组织工程化细胞外基质的制备方法

摘要

一种组织工程化细胞外基质的制备方法，本发明的特点是采用动物基质蛋白和成纤维细胞为原料培养制备，包括培养液制备、基质蛋白提取、细胞一基质蛋白培养物制备、细胞外基质培养、冻融去细胞、消毒灭菌封装的步骤。本发明所制备的组织工程化细胞外基质，具有一定的强度，无明显免疫排斥反应、保存方法简便，保存期长；不仅可用于皮肤创面修复和皮肤缺损的充填材料，而且可作为生物支架材料用于其他组织工程器官的制备，在临床研究和治疗中可发挥多方面的作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物材料的人工器官技术领域，具体涉及一种组织工程化细胞外基质的制备方法。

背景技术

细胞外基质由细胞分泌合成，位于细胞外部，构成结缔组织，不仅具有连接、支持、保水、抗压及保护的物理作用，而且对细胞的生命活动发挥全方位的生物学作用，主要表现在：(1)影响细胞的存活、生长与死亡；正常真核细胞，除成熟血细胞外，大多须粘附于细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，上皮细胞及内皮细胞一旦脱离了细胞外基质则会发生程序性死亡。(2)决定细胞的形状；这一作用是通过其受体影响细胞骨架的组装而实现的。不同细胞具有不同的细胞外基质，介导的细胞骨架组装的状况不同，从而表现出不同的形状。(3)控制细胞的分化；细胞通过与特定的细胞外基质成分作用而发生分化。例如，成肌细胞在纤维粘连蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在层粘连蛋白上则停止增殖，进行分化，融合为肌管。(4)参与细胞的迁移；细胞外基质可以控制细胞迁移的速度与方向，并为细胞迁移提供“脚手架”。例如，纤维粘连蛋白可促进成纤维细胞及角膜上皮细胞的迁移；层粘连蛋白可促进多种肿瘤细胞的迁移。细胞的趋化性皆依赖于细胞外基质。一些基质细胞都可以合成和分泌胶原纤维、弹力纤维等许多细胞外基质(ECM)成分。如成纤维细胞就具有多种功能特性，同时在合成和调节细胞外基质成分中起着重要作用，有整合素等黏附分子的表达。

由于细胞外基质对细胞的形状、结构、功能、存活、增殖、分化、迁移等一系列生命现象具有全面的影响，因而无论在胚胎发育的形态发生和器官形成过程中，或在维持成体结构与功能完善(包括免疫应答及创伤修复等)的一切生理活动中均具有不可忽视的重要作用。

目前临床常用的细胞外基质产品主要来源于天然材料，最常用的是皮肤来源的脱细胞真皮，它作为一种天然的真皮替代物，主要由成纤维细胞所分泌合成的细胞外基质组成，在组织成分上与自体皮肤最相近，具有完整的胶原三维结构和高生物相容性。既可作为永久性真皮替代物用于皮肤创面修复，又可用作软组织的替代物，广泛应用于烧伤、整形外科、口腔、神经外科、眼科、耳鼻喉科等学科领域。其可以阻止创面的收缩，提供皮肤的支持力和弹性，对皮肤移植物的稳定性和皮肤创面的愈合具有非常重要的作用。其来源主要包括：人源性(如美国的Alloderm)由于其来源于人体，与机体具有良好的生物相容性，然而由于存在来源有限和伦理问题而难以广泛应用；而异种动物来源的细胞外基质(如猪的脱细胞真皮)由于种属间的免疫排斥反应的存在，临床效果不佳。

发明内容

本发明针对上述问题，提出了一种组织工程化细胞外基质的制备方法，使所制备的组织工程化细胞外基质具有一定的强度、无明显免疫排斥反应、保存方法简便、保存期长，同时具有来源不受限制、不产生伦理道德问题的优点，能在临床研究和治疗中发挥多方面的作用。

本发明组织工程化细胞外基质的制备方法包括有以下步骤：

1、培养液的配制

(1)基础培养基

              成份                     最终浓度

商用最低必需培养液DMEM               65-70％(v/v)

商用培养液F12                        20-25％(v/v)

胎牛血清                             5-15％(v/v)

胰岛素                               1～50ng/ml

氢化可的松                           10～500ng/ml

腺嘌呤                               0.2～0.25mM

转铁蛋白                             1～10mg/ml

表皮生长因子                         1～100ng/ml

抗生素                               10～200i.u/ml

(2)培养液1

基础培养基+牛垂体提取物0.1～2％(V/V)

(3)培养液2

基础培养基+维生素C 10～30μg/ml

(4)培养液3

基础培养基+碱性成纤维细胞生长因子0.5ng～10ng/ml

2、基质蛋白的提取：其提取方法为，取新鲜动物皮肤剪碎，绞成肉泥，2.5倍Tris-HCl缓冲液搅拌8～12小时，离心弃上清，将沉淀物用3％(v/v)冰醋酸萃取24～48小时，离心取上清液，加入NaCl至终浓度1.0mol/L，盐析20～40小时后离心弃上清，将沉淀物溶解于含1.7mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液中20～40小时，离心弃去沉淀，在上清液加入NaCl至终浓度2.5mol/L，盐析20～40小时，离心弃上清，沉淀物用0.1％(v/v)冰醋酸溶解后透析纯化，真空冻干并消毒，作为细胞外基质的制备原料。

3、细胞-基质蛋白培养物的制备：在无菌条件下，将制备的基质蛋白和壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素按照8∶1∶0.5∶0.5的重量比混合，用0.1％的醋酸溶液配制成重量比为0.5％～10％的溶液，再按其体积的10％加入胎牛血清和10mg/ml的DMEM培养基，调节pH值为7.2～7.4；加入所需的细胞悬液，使终浓度为10⁴-10⁶个细胞/ml，再将其加至(器皿中的)支撑膜(如尼龙膜、硅胶膜、橡胶膜、高分子材料膜、生物衍生材料膜等)表面上，在37℃、5％CO₂条件下固化30分钟；加入培养液1，每天换液，37℃条件下培养2～4天，形成细胞—基质蛋白培养物。所述的细胞为成纤维细胞，或可向成纤维细胞分化的干细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞，如骨髓间充质干细胞，造血干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞，肝脏干细胞、神经干细胞中的一种或几种。

4、细胞外基质的培养：将上述的细胞—基质蛋白培养物置于培养器皿中的不锈钢支架上，继续加入培养液1每天换液，培养2～4天后更换为培养液2每天换液，培养6～8天后更换为培养液3，每天换液培养1～2天，组织工程化细胞外基质即培养完毕。上述各步骤的培养条件均为37℃，5％CO₂环境，加入的培养液均淹没细胞外基质表面。

5、去细胞处理：无菌条件下将组织工程化细胞外基质用0.1％磷酸盐缓冲液清洗后，浸泡于无菌的去离子水中清洗；再于-196℃～-80℃中30～80分钟，确保组织工程化细胞外基质内外的温度达到一致，将其取出后置于室温下自然解冻，如此反复冻融2～5次，使细胞完全破裂崩解；最后将其置于冷冻干燥机内冻干，如此处理可彻底去除存活的细胞，而组织工程化细胞外基质的结构和蛋白质成分无破坏。

6、消毒后无菌封装。在4℃条件下，可保存1～2年。

本发明所制备的组织工程化细胞外基质，是通过组织工程、细胞生物学的手段，将体外培养的人成纤维细胞与分离、提取的动物源性细胞外基质混合构成组织工程化细胞外基质结构，并进行共同培养，在培养过程中，成纤维细胞仍然继续增殖，吸收动物源性细胞外基质，合成并重新分泌细胞外基质成分。待细胞外基质改建完成后，破除成纤维细胞，保留对细胞生长代谢具有非常重要调节功能的细胞外基质成分。

本发明所制备的组织工程化细胞外基质具有一定的强度，而且去除细胞成分，不会引起明显免疫排斥反应。在临床治疗中主要功能有：(1)结合自体表皮移植修复深度皮肤缺损；(2)作为组织充填材料而使局部丰满；(3)可用于颜面部凹陷畸形的修复，如颞部、颊部凹陷；(4)充当组织加强物，替代筋膜，修复膜性缺损，修复营养不良和感染创面；不稳定瘢痕及难治性溃疡病灶清除后，真皮移植可促进愈合，防止复发；(5)可做为生物支架材料用于其他组织工程器官的制备，如组织工程化角膜、组织工程化耳鼓膜、组织工程化肌腱、组织工程化牙周膜、组织工程化周围神经等。

本发明组织工程化细胞外基质的制备方法以及按其方法获得的组织工程化细胞外基质与现有方法和产品相比，具有以下优点：

1)本发明的制备方法具有成本低、方法简便、易于操作、使用方便、来源广泛和易于贮存的特点，对各种普通软组织创伤有良好的治疗效果，是一种较好的创伤修复材料。

2)本发明制备的细胞外基质，经冻干处理为白色或粉红色，具有海绵状网孔结构(图1，2)，可覆盖创面、充填软组织缺损、促进创周细胞的生长和增殖，植入体内可逐渐被机体自身细胞所改建、吸收，最终完成创面修复功能。

3)本发明所制备的组织工程化细胞外基质破除了活细胞(图3)，避免了异体细胞所导致的免疫排斥反应；同时降低了保存难度，延长了保存周期。

4)本发明的制备方法具有原料来源不受限制，不产生伦理道德问题。

5)本发明所制备的组织工程化细胞外基质具有一定的弹性和韧性，其形状大小和厚度易于改变，便于临床缝合固定。

6)本发明由于在制备过程中主要使用物理方法来去除抗原成分，与现有脱细胞技术工艺相比避免了化学物质的使用，减少了化学物质残留，提高了所获得产品的生物相容性，利于被机体接受。

附图及其说明

附图1为本发明所制备组织工程化细胞外基质的外观照片，为白色或粉红色海绵状结构。

附图2为附图1的局部放大照片，可见海绵状网孔结构。

附图3为本发明所制备组织工程化细胞外基质纵切面的显微放大照片，可见组织工程化细胞外基质内未有细胞核，具有网状结构。

附图4为猪背部皮肤烫伤治疗前的大体照片，可见皮肤损伤处直径约3cm，表面部分脱落呈苍白色，边缘见一条红色充血带。

附图5为猪背部皮肤烫伤后使用本发明制备的组织工程化细胞外基质修复2周后的大体照片，可见皮肤缺损已修复，疤痕不明显，颜色接近正常肤色。

具体实施方式

实施例1

现结合实验将本发明制备方法做进一步的详细说明：

1、培养液的配制

(1)基础培养基

        成份                             最终浓度

商用最低必需培养液DMEM                 67.5％(v/v)

商用培养液F12                          22.5％(v/v)

胎牛血清                               10％(v/v)

胰岛素                                 10ng/ml

氢化可的松                             30ng/ml

腺嘌呤                                 0.22mM

转铁蛋白                               6mg/ml

表皮生长因子                           80ng/ml

抗生素                                 180i.u/ml

(2)培养液1

基础培养基+牛垂体提取物0.5％(V/V)

(3)培养液2

基础培养基+维生素C 20μg/ml

(4)培养液3

基础培养基+碱性成纤维细胞生长因子5ng/ml

2、基质蛋白的提取：本发明采用哺乳动物(可以是牛、兔、猪等)皮肤中提取的基质蛋白混合物，其中包含有I、II、III、IV型胶原、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等成分，与人体真皮成分接近。其提取方法为：取新鲜胎牛皮肤剪碎，绞成肉泥，2.5倍Tris-HCl缓冲液搅拌10小时，离心弃上清，将沉淀物用3％(v/v)冰醋酸萃取25小时，离心取上清液，加入NaCl至终浓度为1.0mol/L，盐析24小时后离心弃上清，将沉淀物溶解于含1.7mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液中26小时，离心弃沉淀，在上清液加入NaCl至终浓度为2.5mol/L，盐析40小时，离心弃上清，沉淀物用0.1％(v/v)冰醋酸溶解后透析纯化，真空冻干并消毒，作为组织工程化细胞外基质的生产原料。

3、细胞-基质蛋白培养物的制备：在无菌条件下，将基质蛋白和壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素按8∶1∶0.5∶0.5的重量比混合，用0.1％的醋酸溶液配制成重量比为2％的溶液，再按其体积的10％加入胎牛血清和10mg/ml的DMEM培养基，调节pH值为7.2，加入成纤维细胞悬液，使终浓度为10⁶个细胞/ml，再将其加至器皿中的尼龙膜表面上，在37℃、5％CO₂条件下固化30分钟；再将培养液1加至其中；每天换液，37℃条件下培养2天，形成细胞—基质蛋白培养物。

4、组织工程化细胞外基质的培养：将上述制备的细胞—基质蛋白培养物放置于不锈钢支架上，另置于培养器皿中，继续加入培养液1每天换液，培养3天后更换为培养液2，每天换液，培养6天后更换为培养液3，每天换液，培养2天组织工程化细胞外基质即培养完毕。上述各步骤的培养条件均为37℃、5％CO₂环境，加入的培养液均淹没细胞外基质表面。

5、去细胞处理：无菌条件下取出组织工程化细胞外基质，用0.1％磷酸盐缓冲液清洗后浸泡于无菌的去离子水中清洗，再置于-196°的液氮中40分钟，确保组织工程化细胞外基质内外的温度达到一致；将其取出后室温下自然解冻，如此反复冻融3次，使细胞完全破裂崩解；最后将其置于冷冻干燥机内冻干。

6、冻干后的组织工程化细胞外基质为便于临床使用，在使用前可采用机械或物理方法在组织工程化细胞外基质上均匀地切或扎制若干个平行交错的缝隙，缝隙长5-15mm，缝隙穿透皮肤，缝隙的平行间距和纵向间距均为2-10mm，贯穿组织工程化细胞外基质全层。

7、本发明可采用⁶⁰Co或环氧乙烷消毒，无菌封装。在4℃条件下，可保存2年。使用前揭去尼龙膜。

实施例2.烫伤创面修复试验

1)动物皮肤深II度烫伤模型制备：约克猪50kg麻醉后背部备皮消毒铺无菌巾。使用烫伤仪：温度100℃，压力1kg，时间25s；制备烫伤创面(图4)。

2)上述模型制备后24小时，麻醉动物，彻底去除所有创面坏死组织，修整创面后将本发明制备的组织工程化细胞外基质从无菌密封袋中取出，撕去尼龙膜，覆盖于创面，打包包扎。空白对照组采用常规凡士林油纱布覆盖创面。术后5天首次打开创面，常规换药，观察创面并取创面组织行HE染色观察、特异性染色观察并计算创面平均愈合时间。结果：

  组别  例数  平均愈合时间(天)  空白对照组  10  24.37±3.25  使用本发明细胞外基质组  10  13.65±3.41

使用本发明制备的细胞外基质修复组2周后，可见皮肤缺损已修复，疤痕不明显，颜色接近正常肤色(图5)。

结论：本发明制备的组织工程化细胞外基质可以明显缩短烫伤创面的愈合时间。