。处理过的膜板必须在具有干燥剂的封闭容器或低湿度房间中储存。

B.蛋白G-金缀合物的制备

从西格玛公司购买用以消除与血清白蛋白的非特异结合的工程重组蛋白G，并且使之达到1mg/ml的浓度。在搅拌的同时将蛋白G滴加到金溶液中，使之达到10μg/ml的最终浓度，将该溶液保持搅拌15分钟。然后，将15％BSA溶液加入到所用金颗粒悬浮液中。在搅拌另外15分钟后，离心偶联的金溶液，丢弃上清液，以便除去未结合的蛋白G。向偶联的金溶液添加2％BSA，在声波浴(必能信#2200型或同等物)中进行超声处理，以便将该颗粒物再悬浮。将该悬浮液再次离心，最终颗粒物悬浮在2％BSA中，在冰箱中储存。

C.生物素-BSA-金共轭物的制备：对照指示剂

从Pierce公司购买的生物素化BSA用于金偶联。共轭工序基本上与以上用于蛋白G所述程序相同。用强烈搅拌将每毫升含有10μg的生物素化BSA的金颗粒悬浮液加入到金溶液中。在偶联反应结束时，添加每毫升含有15％BSA溶液的金颗粒悬浮液。在搅拌另外15分钟后，离心该生物素-BSA偶联金共轭物悬浮液，丢弃上清液，以除去未结合的生物素-BSA。向偶联金溶液的颗粒物添加2％BSA(10mM磷酸钠，pH7.5)，再次离心悬浮液，洗涤。将颗粒物悬浮于2％BSA中，在冰箱中储存。

D.滤垫的制备(还用作染色垫)

采用染料稀释缓冲液(1％酪蛋白，100mM磷酸钠，pH7.0)稀释蛋白G偶联的金溶液。添加生物素-BSA偶联的金溶液，用于产生结合于膜上的抗生物素蛋白的对照线。将稀释的金溶液涂布到垫条(Lydallpad strip)(微玻璃纸)上，在冷冻干燥机中干燥。将该利得尔垫储存在低湿度房间中备用。

E.储藏垫的制备

将纤维素滤纸预先浸泡在预处理缓冲液(100mM磷酸钠，pH7.0)中，在吸干过量液体之后用风扇干燥。将所制备的储藏垫储存在低湿度房间中。

F.设备组件(device assembly)

当将保护片从顶部的带子上剥离之后，沿板的长轴贴附吸收垫。当将保护片从板的底部的带子上剥离之后，沿板的长轴，在试验膜区域下面贴附滤垫。染色垫应该重叠在试验膜的底部。然后，将储藏垫贴附于该板，以覆盖滤垫的底部。将整修过的膜板切割成宽度适于安装到壳体的长条。

结果

采用共计1540份鉴定的牛、猪、山羊和绵羊血清。试验血清由接种疫苗前的阴性动物、未感染和接种疫苗的动物以及感染动物组成。对于各试验牛，采用3ABC ELISA(意大利和美国农业部，美国)作为参照试验。总之，相对灵敏度、特异性和总精确率分别是98.6％(69/70)、98.6％(1449/1470)和98.6％(1518/1540)。

本发明试验/参照试验

BioSign^TM FMDV

  阳性  阴性  总计  参照  感染(+)  69  1  70  试验  阴性(-)  11  1236  1247  接种疫苗(-)  单一  4  149  153  多重  6  64  70  总计  90  1450  1540

工业应用性

根据本发明，基于由动物获得的试样，可以快速、准确地诊断动物是否感染了口蹄疫病毒(FMDV)。此外，如果适当，仅用少量试样还可以区分FMV接种疫苗的动物和感染动物。因此，这使得可以容易和快速测定FMV易感动物是否感染了FMV，不管是否进行了FMV疫苗接种。

虽然为了说明的目的公开了本发明的优选实施方式，本领域的那些技术人员会清楚，在不偏离如在所附权利要求书中公开的本发明的范围和主旨的情况下，各种改变、增加和替代是可能的。因此，本发明的实施方式仅仅用FMDV抗原来说明，但本发明的范围和主旨当然还可以适用于检测FMDV抗体、PRRSV(猪呼吸和生殖症状病毒)抗原和抗体、FeLV(猫白血病毒)、FIV(猫免疫缺陷病毒)抗体、狂犬病的诊断标记物、CSF(传统猪瘟)抗原和抗体、犬布鲁氏菌(Brucellosis canis)抗原和抗体、Johnes抗体、BVDV(牛病毒型腹泻病毒)抗原和抗体。

此外，本发明适用于生物体中的多种疾病标记物，比如试样中的癌诊断标记物、激素、酶、药物和各种抗原。

序列表

<110>国家兽医研究和检疫所

<120>口蹄疫的诊断方法和诊断试剂盒

<160>121

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-1)的合成寡核苷酸

<400>1

atccaaggat ccaccacctc tgcgggtgag tctgcggacc cggtgactgc caccgttgag              60

aac                                                                            63

<210>2

<211>61

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-2)的合成寡核苷酸

<400>2

ccgtgtgctg gcgacgctga acttgggtct caccaccgta gttctcaacg gtggcagtca              60

c                                                                              61

<210>3

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-3)的合成寡核苷酸

<400>3

tcagcgtcgc cagcacacgg acagcgcgtt catcttggac cgtttcgtga aagttaagcc              60

                                                                               60

<210>4

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-4)的合成寡核苷酸

<400>4

cagggatctg catcaggtcc aacacattaa cttgttcctt tggcttaact ttcacgaaac              60

gg                                                                             62

<210>5

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-5)的合成寡核苷酸

<400>5

tggacctgat gcagatccct gcccacacct tggtaggtgc gctcctgcgt acggccacct               60

act                                                                             63

<210>6

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-6)的合成寡核苷酸

<400>6

tcgccctcgt gcttaacggc cagctccagg tcagagaagt agtaggtggc cgtacgcagg               60

                                                                                60

<210>7

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-7)的合成寡核苷酸

<400>7

gccgttaagc acgagggcga tctcacctgg gttccaaacg gcgcccctga gaccgcactg               60

ga                                                                              62

<210>8

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-8)的合成寡核苷酸

<400>8

gagcggttcc ttgtggtaag cggttgggtt ggtagtgttg tccagtgcgg tctcaggggc               60

                                                                                60

<210>9

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-9)的合成寡核苷酸

<400>9

cttaccacaa ggaaccgctc acccgtctgg cgctgcctta cacggctcca caccgtgttt               60

tagc                                                                            64

<210>10

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-10)的合成寡核苷酸

<400>10

tgctggtgtc accgtacttg ctgctaccgt tgtaaacggt cgctaaaaca cggtgtggag               60

cc                                                                              62

<210>11

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-11)的合成寡核苷酸

<400>11

caagtacggt gacaccagca ctaacaacgt gcgtggtgac ctgcaagtgt tagctcagaa               60

gg                                                                              62

<210>12

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-12)的合成寡核苷酸

<400>12

gatggcaccg aagttgaagg aggtaggcag agtacgttct gccttctgag ctaacacttg               60

caggt                                                                           65

<210>13

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-13)的合成寡核苷酸

<400>13

tccttcaact tcggtgccat caaggcaact cgtgttactg aactgctcta ccgtatgaag               60

cg                                                                              62

<210>14

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-14)的合成寡核苷酸

<400>14

ttgaatggcg agcagcggac gcggacagta ggtctcggca cgcttcatac ggtagagcag               60

                                                                                60

<210>15

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-15)的合成寡核苷酸

<400>15

gtccgctgct cgccattcaa ccgagcgacg ctcgtcacaa gcagcgtatt gtggcaccgg               60

                                                                                60

<210>16

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VP1(TW97-16)的合成寡核苷酸

<400>16

gcctatgaat tcttacagca gctgttttgc cggtgccaca atacgctgct                          50

<210>17

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-1)的合成寡核苷酸

<400>17

gcaggatccg acgacgacga caaactcaaa gcacgtgaca tcaacgacat atttgccgtt               60

ct                                                                              62

<210>18

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-2)的合成寡核苷酸

<400>18

ttgctgtata aacggcaaga attcttgcca ctcaccgacc agtttgacta ggaccggtag               60

                                                                                60

<210>19

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-3)的合成寡核苷酸

<400>19

tcaaactgat cctggccatc cgcgactgga ttaaggcatg gatcgcctca gaagagaagt               60

                                                                                60

<210>20

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-4)的合成寡核苷酶

<400>20

ctagcggagt cttctcttca aacagtggta ctgtctggac cacggaccgt aggaactttc               60

                                                                                60

<210>21

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2c(2C-5)的合成寡核苷酸

<400>21

gtgcctggca tccttgaaag tcaacgggat ctcaatgacc ccggcaaata caaggaggcc               60

                                                                                60

<210>22

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-6)的合成寡核苷酸

<400>22

ggccgtttat gttcctccgg ttccttaccg acctgttgcg cgcagttcgc acaaacttct               60

                                                                                60

<210>23

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2c(2c-7)的合成寡核苷酸

<400>23

gcgtcaagcg tgtttgaaga gcgggaacgt gcacattgcc aatctgtgta aagtggtcgc               60

                                                                                60

<210>24

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-8)的合成寡核苷酸

<400>24

ttagacacat ttcaccagcg aggccgcggg tcgttcagct ctgggcttgg tcaccagcac               60

                                                                                60

<210>25

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-9)的合成寡核苷酸

<400>25

gacccgaacc agtggtcgtg tgccttcgcg gcaaatccgg cacaaggaaa agcatcctc                59

<210>26

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-10)的合成寡核苷酸

<400>26

gtgttccttt tcgtaggagc gcttgcacga gcgcgtccgt taaaggtgtg tgaagtgacc               60

                                                                                60

<210>27

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-11)的合成寡核苷酸

<400>27

atttccacac acttcactgg taggaccgac tcggtctggt actgcccgcc cgaccctgac               60

                                                                                60

<210>28

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-12)的合成寡核苷酸

<400>28

tgacgggcgg gctgggactg gtgaaactgc caatgttagt cgtctggcag cagcactacc               60

                                                                                60

<210>29

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-13)的合成寡核苷酸

<400>29

gcagaccgtc gtcgtgatgg acgacttggg ccaaaaccca gacggcaaag acttcaagta               60

                                                                                60

<210>30

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-14)的合成寡核苷酸

<400>30

ctgccgtttc tgaagttcat gaaacgggtt taccagaggt ggtgccccaa gtagggcgga               60

                                                                                60

<210>31

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-15)的合成寡核苷酸

<400>31

ccacggggtt catcccgcct atggcctcgc tcgaggataa gggtaaaccc ttcaacagca               60

                                                                                60

<210>32

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-16)的合成寡核苷酸

<400>32

cccatttggg aagttgtcgt tccagtatta tcgatgttgg ttggacatga gccctaagtg               60

                                                                                60

<210>33

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-17)的合成寡核苷酸

<400>33

aacctgtact cgggattcac cccaaagacc atggtgtgcc ccgatgcgct taaccggagg               60

                                                                                60

<210>34

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-18)的合成寡核苷酸

<400>34

ggctacgcga attggcctcc aaagtgaaac tgtagctgca ctcgcggttt ctgcccatgt               60

                                                                                60

<210>35

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-19)的合成寡核苷酸

<400>35

gagcgccaaa gacgggtaca agatcaacaa caaactggac atagtcaaag cacttgaaga               60

                                                                                60

<210>36

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-20)的合成寡核苷酸

<400>36

tatcagtttc gtgaacttct gtgggtgcga ttgggccacc gctacaaggt tatgctgacg               60

                                                                                60

<210>37

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-21)的合成寡核苷酸

<400>37

cgatgttcca atacgactgc gctcttctca acggaatggc cgttgaaatg aagagaatgc               60

                                                                                60

<210>38

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-22)的合成寡核苷酸

<400>38

gcaactttac ttctcttacg tcgttctgta caagttcgga gttggtggga aggtcttgta               60

                                                                                60

<210>39

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-23)的合成寡核苷酸

<400>39

caaccaccct tccagaacat ctaccagctc gttcaggagg tgattgagcg ggtggaacta               60

                                                                                60

<210>40

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-24)的合成寡核苷酸

<400>40

actaactcgc ccaccttgat gtgcttttcc acagctcggt gggctataaa tttgtc                   56

<210>41

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-25)的合成寡核苷酸

<400>41

gtcgagaccc gaaccagtgg tcgtgtgcct                                                30

<210>42

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>2C(2C-26)的合成寡核苷酸

<400>42

aggcacacga ccactggttc gggtctcgac                                                30

<210>43

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-1)的合成寡核苷酸

<400>43

gcaggatccg acgacgacga caaaatttca atcccttccc agaagtccgt gttgtact                 58

<210>44

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-2)的合成寡核苷酸

<400>44

ggtcttcagg cacaacatga aggagtaact cttcccagtc gtgcttcgtc gctagctcaa               60

                                                                                60

<210>45

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-3)的合成寡核苷酸

<400>45

cacgaagcag cgatcgagtt cttcgagggg atggtccacg attccatcaa agaggaactc               60

                                                                                60

<210>46

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-4)的合成寡核苷酸

<400>46

taaggtagtt tctccttgag gctggggagt aagtcgtctg gagcaagcat tttgcgcgga               60

                                                                                60

<210>47

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-5)的合成寡核苷酸

<400>47

ctcgttcgta aaacgcgcct tcaagcgcct gaaagagaac tttgaagttg tagccctgtg               60

                                                                                60

<210>48

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-6)的合成寡核苷酸

<400>48

aaacttcaac atcgggacac aaactgggag aaccgtttgt atcactaata cgaggcggtt               60

                                                                                60

<210>49

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-7)的合成寡核苷酸

<400>49

tagtgattat gctccgccaa gcgcgcaaga ggtaccaatc ggtggatgac ccactggacg               60

                                                                                60

<210>50

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-8)的合成寡核苷酸

<400>50

ccacctactg ggtgacctgc cgctgcatcg agaaccgctg cgccttttct tgggagacct               60

                                                                                60

<210>51

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-9)的合成寡核苷酸

<400>51

gcggaaaaga accctctgga gacgagtgcc gctagcgctg tcggtttcag agagagatcc               60

                                                                                60

<210>52

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-10)的合成寡核苷酸

<400>52

agccaaagtc tctctctagg gggtggctcg ttccctgcgc gcttctgcgc ttgcgactcg               60

                                                                                60

<210>53

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-11)的合成寡核苷酸

<400>53

cgaagacgcg aacgctgagc ccgtcgtgtt cggtagggaa caaccgcgag ctgaaggacc               60

                                                                                60

<210>54

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-12)的合成寡核苷酸

<400>54

gttggcgctc atgcggccgg gttacctctc tgtctttggc gatttccact ttcgttttcg               60

                                                                                60

<210>55

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-13)的合成寡核苷酸

<400>55

gtcagaaacc tcttaaagtg aaagccgagc tgccacaaca ggagggacca tacgccggcc               60

                                                                                60

<210>56

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-14)的合成寡核苷酸

<400>56

gcttttgctt tcacctttag cggtttctgt ctctccattg ggccggcgta tggtccctcc               60

                                                                                60

<210>57

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-15)的合成寡核苷酸

<400>57

ctaaaggtga aagcaaaagc ccccgtcgtg aaggaaggac cttacgaggg accggtgaag               60

                                                                                60

<210>58

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-16)的合成寡核苷酸

<400>58

gaatgctccc tggccacttc tttggacagc gaaattttca ctttcgtttc ttgaactatc               60

                                                                                60

<210>59

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-17)的合成寡核苷酸

<400>59

gaaagcaaag aacttgatag tcactgagag tggtgcgcca ccgaccgact tgcaaaagat               60

                                                                                60

<210>60

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-18)的合成寡核苷酸

<400>60

ggctggctga acgttttcta ccagtacccg ttgtgattcg gtcagctcga gtaggagctg               60

                                                                                60

<210>61

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-19)的合成寡核苷酸

<400>61

cagtcgagct catcctcgac ggcaagacgg tagccatttg ctgtgctacc ggagtgttcg               60

                                                                                60

<210>62

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-20)的合成寡核苷酸

<400>62

gacacgatgg cctcacaagc cgtgacggat ggagcacgga gcagtagaga agcgcctttt               60

                                                                                60

<210>63

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-21)的合成寡核苷酸

<400>63

cgtcatctct tcgcggaaaa gtacgacaag atcatgttgg acggcagagc cttgacagac               60

                                                                                60

<210>64

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-22)的合成寡核苷酸

<400>64

tgccgtctcg gaactgtctg tcactgatgt ctcacaaact caaactctaa tttcattttc               60

                                                                                60

<210>65

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-23)的合成寡核苷酸

<400>65

gtttgagatt aaagtaaaag gacaggacat gctctcagac gccgctctca tggtgttgca               60

                                                                                60

<210>66

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-24)的合成寡核苷酸

<400>66

cggcgagagt accacaacgt ggcaccctta gcgcacgcac tgtagtgctt tgtgaaagca               60

                                                                                60

<210>67

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-25)的合成寡核苷酸

<400>67

acatcacgaa acactttcgt gacgtagcga gaatgaagaa gggaaccccc gtcgtcggtg               60

                                                                                60

<210>68

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-26)的合成寡核苷酸

<400>68

cccttggggg cagcagccac actagttgtt acgactgcag ccctctgagt ataagagacc               60

                                                                                60

<210>69

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-27)的合成寡核苷酸

<400>69

gggagactca tattctctgg tgtagccctc acttacaagg acatcgtcgt gtgtatggat               60

                                                                                60

<210>70

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-28)的合成寡核苷酸

<400>70

tgtagcagca cacataccta cctctgtggt acggacccga gaaacggatg tcccgtaggt               60

                                                                                60

<210>71

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-29)的合成寡核苷酸

<400>71

ctttgcctac agggcatcca ccaaggcagg ctactgcgga ggagccgtcc tggcaaagga               60

                                                                                60

<210>72

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-30)的合成寡核苷酸

<400>72

cctcggcagg accgtttcct gccccggctt tgcaagtagc aaccgtgggt gaggcgtcca               60

                                                                                60

<210>73

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-31)的合成寡核苷酸

<400>73

ttggcaccca ctccgcaggt ggaaacggca taggatactg ttcgtgtgtt tcccgatcaa               60

                                                                                60

<210>74

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-32)的合成寡核苷酸

<400>74

aagcacacaa agggctagtt acgaggactt ctacttccgt gtgtagctgg gacttggtgt               60

                                                                                60

<210>75

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-33)的合成寡核苷酸

<400>75

tgcaagcttt tactcgtggt gtggttcagg gtcgatgtgt gccttcatc                           49

<210>76

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-34)的合成寡核苷酸

<400>76

ctttaaaagt gaaagcaaag aacttgatag tcact                                         35

<210>77

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-35)的合成寡核苷酸

<400>77

agtgactatc aagttctttg ctttcacttt taaag                                         35

<210>78

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-36)的合成寡核苷酸

<400>78

ccgtcgtgtt cggtagggaa                                                          20

<210>79

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3ABC(3ABC-37)的合成寡核苷酸

<400>79

aaagtaaaag gacaggacat                                                          20

<210>80

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-1A)的合成寡核苷酸

<400>80

gctatcggat ccgggttgat cgttgatacc agagatgtgg aa                                 42

<210>81

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-2)的合成寡核苷酸

<400>81

tgggtgcaag cttggttttg cgcattacat ggacgcgctc ttccacatct ctggtatcaa              60

                                                                               60

<210>82

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-3)的合成寡核苷酸

<400>82

caaaaccaag cttgcaccca ccgtcgcgca cggtgtgttc aatcctgagt tcgggcctgc               60

                                                                                60

<210>83

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-4)的合成寡核苷酸

<400>83

aacaccttcg ttcagacgtg ggtccttgtt agacaaggcg gcaggcccga actcaggatt               60

                                                                                60

<210>84

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-5)的合成寡核苷酸

<400>84

cacgtctgaa cgaaggtgtt gtcctcgatg aagtcatttt ctccaagcat aaaggagaca               60

                                                                                60

<210>85

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-6)的合成寡核苷酸

<400>85

cagcggcgga acagcgcttt gtcctcctca gacatctttg tgtctccttt atgcttggag               60

                                                                                60

<210>86

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-7)的合成寡核苷酸

<400>86

aaagcgctgt tccgccgctg cgctgctgac tacgcgtcac gcctgcacag tgtgctgggt               60

                                                                                60

<210>87

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-8)的合成寡核苷酸

<400>87

ccttgattgc ctcgtaaatg ctcagtgggg catttgccgt acccagcaca ctgtgcaggc               60

                                                                                60

<210>88

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-9)的合成寡核苷酸

<400>88

catttacgag gcaatcaagg gcgttgacgg actcgacgcc atggagccag acaccgcacc               60

                                                                                60

<210>89

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-10)的合成寡核苷酸

<400>89

tgcaccgcgg cgtttcccct ggagggccca gggaaggcca ggtgcggtgt ctggctccat               60

                                                                                60

<210>90

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-11)的合成寡核苷酸

<400>90

aggggaaacg ccgcggtgca cttatcgatt tcgagaacgg cacggtcgga cccgaggttg               60

                                                                                60

<210>91

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-12)的合成寡核苷酸

<400>91

aacttgtatt ctcttttctc catgagcttc aaggcagcct caacctcggg tccgaccgtg               60

                                                                                60

<210>92

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-13)的合成寡核苷酸

<400>92

gagaaaagag aatacaagtt tgtttgccag accttcctga aggacgaaat tcgcccgatg               60

                                                                                60

<210>93

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-14)的合成寡核苷酸

<400>93

abaacgtcgac aatgcgagtc ttgccggcac gtactttctc catcgggcga atttcgtcct              60

                                                                                60

<210>94

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-15)的合成寡核苷酸

<400>94

gactcgcatt gtcgacgttt tgcctgttga acacattctt tacaccagga tgatgattgg               60

                                                                                60

<210>95

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-16)的合成寡核苷酸

<400>95

ctgcggcccg ttgtttgagt gcatttgtgc acaaaatctg ccaatcatca tcctggtgta               60

                                                                                60

<210>96

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-17)的合成寡核苷酸

<400>96

actcaaacaa cgggccgcag attggctcag cggtcggttg caaccctgat gttgattggc               60

                                                                                60

<210>97

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-18)的合成寡核苷酸

<400>97

cacacgtttc tgtattgggc gaagtgtgtg ccgaatctct gccaatcaac atcagggttg               60

                                                                                60

<210>98

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-19)的合成寡核苷酸

<400>98

gcccaataca gaaacgtgtg ggacgtggac tattcggcct ttgatgcaaa ccactgcagc               60

                                                                                60

<210>99

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-20)的合成寡核苷酸

<400>99

ccgtgcggaa cacctcttca aacatgatgt tcatggcatc gctgcagtgg tttgcatcaa               60

                                                                                60

<210>100

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-21)的合成寡核苷酸

<400>100

tgaagaggtg ttccgcacgg agttcggctt ccacccgaat gctgagtgga ttctgaagac               60

                                                                                60

<210>101

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-22)的合成寡核苷酸

<400>101

gatgcgcttg ttctcatagg cgtgttccgt gttcacgaga gtcttcagaa tccactcagc               60

                                                                                60

<210>102

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-23)的合成寡核苷酸

<400>102

cctatgagaa caagcgcatc actgttgaag gcgggatgcc atctggctgt tccgcaacaa               60

                                                                                60

<210>103

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-24)的合成寡核苷酸

<400>103

tagagcacgt agatgttatt caaaattgtg ttgatgatgc ttgttgcgga acagccagat               60

                                                                                60

<210>104

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-25)的合成寡核苷酸

<400>104

aataacatct acgtgctcta cgccttgcgt agacactatg agggggttga gctggacacc               60

                                                                                60

<210>105

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-26)的合成寡核苷酸

<400>105

ttgccaccac gatgtcgtct ccataggaga tcatggtgta ggtgtccagc tcaaccccct               60

                                                                                60

<210>106

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-27)的合成寡核苷酸

<400>106

agacgacatc gtggtggcaa gcgattatga tctggacttt gaggccctca agcctcactt               60

                                                                                60

<210>107

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-28)的合成寡核苷酸

<400>107

gcttttgtca gctggagtaa tggtttggcc aagagatttg aagtgaggct tgagggcctc               60

                                                                                60

<210>108

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-29)的合成寡核苷酸

<400>108

ttactccagc tgacaaaagc gacaaaggtt ttgttcttgg tcactccatt actgacgtca               60

                                                                                60

<210>109

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-30)的合成寡核苷酸

<400>109

ccagtgccat aatccatgtg gaagtgtctt ttgaggaaag tgacgtcagt aatggagtga               60

                                                                                60

<210>110

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-31)的合成寡核苷酸

<400>110

cacatggatt atggcactgg gttttacaaa cctgtgatgg cctcgaagac cctcgaggct               60

                                                                                60

<210>111

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-32)的合成寡核苷酸

<400>111

acttctcctg gatggtccca cggcgtgcaa aggagaggat agcctcgagg gtcttcgagg               60

                                                                                60

<210>112

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-33)的合成寡核苷酸

<400>112

tgggaccatc caggagaagt tgatttccgt ggcaggactc gccgtccact ccggaccaga               60

                                                                                60

<210>113

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-34)的合成寡核苷酸

<400>113

aaagaggccc tggaagggct caaagagacg ccggtactcg tctggtccgg agtggacggc               60

                                                                                60

<210>114

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-35)的合成寡核苷酸

<400>114

agcccttcca gggcctcttt gagattccaa gctacagatc actttacctg cgttgggtga               60

                                                                                60

<210>115

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(3d-36A)的合成寡核苷酸

<400>115

gcaatcgaat tcttatgcgt cgccgcacac ggcgttcacc caacgcaggt aaagt                    55

<210>116

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(pGEX5)的合成寡核苷酸

<400>116

ctggcaagcc acgtttggtg                                                           20

<210>117

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3D(pGEX3)的合成寡核苷酸

<400>117

ggagctgcat gtgtcagagg                                                           20

<210>118

<211>639

<212>DNA

<213>口蹄疫病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(639)

<223>VP-1蛋白的合成核苷酸和氨基酸序列

<400>118

acc acc tct gcg ggt gag tct gcg gac ccg gtg act gcc acc gtt gag                 48

Thr Thr Ser Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu

  1               5                  10                  15

aac tac ggt ggt gag acc caa gtt cag cgt cgc cag cac acg gac agc                 96

Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Ser

             20                  25                  30

gcg ttc atc ttg gac cgt ttc gtg aaa gtt aag cca aag gaa caa gtt                 144

Ala Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Lys Pro Lys Glu Gln Val

         35                  40                  45

aat gtg ttg gac ctg atg cag atc cct gcc cac acc ttg gta ggt gcg                 192

Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala

     50                  55                  60

ctc ctg cgt acg gcc acc tac tac ttc tct gac ctg gag ctg gcc gtt                 240

Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Leu Ala Val

 65                  70                  75                  80

aag cac gag ggc gat ctc acc tgg gtt cca aac ggc gcc cct gag acc                 288

Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Thr

                 85                  90                  95

gca ctg gac aac act acc aac cca acc gct tac cac aag gaa ccg ctc                 336

Ala Leu Asp Ash Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Glu Pro Leu

            100                 105                 110

acc cgt ctg gcg ctg cct tac acg gct cca cac cgt gtt tta gcg acc                 384

Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr

        115                 120                 125

gtt tac aac ggt agc agc aag tac ggt gac acc agc act aac aac gtg                 432

Val Tyr Asn Gly Ser Ser Lys Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asn Val

    130                 135                 140

cgt ggt gac ctg caa gtg tta gct cag aag gca gaa cgt act ctg cct                 480

Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Thr Leu Pro

145                 150                 155                 160

acc tcc ttc aac ttc ggt gcc atc aag gca act cgt gtt act gaa ctg                 528

Thr Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu

                165                 170                 175

ctc tac cgt atg aag cgt gcc gag acc tac tgt ccg cgt ccg ctg ctc                 576

Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu

            180                 185                 190

gcc att caa ccg agc gac gct cgt cac aag cag cgt att gtg gca ccg                 624

Ala Ile Gln Pro Ser Asp Ala Arg His Lys Gln Arg Ile Val Ala Pro

        195                 200                 205

gca aaa cag ctg ctg                                                             639

Ala Lys Gln Leu Leu

    210

<210>119

<211>954

<212>DNA

<213>口蹄疫病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(954)

<223>2C蛋白的合成核苷酸和氨基酸序列

<400>119

ctc aaa gca cgt gac atc aac gac ata ttt gcc gtt ctt aag aac ggt                 48

Leu Lys Ala Arg Asp Ile Asn Asp Ile Phe Ala Val Leu Lys Asn Gly

  1               5                  10                  15

gag tgg ctg gtc aaa ctg atc ctg gcc atc cgc gac tgg att aag gca                 96

Glu Trp Leu Val Lys Leu Ile Leu Ala Ile Arg Asp Trp Ile Lys Ala

             20                  25                  30

tgg atc gcc tca gaa gag aag ttt gtc acc atg aca gac ctg gtg cct                 144

Trp Ile Ala Ser Glu Glu Lys Phe Val Thr Met Thr Asp Leu Val Pro

         35                  40                  45

ggc atc ctt gaa agt caa cgg gat ctc aat gac ccc ggc aaa tac aag                 192

Gly Ile Leu Glu Ser Gln Arg Asp Leu Asn Asp Pro Gly Lys Tyr Lys

     50                  55                  60

gag gcc aag gaa tgg ctg gac aac gcg cgt caa gcg tgt ttg aag agc                 240

Glu Ala Lys Glu Trp Leu Asp Asn Ala Arg Gln Ala Cys Leu Lys Ser

 65                  70                  75                  80

ggg aac gtg cac att gcc aat ctg tgt aaa gtg gtc gct ccg gcg ccc                 288

Gly Ash Val His Ile Ala Asn Leu Cys Lys Val Val Ala Pro Ala Pro

                 85                  90                  95

agc aag tcg aga ccc gaa cca gtg gtc gtg tgc ctt cgc ggc aaa tcc                 336

Ser Lys Ser Arg Pro Glu Pro Val Val Val Cys Leu Arg Gly Lys Ser

            100                 105                 110

ggc aca agg aaa agc atc ctc gcg aac gtg ctc gcg cag gca att tcc                 384

Gly Thr Arg Lys Ser Ile Leu Ala Asn Val Leu Ala Gln Ala Ile Ser

        115                 120                 125

aca cac ttc act ggt agg acc gac tcg gtc tgg tac tgc ccg ccc gac                 432

Thr His Phe Thr Gly Arg Thr Asp Ser Val Trp Tyr Cys Pro Pro Asp

    130                 135                 140

cct gac cac ttt gac ggt tac aat cag cag acc gtc gtc gtg atg gac                 480

Pro Asp His Phe Asp Gly Tyr Asn Gln Gln Thr Val Val Val Met Asp

145                 150                 155                 160

gac ttg ggc caa aac cca gac ggc aaa gac ttc aag tac ttt gcc caa                 528

Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Lys Asp Phe Lys Tyr Phe Ala Gln

                165                 170                 175

atg gtc tcc acc acg ggg ttc atc ccg cct atg gcc tcg ctc gag gat                 576

Met Val Ser Thr Thr Gly Phe Ile Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu Asp

            180                 185                 190

aag ggt aaa ccc ttc aac agc aag gtc ata ata gct aca acc aac ctg                 624

Lys Gly Lys Pro Phe Ash Ser Lys Val Ile Ile Ala Thr Thr Asn Leu

        195                 200                 205

tac tcg gga ttc acc cca aag acc atg gtg tgc ccc gat gcg ctt aac                 672

Tyr Ser Gly Phe Thr Pro Lys Thr Met Val Cys Pro Asp Ala Leu Ash

    210                 215                 220

cgg agg ttt cac ttt gac atc gac gtg agc gcc aaa gac ggg tac aag                 720

Arg Arg Phe His Phe Asp Ile Asp Val Ser Ala Lys Asp Gly Tyr Lys

225                 230                 235                 240

atc aac aac aaa ctg gac ata gtc aaa gca ctt gaa gac acc cac gct                 768

Ile Asn Asn Lys Leu Asp Ile Val Lys Ala Leu Glu Asp Thr His Ala

                245                 250                 255

aac ccg gtg gcg atg ttc caa tac gac tgc gct ctt ctc aac gga atg                 816

Asn Pro Val Ala Met Phe Gln Tyr Asp Cys Ala Leu Leu Asn Gly Met

            260                 265                 270

gcc gtt gaa atg aag aga atg cag caa gac atg ttc aag cct caa cca                 864

Ala Val Glu Met Lys Arg Met Gln Gln Asp Met Phe Lys Pro Gln Pro

        275                 280                 285

ccc ttc cag aac atc tac cag ctc gtt cag gag gtg att gag cgg gtg                 912

Pro Phe Gln Ash Ile Tyr Gln Leu Val Gln Glu Val Ile Glu Arg Val

    290                 295                 300

gaa cta cac gaa aag gtg tcg agc cac ccg ata ttt aaa cag                         954

Glu Leu His Glu Lys Val Ser Ser His Pro Ile Phe Lys Gln

305                 310                 315

<210>120

<211>1281

<212>DNA

<213>口蹄疫病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1281)

<223>3ABC蛋白的合成核苷酸和氨基酸序列

<400>120

att tca atc cct tcc cag aag tcc gtg ttg tac ttc ctc att gag aag                 48

Ile Ser Ile Pro Ser Gln Lys Ser Val Leu Tyr Phe Leu Ile Glu Lys

  1               5                  10                  15

ggt cag cac gaa gca gcg atc gag ttc ttc gag ggg atg gtc cac gat                 96

Gly Gln His Glu Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu Gly Met Val His Asp

             20                   25                 30

tcc atc aaa gag gaa ctc cga ccc ctc att cag cag acc tcg ttc gta                 144

Ser Ile Lys Glu Glu Leu Arg Pro Leu Ile Gln Gln Thr Ser Phe Val

         35                  40                  45

aaa cgc gcc ttc aag cgc ctg aaa gag aac ttt gaa gtt gta gcc ctg                 192

Lys Arg Ala Phe Lys Arg Leu Lys Glu Asn Phe Glu Val Val Ala Leu

     50                  55                  60

tgt ttg acc ctc ttg gca aac ata gtg att atg ctc cgc caa gcg cgc                 240

Cys Leu Thr Leu Leu Ala Asn Ile Val Ile Met Leu Arg Gln Ala Arg

 65                  70                  75                  80

aag agg tac caa tcg gtg gat gac cca ctg gac ggc gac gta gct ctt                 288

Lys Arg Tyr Gln Ser Val Asp Asp Pro Leu Asp Gly Asp Val Ala Leu

                 85                  90                  95

ggc gac gcg gaa aag aac cct ctg gag acg agt gcc gct agc cgt gtc                 336

Gly Asp Ala Glu Lys Ash Pro Leu Glu Thr Ser Ala Ala Ser Arg Val

            100                 105                 110

ggt ttc aga gag aga tcc ccc acc gag caa ggg acg cgc gaa gac gcg                 384

Gly Phe Arg Glu Arg Ser Pro Thr Glu Gln Gly Thr Arg Glu Asp Ala

        115                 120                 125

aac gct gag ccc gtc gtg ttc ggt agg gaa caa ccg cga gct gaa gga                 432

Asn Ala Glu Pro Val Val Phe Gly Arg Glu Gln Pro Arg Ala Glu Gly

    130                 135                 140

ccc tac gct ggg cca ctc gag cgt cag aaa cct ctt aaa gtg aaa gcc                 480

Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala

145                 150                 155                 160

gag ctg cca caa cag gag gga cca tac gcc ggc cca atg gag aga cag                 528

Glu Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Glu Arg Gln

                165                 170                 175

aaa ccg cta aag gtg aaa gca aaa gcc ccc gtc gtg aag gaa gga cct                 576

Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly Pro

            180                 185                 190

tac gag gga ccg gtg aag aaa cct gtc gct tta aaa gtg aaa gca aag                 624

Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys

        195                 200                 205

aac ttg ata gtc act gag agt ggt gcg cca ccg acc gac ttg caa aag                 672

Asn Leu Ile Val Thr Glu Ser Gly Ala Pro Pro Thr Asp Leu Gln Lys

    210                 215                 220

atg gtc atg ggc aac act aag cca gtc gag ctc atc ctc gac ggc aag                 720

Met Val Met Gly Ash Thr Lys Pro Val Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys

225                 230                 235                 240

acg gta gcc att tgc tgt gct acc gga gtg ttc ggc act gcc tac ctc                 768

Thr Val Ala Ile Cys Cys Ala Thr Gly Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu

                245                 250                 255

gtg cct cgt cat ctc ttc gcg gaa aag tac gac aag atc atg ttg gac                 816

Val Pro Arg His Leu Phe Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp

            260                 265                 270

ggc aga gcc ttg aca gac agt gac tac aga gtg ttt gag ttt gag att                 864

Gly Arg Ala Leu Thr Asp Ser Asp Tyr Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile

        275                 280                 285

aaa gta aaa gga cag gac atg ctc tca gac gcc gct ctc atg gtg ttg                 912

Lys Val Lys Gly Gln Asp Met Leu Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu

    290                 295                 300

cac cgt ggg aat cgc gtg cgt gac atc acg aaa cac ttt cgt gac gta                 960

His Arg Gly Asn Arg Val Arg Asp Ile Thr Lys His Phe Arg Asp Val

305                 310                 315                 320

gcg aga atg aag aag gga acc ccc gtc gtc ggt gtg atc aac aat gct                 1008

Ala Arg Met Lys Lys Gly Thr Pro Val Val Gly Val Ile Asn Asn Ala

                325                 330                 335

gac gtc ggg aga ctc ata ttc tct ggt gta gcc ctc act tac aag gac                 1056

Asp Val Gly Arg Leu Ile Phe Ser Gly ValAla Leu Thr Tyr Lys Asp

            340                 345                 350

atc gtc gtg tgt atg gat gga gac acc atg cct ggg ctc ttt gcc tac                 1104

Ile Val Val Cys Met Asp Gly Asp Thr Met Pro Gly Leu Phe Ala Tyr

        355                 360                 365

agg gca tcc acc aag gca ggc tac tgc gga gga gcc gtc ctg gca aag                 1152

Arg Ala Ser Thr Lys Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val Leu Ala Lys

    370                 375                 380

gac ggg gcc gaa acg ttc atc gtt ggc acc cac tcc gca ggt gga aac                 1200

Asp Gly Ala Glu Thr Phe Ile Val Gly Thr His Ser Ala Gly Gly Asn

385                 390                 395                 400

ggc ata gga tac tgt tcg tgt gtt tcc cga tca atg ctc ctg aag atg                 1248

Gly Ile Gly Tyr Cys Ser Cys Val Ser Arg Ser Met Leu Leu Lys Met

                405                 410                 415

aag gca cac atc gac cct gaa cca cac cac gag                                     1281

Lys Ala His Ile Asp Pro Glu Pro His His Glu

            420                 425

<210>121

<211>1413

<212>DNA

<213>口蹄疫病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1410)

<223>3D蛋白的合成核苷酸和氨基酸序列

<400>121

ggg ttg atc gtt gat acc aga gat gtg gaa gag cgc gtc cat gta atg                 48

Gly Leu Ile Val Asp Thr Arg Asp Val Glu Glu Arg Val His Val Met

  1               5                  10                  15

cgc aaa acc aag ctt gca ccc acc gtc gcg cac ggt gtg ttc aat cct                 96

Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val Phe Ash Pro

             20                  25                  30

gag ttc ggg cct gcc gcc ttg tct aac aag gac cca cgt ctg aac gaa                 144

Glu Phe Gly Pro Ala Ala Leu Ser Asn Lys Asp Pro Arg Leu Asn Glu

         35                  40                  45

ggt gtt gtc ctc gat gaa gtc att ttc tcc aag cat aaa gga gac aca                 192

Gly Val Val Leu Asp Glu Val Ile Phe Ser Lys His Lys Gly Asp Thr

     50                  55                  60

aag atg tct gag gag gac aaa gcg ctg ttc cgc cgc tgc gct gct gac                 240

Lys Met Ser Glu Glu Asp Lys Ala Leu Phe Arg Arg Cys Ala Ala Asp

 65                  70                  75                  80

tac gcg tca cgc ctg cac agt gtg ctg ggt acg gca aat gcc cca ctg                 288

Tyr Ala Ser Arg Leu His Ser Val Leu Gly Thr Ala Asn Ala Pro Leu

                 85                  90                  95

agc att tac gag gca atc aag ggc gtt gac gga ctc gac gcc atg gag                 336

Ser Ile Tyr Glu Ala Ile Lys Gly Val Asp Gly Leu Asp Ala Met Glu

            100                 105                 110

cca gac acc gca cct ggc ctt ccc tgg gcc ctc cag ggg aaa cgc cgc                 384

Pro Asp Thr Ala Pro Gly Leu Pro Trp Ala Leu Gln Gly Lys Arg Arg

        115                 120                 125

ggt gca ctt atc gat ttc gag aac ggc acg gtc gga ccc gag gtt gag                 432

Gly Ala Leu Ile Asp Phe Glu Asn Gly Thr Val Gly Pro Glu Val Glu

    130                 135                 140

gct gcc ttg aag ctc atg gag aaa aga gaa tac aag ttt gtt tgc cag                 480

Ala Ala Leu Lys Leu Met Glu Lys Arg Glu Tyr Lys Phe Val Cys Gln

145                 150                 155                 160

acc ttc ctg aag gac gaa att cgc ccg atg gag aaa gta cgt gcc ggc                 528

Thr Phe Leu Lys Asp Glu Ile Arg Pro Met Glu Lys Val Arg Ala Gly

                165                 170                 175

aag act cgc att gtc gac gtt ttg cct gtt gaa cac att ctt tac acc                 576

Lys Thr Arg Ile Val Asp Val Leu Pro Val Glu His Ile Leu Tyr Thr

            180                 185                 190

agg atg atg att ggc aga ttt tgt gca caa atg cac tca aac aac ggg                 624

Arg Met Met Ile Gly Arg Phe Cys Ala Gln Met His Ser Asn Asn Gly

        195                 200                 205

ccg cag att ggc tca gcg gtc ggt tgc aac cct gat gtt gat tgg cag                 672

Pro Gln Ile Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Asp Trp Gln

    210                 215                 220

aga ttc ggc aca cac ttc gcc caa tac aga aac gtg tgg gac gtg gac                 720

Arg Phe Gly Thr His Phe Ala Gln Tyr Arg Asn Val Trp Asp Val Asp

225                 230                 235                 240

tat tcg gcc ttt gat gca aac cac tgc agc gat gcc atg aac atc atg                 768

Tyr Ser Ala Phe Asp Ala Ash His Cys Ser Asp Ala Met Asn Ile Met

                245                 250                 255

ttt gaa gag gtg ttc cgc acg gag ttc ggc ttc cac ccg aat gct gag                 816

Phe Glu Glu Val Phe Arg Thr Glu Phe Gly Phe His Pro Asn Ala Glu

            260                 265                 270

tgg att ctg aag act ctc gtg aac acg gaa cac gcc tat gag aac aag                 864

Trp Ile Leu Lys Thr Leu Val Ash Thr Glu His Ala Tyr Glu Ash Lys

        275                 280                 285

cgc atc act gtt gaa ggc ggg atg cca tct ggc tgt tcc gca aca agc                 912

Arg Ile Thr Val Glu Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser Ala Thr Ser

    290                 295                 300

atc atc aac aca att ttg aat aac atc tac gtg ctc tac gcc ttg cgt                 960

Ile Ile Ash Thr Ile Leu Asn Ash Ile Tyr Val Leu Tyr Ala Leu Arg

305                 310                 315                 320

aga cac tat gag ggg gtt gag ctg gac acc tac acc atg atc tcc tat                 1008

Arg His Tyr Glu Gly Val Glu Leu Asp Thr Tyr Thr Met Ile Ser Tyr

                325                 330                 335

gga gac gac atc gtg gtg gca agc gat tat gat ctg gac ttt gag gcc                 1056

Gly Asp Asp Ile Val Val Ala Ser Asp Tyr Asp Leu Asp Phe Glu Ala

            340                 345                 350

ctc aag cct cac ttc aaa tct ctt ggc caa acc att act cca gct gac                 1104

Leu Lys Pro His Phe Lys Ser Leu Gly Gln Thr Ile Thr Pro Ala Asp

        355                 360                 365

aaa agc gac aaa ggt ttt gtt ctt ggt cac tcc att act gac gtc act                 1152

Lys Ser Asp Lys Gly Phe Val Leu Gly His Ser Ile Thr Asp Val Thr

    370                 375                 380

ttc ctc aaa aga cac ttc cac atg gat tat ggc act ggg ttt tac aaa                 1200

Phe Leu Lys Arg His Phe His Met Asp Tyr Gly Thr Gly Phe Tyr Lys

385                 390                 395                 400

cct gtg atg gcc tcg aag acc ctc gag gct atc ctc tcc ttt gca cgc                 1248

Pro Val Met Ala Ser Lys Thr Leu Glu Ala Ile Leu Ser Phe Ala Arg

                405                 410                 415

cgt ggg acc atc cag gag aag ttg att tcc gtg gca gga ctc gcc gtc                 1296

Arg Gly Thr Ile Gln Glu Lys Leu Ile Ser Val Ala Gly Leu Ala Val

            420                 425                 430

cac tcc gga cca gac gag tac cgg cgt ctc ttt gag ccc ttc cag ggc                 1344

His Ser Gly Pro Asp Glu Tyr Arg Arg Leu Phe Glu Pro Phe Gln Gly

        435                 440                 445

ctc ttt gag att cca agc tac aga tca ctt tac ctg cgt tgg gtg aac                 1392

Leu Phe Glu Ile Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Tyr Leu Arg Trp Val Ash

    450                 455                 460

gcc gtg tgc ggc gac gca          taa                                            1413

Ala Val Cys Gly Asp Ala

465                 470