一种植物逆境生理监测与高抗植物筛选的方法及其装置

摘要

本发明提供一种植物逆境生理监测与高抗植物筛选的方法，主要是检测逆境下植物绿色组织叶绿体光诱导延迟荧光强度，反映植物逆境生理状况和植物最适生长环境，从而判断出植物抗性的大小，以此来快捷地筛选高抗植物。一种实现前述方法的装置，包括可伸缩样品暗室、温控组件、可见光激发组件、弱光探测组件、模数转换器、数据处理组件、计算机；可见光激发组件及弱光探测组件与可伸缩样品暗室相连接，弱光探测组件通过模数转换器与数据处理组件相连接，所述数据处理组件与计算机相连接。本发明操作性能灵敏、快捷，可以准确侦断植物抗逆性的大小，进而可方便快捷地筛选高抗植物；可进行长期监测，逆境侦测范围极其广泛。

说明书

                        技术领域

本发明涉及一种植物逆境生理与抗逆性监测技术，特别涉及一种植物逆境生理监测与高抗植物筛选的方法及其装置。

                        背景技术

逆境伤害(例如：冷害、冻害、热害、水涝、干旱、盐碱、病害、虫害、杂草、辐射、毒害化学物质、恶劣气象因子等)一直是制约植物生长发育、农作物增产增收的主要原因。开展植物逆境生理与抗逆性监测与研究，以及筛选和选育高抗植物不仅在生命科学基础研究中有着重大的理论意义，而且在农业生产中也具有重大的现实意义。植物逆境生理的早期侦测，是精致化栽培管理的重要工作，目前在植物逆境侦测应用最广泛的是叶绿素荧光侦测仪，它是利用叶绿素自发性荧光讯号来实现逆境监测的。这就不可避免的牵涉到探测讯号过于微弱的问题，尽管激光诱发荧光(laser-induced fluorescence；LIF)技术能提高其讯号强度，但是这一技术仍然存在着不能长期监测、逆境侦测范围狭窄等问题。而且在某些实际应用中需要与自动化温室结合，这就限制了其实际应用的范围，增大了其实际应用的成本，不利于在农业生产中的普及和推广。同时也注意到这项技术在高抗植物筛选中存在着各种参数混杂、参数波动性较大(荧光参数易受外界环境因素与植物自身生理状况的影响)等问题。而传统理化抗性签定采用的电导仪法是根据细胞浸提液电导率的大小来判断植物抗逆性的强弱的，显然实验周期过长，灵敏度不高等问题相当突出。

                        发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的缺点和不足，提供一种操作性能灵敏、快捷，可以准确侦断植物抗逆性的大小，进而可方便快捷地筛选高抗植物的植物逆境生理监测与高抗植物筛选的方法。

本发明的另一目的在于提供一种实现上述植物逆境生理监测与高抗植物筛选方法的装置。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种植物逆境生理监测与高抗植物筛选的方法，其特征在于：检测逆境下植物绿色组织叶绿体光诱导延迟荧光强度，反映植物逆境生理状况和植物最适生长环境，从而判断出植物抗性的大小，以此来快捷地筛选高抗植物。

所述逆境是指所有对植物生长发育产生伤害作用的环境条件(例如：冷害、冻害、热害、水涝、干旱、盐碱、病害、虫害、杂草、辐射、毒害化学物质、恶劣气象因子等)。

本植物逆境生理监测与高抗植物筛选的方法更具体地包括下述步骤：

(1)将待测生境中生长着的活体植株的叶片置于样品暗室，暗适应一段时间，此暗适应时间即是叶片表面温度建立时间，所述叶片表面温度可调。

(2)用可见光作为激发光源均匀辐照叶片，诱导植株叶片叶绿体产生光诱导延迟荧光。

(3)利用弱光探测组件接收来自测量植株叶片断光后的延迟荧光信号，并将其转换成电信号。

(4)将电信号通过模数转换器转换为数字信息并输入计算机。

(5)利用数据处理软件对数字信号进行数据处理，得到测量植株叶片的延迟荧光强度随时间的衰减。

(6)利用数据处理软件进行数据处理，得到测量植株叶片的延迟荧光在一定时间范围的积分强度。

(7)将逆境中的植株的绿色组织的叶绿体光诱导延迟荧光强度与同种处于最适生境下的对照植株的绿色组织的叶绿体光诱导延迟荧光强度相比，得到该植株的逆境生理状况、逆境伤害程度，并且根据最大绿色组织的叶绿体光诱导延迟荧光强度对应的植物实际生境，来判断植物抗逆性的大小，进而筛选出高抗植物。

所述步骤(1)中暗适应时间为0～5h；叶片表面温度在-8～52℃范围内可调。

所述步骤(2)中可见光的光照强度为0～2000μmolm^-2s^-1、波长为390～770nm；其中优选范围是540～700nm，此优选范围的可见光可较好地诱导植株叶片叶绿体产生延迟荧光，而且容易得到，实施比较简单、方便。

所述步骤(2)中可见光作为激发光源均匀辐照叶片时间为0～60min。

所述步骤(2)中可见光作为激发光源均匀辐照叶片后，关闭激发光源，延时0.02～20s，然后开始记录可见光诱导的叶绿体的延迟荧光。

所述步骤(6)中的时间范围为0～30min。

一种实现上述植物逆境生理监测与高抗植物筛选方法的装置，包括可伸缩样品暗室、温控组件、可见光激发组件、弱光探测组件、模数转换器、数据处理组件、计算机；可见光激发组件及弱光探测组件与可伸缩样品暗室相连接，弱光探测组件通过模数转换器与数据处理组件相连接，所述数据处理组件与计算机相连接。

所述可见光激发组件为LED光照件；所述弱光探测组件包括光纤、光电倍增管模块，光纤一端伸入暗室，另一端与光电倍增管模块相连接，所述数据处理组件为单片机处理系统，所述单片机处理系统一方面通过模数转换器与所述光电倍增管模块相连接，使光电倍增管模块在获取信号后输送至单片机处理系统进行处理，另一方面亦通过控制接口(如模拟开关、继电器)与光电倍增管模块相连接，以控制光电倍增管模块的启动或停止。

本发明的作用原理是：本发明者研究发现植物绿色组织叶绿体光诱导延迟荧光能灵敏地反映出植物实际生境的好坏以及逆境伤害的程度(延迟荧光在相同温度下测定)；具有相同光合速率的同种植物叶片在同样生境下的延迟荧光强度在误差允许范围内几乎相同；延迟荧光强度与光合速率保持良好的正相关性；植物的光合速率与其生长发育的环境有很直接的关系，是其生长环境的良好表征者。总的来说：处于最适生长环境中的植物，绿色组织就会表现出最大光合能力和最大光合速率，相应的绿色组织的光诱导延迟荧光强度就为最大；处于亚适生长环境中的植物，绿色组织的光合能力和光合速率就会下降，相应的绿色组织的光诱导延迟荧光强度就会同幅度的减小；当生境进一步恶化，表现出逆境伤害时，此时光合速率和延迟荧光强度的大小就会急速的下降，其下降程度可以反应逆境伤害程度以及植物逆境生理状况。

延迟荧光强度公式方程为 $>>I>>(>t>)>>=>>\int >0>>+>\infty >\; >i>>(>t>)>>dt>,>$>I指延迟荧光衰减动力学曲线下的面积积分。它决定于植物的类型、生长发育周期、生长环境状况以及测量延迟荧光的条件：叶片的暗适应时间、激发光波长、激发时间、延迟时间、样品测量时的温度。在测量条件统一(如：暗适应时间，激发时间，延迟时间都相同，温度24℃)的情况下，选择相同生长发育周期的同种值物叶片，测量其延迟荧光强度，它能真实而灵敏的反应出植物生长环境的好坏和逆境伤害的程度。

经过研究发现，每种植物都有自己特定的最适生长环境，通过测量逆境下植物绿色组织叶绿体光诱导延迟荧光衰减动力学曲线下的面积积分强度，可以比较准确而灵敏的反映植物植物逆境生理状况和植物最适生长环境，从而判断出植物抗性的大小，以此来快捷的筛选高抗植物。

本发明相对现有技术具有如下的优点及效果：由于光合作用是植物生长发育的基础，是植物各种代谢过程中最为重要最为敏感的进程。逆境伤害首当其冲的就是光合器官，表现为植物光合速率的下降，从而引起光诱导延迟荧光的下降。另一方面，植物最适生境下的光合能力显然表现为最大，即是光诱导延迟荧光为最大。即使是实际生境很细微的改变，也会引起光诱导延迟荧光很灵敏的变化。其次才是理化检测所能检测到的生境改变对植物生长的影响程度；最后才是人肉眼能感觉得到或者是能看得见的植物生长发育被被改变的效果。所以本发明方法通过测量植物绿色组织叶绿体光诱导延迟荧光来监测植物逆境生理与抗逆性以及筛选高抗植物具有灵敏和快捷的特点。由于不同逆境对同种植物胁迫程度不同，因此通过测量植物绿色组织叶绿体光诱导延迟荧光，可以对多种植物逆境进行监测，从而侦测逆境种类及受害程度；另一方面，同种逆境对不同植物的胁迫程度也是不同，因此测量光诱导延迟荧光可以侦断植物抗逆性的大小，进而方便快捷的筛选高抗植物。而且实现本发明监测方法的发明装置与现有的装置相比不仅具有简便快捷的特点，而且还具有灵敏、可靠，可长期监测的特点，逆境侦测范围也极其广泛；其波长选择弹性较大，且可提供极易与荧光讯号区分的可选择的高强度光源。

                       附图说明

图1是本发明装置的结构示意图。

图2是利用图1所示装置实现的大豆叶片在不同温度生境下叶片叶绿体光诱导延迟荧光强度的变化。

图3是利用图1所示装置实现的玉米叶片在不同温度生境下叶片叶绿体光诱导延迟荧光强度的变化。

图4是利用图1所示装置实现的水稻叶片在不同浓度氯化钠(NaCl)生境下叶片叶绿体光诱导延迟荧光强度的变化。

图5是利用图1所示装置实现的高粱叶片在不同浓度氯化钠(NaCl)生境下叶片叶绿体光诱导延迟荧光强度的变化。

                      具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

图1示出了本发明装置的具体结构，由图1可见，本植物逆境生理监测与高抗植物筛选装置包括可伸缩样品暗室1、暗室开关2、样品平槽3、温控组件4、滤波片5、可见光激发组件、弱光探测组件、模数转换器、数据处理组件、USB接口11、显示器12、输入键盘13、计算机14；可见光激发组件及弱光探测组件与可伸缩样品暗室1相连接，弱光探测组件通过模数转换器10(在此选用A/D转换器)与数据处理组件相连接，所述数据处理组件通过USB接口11与计算机14相连接。所述可伸缩性暗室1便于活体伸入检测；所述温控组件4由半导体制冷器和热敏电阻构成，控温范围为-8～52℃，控温精度为±0.1℃；所述可见光激发组件为LED光照件6，光照强度在0～2000μmolm^-2s^-1范围内可调；所述弱光探测组件包括光纤7、光电倍增管模块8，光纤7一端伸入暗室1，另一端与光电倍增管模块8相连接；所述数据处理组件为单片机处理系统9，所述单片机处理系统一方面通过模数转换器10与所述光电倍增管模块8相连接，使光电倍增管模块8在获取信号后输送至单片机处理系统9进行处理，另一方面亦通过控制接口(如模拟开关、继电器)与光电倍增管模块8相连接，以控制光电倍增管模块的启动或停止。计算机14在此选用Intel公司的Pentium IV型微机；数据处理软件在此选用VB、EXCEL或ORIGIN软件。

测量时，将不同温度生境下的大豆叶片(幼苗期，置于特定温度下2个小时后)置于样品室中暗适应10分钟(测量温度为24℃)，用LED灯激发1s(光强选用500μmolm^-2s^-1)，延迟0.25s，记录随后5s内的延迟荧光衰减信号。用VB软件统计数据，在ORIGIN软件中处理得到延迟荧光强度，如图2所示，进一步数据处理知：大豆的最适生长温度是26℃，适宜生长温度范围是20～30℃。18℃以下的生境是大豆的低温逆境伤害温度段，其逆境生理状况与最适生理状况相比在12～18℃温度段内为显著低温逆境伤害(*)；10℃以下为极显著低温逆境伤害(**)；32℃以上的生境是大豆的高温逆境伤害温度段，其逆境生理状况与最适生理状况相比在32～34℃温度段内为显著高温逆境伤害(*)；36℃以上为极显著高温逆境伤害(**)。

实施例2

本实施例采用的装置同实施例1。将上述装置应用于玉米叶片(幼苗期，置于特定温度下2个小时后)置于样品室中暗适应10分钟(测量温度为24℃)，用LED灯激发1s(光强选用500μmolm^-2s^-1)，延迟0.25s，记录随后5s内的延迟荧光衰减信号。用VB软件统计数据，在ORIGIN软件中处理得到延迟荧光强度，如图3所示，进一步数据处理知：玉米的最适生长温度是32℃，适宜生长温度范围是26～40℃。24℃以下的生境是玉米的低温逆境伤害温度段，其逆境生理状况与最适生理状况相比在22～24℃温度段内为显著低温逆境伤害(*)；20℃以下为极显著低温逆境伤害(**)；42℃以上的生境是玉米的高温逆境伤害温度段，其逆境生理状况与最适生理状况相比在42℃附近为显著高温逆境伤害(*)；44℃以上为极显著高温逆境伤害(**)。

综合实例1和实例2：大豆的最适生长温度是26℃，适宜生长温度是20～30℃，玉米的最适生长温度是32℃，适宜生长温度是26～40℃；大豆在18℃开始表现为显著低温逆境伤害，玉米在24℃开始表现为显著低温逆境伤害；大豆在32℃开始表现为显著高温逆境伤害，玉米在42℃开始表现为显著高温逆境伤害；由上述比较可知大豆是相对耐低温而不耐高温的植物，玉米是相对耐高温而不耐低温的植物。

实施例3

本实施例采用的装置同实施例1。将上述装置应用于水稻叶片(幼苗期，生长于不同盐浓度下1小时后)置于样品室中暗适应40分钟(测量温度为28℃)，用LED灯激发10s(光强选用1000μmolm^-2s^-1)，延迟0.25s，记录随后5s内的延迟荧光衰减信号。用VB软件统计数据，在ORIGIN软件中处理得到延迟荧光强度，如图4所示，进一步数据处理知：水稻最适生长盐浓度是40M，适宜生长盐浓度范围为20～60M；盐浓度达到80M时，表现出显著盐胁迫伤害(*)；盐浓度达到100M以上时，表现出极显著盐胁迫伤害(**)。

实施例4

本实施例采用的装置同实施例1。将上述装置应用于高粱叶片(幼苗期，生长于不同盐浓度下1小时后)置于样品室中暗适应40分钟(测量温度为28℃)，用LED灯激发10s(光强选用1000μmolm^-2s^-1)，延迟0.25s，记录随后5s内的延迟荧光衰减信号。用VB软件统计数据，在ORIGIN软件中处理得到延迟荧光强度，如图5所示，进一步数据处理知：高粱最适生长盐浓度是60M，适宜生长盐浓度范围为20～80M；盐浓度达到100M时，表现出显著盐胁迫伤害(*)；盐浓度达到120M以上时，表现出极显著盐胁迫伤害(**)。

综合实例3和实例4：水稻最适生长盐浓度是40M，适宜生长盐浓度范围为20～60M，高粱最适生长盐浓度是60M，适宜生长盐浓度范围为20～80M；水稻在盐浓度达到80M时表现出显著盐胁迫伤害，高粱在盐浓度达到100M时表现出显著盐胁迫伤害；水稻在盐浓度达到100M以上时表现出极显著盐胁迫伤害，高粱在盐浓度达到120M以上时表现出极显著盐胁迫伤害；由上述比较可知水稻是相对盐敏感即抗盐能力弱的植物，高粱是相对盐耐受即抗盐能力强的植物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。