一种提高长春花中长春碱含量的方法

摘要

一种提高长春花中长春碱含量的方法，它是将鲜长春花去除杂质后加入培养液和诱导剂进行鲜磨匀浆培养，培养24－60h后，经HPLC检测培养液及固体物料中长春花长春碱的含量提高了45－70％，同时，长春新碱含量也有提高。该方法生产周期短方法，易操作，适合于工业化生产。

说明书

所属技术领域：

本发明涉及一种提高长春花中长春碱含量的方法。

背景技术：

长春碱(vinblastine，VLB)，别名长春花碱，其硫酸盐硫酸长春碱，为国家基本药物，主要用于治疗霍其金病(Hodgkin’s disease)及绒毛膜上皮癌。目前，长春碱花类生物碱一般从夹竹桃科(Apocynaceae)植物长春花(Catharanthus roseus)中提取得到。长春花中含有近百种生物碱，其中大多数生物碱都具有活性，其中硫酸长春碱但由于长春花中长春碱的含量极低，化学合成方法很难实现工业化生产，因此，找到高含量的长春花生物碱的生产原料至关重要。

中华人民共和国国家知识产权局专利局2003年3月12日公开了《长春花完全适应型细胞大规模培养生成吲哚类生物碱的方法》(1401781)，以野生长春花种子为原始材料，获得长春花无菌苗，进一步诱导出愈伤组织，经过多代定向诱导驯化，建立了适合大规模培养的激素完全适应型细胞培养系统，该培养物中总生物碱含量和野生长春花相当，但培养物中不含具有细胞毒的长春碱和长春新碱。

发明内容：

本发明目的在于提供一种适合于工业化生产提高长春花中长春碱含量的方法。

本发明所采用的技术方案是：将鲜长春花去除杂质后加入培养液和诱导剂进行鲜磨匀浆培养，培养24-60h，得到生产长春花生物碱的原料。

本发明的优点是：

1.本发明生产周期短，方法简单，耗能少。

2.本发明克服了以往化学合成以及细胞培养等加工方法高成本、工序复杂、无法实现工业化的缺点，用本发明的方法生产长春花生物碱的生产原料，易操作、天然活性好，易于工业化生产。

具体实施方式：

下面是对本发明的进一步描述：

本发明是将鲜长春花去除杂质后进行鲜磨匀浆培养，培养24-60h，得到生产长春花生物碱的原料。

所述的鲜长春花是指含水率在20～85％的长春花，它包括以下两种情况：

(1)新采集的长春花的嫩茎叶，其含水率在50～85％，或

(2)采集后自然放置1～15天的长春花，其含水率在20～60％。

所述的培养液是指水、pH＝3.6-6.2的磷酸缓冲溶液、B5培养液及其改良配方。

所述的诱导剂是指由莽草酸，乙烯利，乙酸钠，脱落酸，裂环马钱子苷，血红蛋白，赤霉素，血红素，赤藓糖-4-磷酸，L-色氨酸，乙酰水杨酸，磷酸稀醇式丙酮酸，双氧水，细胞分裂素，茉莉酸甲酯，Ketoconazole，水杨酸，苯丙氨酸，钙调素，奎宁，辣根过氧化物酶中的一种或几种组成的混合配方。

所述的鲜磨是指鲜长春花置于打浆机中，加入2-5倍溶有诱导剂的培养液进行鲜磨处理，磨浆时间为2-7min，物料的最终粒度为0.02～10μm。

所述的匀浆培养是指将经过鲜磨的物料导入能够截留组分0.02～10μm粒子的多孔微滤膜的培养罐中，每隔1-3h在负压0.06～0.1MPa吸气或正压0.1～0.6MPa进气条件下进行一次匀浆培养，每次培养时间为5-20min。

下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。

实施例1：

新采集、含水率为70-80％的长春花10kg分成4等分，分别置于打浆机中，加入溶有诱导剂的培养液10kg，磨浆时间为3min，物料的最终粒度为0.02～8μm。然后倒入带有滤膜的培养罐中，采用负压0.06～0.1MPa吸气或正压0.1～0.6MPa进气方式每隔2h进行一次匀浆培养，每次培养时间为10min。培养24h后，HPLC法测定此时原料中长春花生物碱的含量，结果表明经此工艺后原料中长春碱的含量提高55％，长春新碱的含量提高65％。

本例中培养液配方如下：

(1)培养液为纯净水；

(2)诱导剂的配方为：

乙酸钠            0.02μmol/L

乙烯利            1mg/L

脱落酸            0.2mg/L

L-色氨酸          25μmol/L

乙酰水杨酸             15μmol/L

血红蛋白               50μg/L

血红素                 50μg/L

双氧水                 0.15mmol/L

苯丙氨酸               3mg/L

茉莉酸甲酯             0.25μmol/L

辣根过氧化物酶         0.0065μmol/L

实施例2：

将采集后自然放置3天含水率60％的长春花50kg分成10等分，分别置于打浆机中，加入溶有诱导剂的培养液15kg，磨浆时间为5min，物料的最终粒度为0.02～10μm。然后倒入带有滤膜的培养罐中，采用负压0.06～0.1MPa吸气或正压0.1～0.6MPa进气方式每隔1h进行一次匀浆培养，每次培养时间为15min。培养36h后，HPLC法测定此时原料中长春花生物碱的含量，结果表明经此工艺后原料中长春碱的含量提高48％，长春新碱的含量提高53％。

本例中培养液配方如下：

(1)标准B5培养液；

(2)诱导剂的配方为：

莽草酸                   0.05μmol/L

裂环马钱子苷             0.04μmol/L

乙烯利                   1.2mg/L

脱落酸                   2mg/L

L-色氨酸                 250mg/L

赤藓糖-4-磷酸            0.08μmol/L

血红素                   300mg/mL

双氧水                   100μmol/L

钙调素                   3mg/L

茉莉酸甲酯               0.020μmol/L

水杨酸                   1mg/L

辣根过氧化物酶           0.0065μmol/L

实施例3：

将采集后自然放置5天含水率43％的长春花50kg分成10等分，分别置于打浆机中，加入溶有诱导剂的培养液20kg，磨浆时间为5min，物料的最终粒度为0.02～10μm。然后倒入带有滤膜的培养罐中，采用负压0.06～0.1MPa吸气或正压0.1～0.6MPa进气方式每隔1h进行一次匀浆培养，每次培养时间为20min。培养48h后，HPLC法测定此时原料中长春花生物碱的含量，结果表明经此工艺后原料中长春碱的含量提高38％，长春新碱的含量提高42％。

本例中培养液配方如下：

(1)pH＝5.8磷酸缓冲溶液；

(2)诱导剂的配方为：

莽草酸                  0.05μmol/L

裂环马钱子苷            0.04μmol/L

乙烯利                  1.2mg/L

脱落酸                  2mg/L

L-色氨酸                250mg/L

赤藓糖-4-磷酸           0.08μmol/L

血红素                  300mg/mL

双氧水                  100μmol/L

奎宁                    1mg/L

茉莉酸甲酯              0.020μmol/L

水杨酸                  1mg/L

辣根过氧化物酶          0.0065μmol/L