人细胞膜抗原的保存方法及磁性粒子包被人细胞膜抗原

摘要

一种人细胞膜抗原的保存方法及磁性粒子包被人细胞膜抗原，属于生物技术领域，特别是涉及细胞膜的保存方法。本发明提供一种使细胞膜抗原在不依赖细胞的活性条件下，完整地保持其抗原性的磁性粒子包被人细胞膜抗原及其保存方法。首先制备红细胞抗原，再制备磁性粒子，最后将细胞膜抗原包被磁性粒子。本发明是使细胞膜抗原在不依赖细胞的活性条件下，完整地保持其抗原性。本发明以磁性粒子改造活的人体细胞为无活性细胞，但保持了细胞膜抗原的抗原性。无限期保存的该磁性粒子具有原人体细胞膜抗原的抗原性，包括红细胞、血小板、白细胞等人体细胞膜抗原。同时对于分离和分析液体介质中颗粒性抗原抗体反应比常规离心技术要简单，易于操作和观察结果，更有效率。

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，特别是涉及细胞膜的保存方法。

背景技术：

对人体细胞膜抗原及其特异性抗体的研究和检测是生物科学、免疫学实验研究和临床检测的最基本内容之一。如对人体细胞膜HLA抗原、CD标记物的研究是人类免疫学最基本的基础和应用研究之一，对人ABO和Rh血型抗原和抗体检测是临床常规检测项目。一些人体细胞膜抗原的生物特征，如抗原性依赖于细胞的活性，往往细胞死亡，溶解，抗原性即消失，如红细胞死亡，Rh血型抗原抗原性消失，人体内也不存在可溶性Rh血型抗原。Rh血型抗原也不能被提纯，因为它们是红细胞膜结构蛋白，脱离了细胞膜其抗原性也消失。因此，对Rh血型抗体的检测，必须应用有活力的红细胞。对人ABO血型抗体的检测，也称之为ABO血型反定型，在全世界各国至今都是应用新鲜红细胞作为标准抗原，而新鲜红细胞保存期很短，最长保存期3至6个月，而且在此期间，抗原性也递减。保存红细胞活性，即保持其抗原性，长期以来是生命科学、免疫学未能很好解决的问题，至今一些保存红细胞方法，如低温冷冻(在低温冰箱和液氮中)，很难大量冻存，只能由此类方法保存的少量标本，如对稀有红细胞血型的红细胞保存。细胞冻存时间愈长，其抗原性愈弱，愈易消失。冻干红细胞与红细胞液态低温保存比较，理论上应该是冻干红细胞抗原性保持时间要长，即使有少数研究红细胞冻干的报告文章，但至今还未能够得到实际应用。

由上所述，人体细胞膜抗原的抗原性长期保持的问题，以及对其有效应用至今都未能解决。而这些问题表现为细胞膜抗原的抗原性依赖于细胞本身的活性，即存活的细胞有抗原性，死亡的细胞，细胞膜抗原性消失。至今最为常用的是低温(冰箱和液氮)保存方式，也只是在一定时期内，维持细胞膜的抗原性，仅适用于对少量特别珍贵的细胞标本的保存。

技术内容：

本发明提供一种使细胞膜抗原在不依赖细胞的活性条件下，完整地保持其抗原性的人细胞膜抗原的保存方法及磁性粒子包被人细胞膜抗原。

本发明的具体过程是：

一、红细胞抗原的制备：

①取新鲜红细胞，离心去上清。取压积红细胞进入下一步处理；

②在压积红细胞中加入SDS置于室温状态；

③然后进行离心去上清，留沉淀物加入蒸馏水；

二、磁性粒子的制备：

①金属盐的溶解，将FeCL₂及FeCL₃加入蒸馏水中进行溶解；

②金属盐的水解，在剧烈搅拌的状态下，将氢氧化钠加入到上述金属盐溶液中，使其水解为金属复合氧化物，也就是铁颗粒溶液；

三、细胞膜抗原包被磁性粒子：

将步骤一获得的红细胞膜抗原加入到步骤二获得的铁颗粒溶液中，再加入聚乙二醇，进行孵育，离心后弃上清，留沉淀，再在沉淀物中加入低渗磷酸缓冲液，即得包被了磁性粒子的细胞膜抗原。

本发明由上述保存方法所获得的包被了磁性粒子的细胞膜抗原。

本发明是使细胞膜抗原在不依赖细胞的活性条件下，完整地保持其抗原性，本发明采用的技术方案是即应用四氧化三铁颗粒取代人体细胞膜内容物，而保持细胞膜抗原的抗原性。包被细胞膜抗原的四氧化三铁颗粒具有磁性，在磁场作用下，在反应介质中与相应抗体发生了特异性免疫反应的细胞膜抗原抗体复合物被分离出来，进而可以通过免疫凝集反应技术，或者通过免疫标记检测技术(包括酶联免疫分析技术、免疫荧光分析技术、同位素免疫分析技术、免疫发光技术等)，用肉眼或仪器设备进行分析判断细胞膜抗原和抗体免疫反应。

本发明以磁性粒子改造活的人体细胞为无活性细胞，但保持了细胞膜抗原的抗原性。无限期保存的该磁性粒子具有原人体细胞膜抗原的抗原性，包括红细胞、血小板、白细胞等人体细胞膜抗原。同时对于分离和分析液体介质中颗粒性抗原抗体反应比常规离心技术要简单，易于操作和观察结果，更有效率。

具体实施方式：

本发明具体过程是：

一、红细胞抗原的制备：

①取新鲜红细胞，离心去上清。取压积红细胞进入下一步处理；

②在压积红细胞中加入SDS置于室温状态；

③然后进行离心去上清，留沉淀物加入蒸馏水；

二、磁性粒子的制备：

①金属盐的溶解，将FeCL₂及FeCL₃加入蒸馏水中进行溶解；

②金属盐的水解，在剧烈搅拌的状态下，将氢氧化钠加入到上述金属盐溶液中，使其水解为金属复合氧化物，也就是铁颗粒溶液；

三、细胞膜抗原包被磁性粒子：

将步骤一获得的红细胞膜抗原加入到步骤二获得的铁颗粒溶液中，再加入聚乙二醇，进行孵育，离心后弃上清，留沉淀，再在沉淀物中加入低渗磷酸缓冲液，即得包被了磁性粒子的细胞膜抗原。

由上述保存方法所获得的包被了磁性粒子的细胞膜抗原。

1.包被磁性粒子保存完整性红细胞膜血型抗原

1.1.红细胞膜抗原的制备

(1)取3人份人新鲜红细胞，每人3ml，共9ml，离心3000转/分钟，去上清，取压积红细胞5ml，留样0.5ml，将4.5ml进入下步处理。

(2)压积红细胞中加入1％SDS40ml，置室温30分钟。

(3)离心，2000转/分钟，10分钟，去上清，留沉淀，加入10ml蒸馏水。

1.2.磁性粒子的制备

1.2.1金属盐的溶解

将适量的FeCL₂及FeCL₃加入上述蒸馏水中，溶解。

1.2.2.金属盐的水解

剧烈搅拌下，向上述金属盐溶液中加入适量的氢氧化钠，使上述金属盐溶解水解为金属复合氧化物。

1.3.细胞膜抗原包被磁性粒子

(1)将步骤1制备的红细胞膜10ml中加入铁颗粒溶液3ml。

(2)加入聚乙二醇(分子量4000，浓度50％)1ml。

(3)56℃孵育1小时。

(4)离心3000转/分钟，弃上清，留沉淀。

(5)沉淀中加入低渗磷酸缓冲液10ml，(PB PH7.4)。

(6)分装上述溶液。

(7)冻干细胞膜包被的铁颗粒。冻干后置4℃保存。

1.4.检测包被磁性颗粒后保存红细胞膜血型抗原的完整性。

材料1：抗A、抗B、抗D、抗C、抗c、抗E、抗e单克隆血型抗体试剂。

材料2：1.1(1)步留下的新鲜红细胞，做为对照。

材料3：冻干的红细胞膜包被的铁颗粒。

材料4：磷酸盐缓冲液(0.15M，PH7.4)。

方法：试管血凝试验

①应用磷酸盐缓冲液3ml将冻干的磁性颗粒红细胞膜溶解。

②应用磷酸盐缓冲液将新鲜红细胞配成2％浓度悬液。

③取抗A、抗B、抗D、抗C、抗c、抗E、抗e单克隆血型抗体试剂。

④以2％新鲜红细胞悬液与抗A、抗B、抗D、抗C、抗c、抗E、抗e单克隆抗体反应，作为对照。

⑤将磁性颗粒0.10ml分别与不同稀释倍数的抗A、抗B、抗D、抗C、抗c、抗E、抗e单克隆抗体0.05ml滴入试管中。

⑥置室温20分钟，离心1000rpm/转，观察结果。

合格标准见下表：

  磁颗粒红细胞膜抗原  新鲜红细胞  抗A  抗B  抗D  抗C  抗c  抗E  抗e  3+～2+  3+～2+  2+～1+  2+～1+  2+～1+  2+～1+  2+～1+  4+～3+  4+～3+  3+～2+  3+～1+  3+～1+  3+～1+  3+～1+

2.应用

2.1、以96孔U型板凝集试验ABO血型为反定型为例说明其对完全抗体的检测。。

(1)液体试剂直接使用；冻干试剂需复苏：1ml蒸馏水加入冻干磁性粒子粉剂中。

(2)取96孔U型板，每孔滴入50ul被检血清(浆)。

(3)每孔加入相应的磁性粒子各50ul。

(4)置磁力分离器上分离10-20秒。

(5)置震荡器上震荡1分钟。

(6)肉眼观察凝集，出现凝集孔为血清中含有磁珠上包被的细胞膜抗原相应特异性抗体，为阳性反应。未出现凝集的孔为血清中不含有相应特异性抗体，为阴性反应。

2.2、对血清(浆)标本中不完全抗体的检测，以检测RhD血型抗-D抗体为例：

(1)(2)(3)(4)(5)步同2.1。

(6)加入完全抗体性质的抗-D(单克隆抗体)。

(7)震荡出现凝集反应为阴性反应。未出现凝集反应为阳性反应。

试验记录：

分别取100微升A.Bcell    +100微升3％磁粒混合      多数细胞未磁化，有完整细胞

分别取100微升A.Bcell    +200微升3％磁粒混合      多数细胞磁化，有完整细胞

分别取100微升A.Bcell    +300微升3％磁粒混合      多数细胞磁化，有完整细胞

将未磁化的细胞取出+100微升3％磁粒——细胞全部溶血。

将A、B磁化细胞分别合并，用盐水洗涤1次，检测。

检测：

1、A细胞倍化稀释16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、512倍

 A细胞 B细胞 A磁细胞 B磁细胞  H  ----  H  ----  W+  ----  W+  -----

2、B细胞倍化稀释16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、512倍

 A细胞 B细胞 A磁细胞 B磁细胞  ----  H  ----  H  ----  W+  -----  W+

注：磁化的A、B细胞本身有凝集。

分别取谱细胞1、2、3、4、5、6、7、8种，各100毫升，分别加入300毫升3％磁粒，用生理盐水洗2次。

用完全抗体检测抗原特异性：

  1正谱细胞 1磁 2正谱细胞 2磁 3正谱细胞 3磁    RHD  C   E  c   e4+ 4+  -- --- +4+ --- 4+ 4+  --3+ --- 2+ 3+  --4+ 2+  -- --- 2+2+ +   -- --- +  cell  K   ----  ----  MNS  M   N  --- 4+  4+  ---  2+  ----lewis--- ------ ----  ---- -------- ----  4正谱细胞  4磁场  5正谱细胞  5磁场  8正谱细胞  8磁4+ --- --- 4+ 3+3+ --- --- 3+ 3+--- 3+ --- 4+ 3+--- 2+ --- 3+ 2+      2+  2+

lewis抗原性较弱，正常及磁化细胞未检出。

反定型试剂的稳定性：

分别提取支A、B反定型试剂，于沸水浴中煮0.5h、1h、2h、2.5h后检测其抗原性

  ABAB cell Aceu 4+ --- Bceu --- 4+   A0.5  4+   B0.5  ---  4+   A1  4+  ----  B1  --  4+   A2  2+  ----  B2  --  2+   A2.5  +  ----  B2.5  ---  2+   ----

检测结果：煮沸1h，A、B磁化细胞为正常磁化细胞抗原性无明显差别，2h抗原性下降。