一种免疫层析检测用单分散金纳米粒子的制备方法

摘要

本发明的一种免疫层析检测用单分散金纳米粒子的制备方法属于纳米材料制备技术领域。以柠檬酸钠做还原剂，在水相中还原四氯金酸，其特征在于，柠檬酸钠和四氯金酸的摩尔比在7.0～20∶1范围；反应体系保持80～99℃；反应过程是将四氯金酸水溶液的pH值调节到2.0～5.0之间，在搅拌的条件下注入柠檬酸钠，继续搅拌反应至溶胶颜色不变化。本发明的方法具有操作简便、重复性好、成本低廉、适于生产的特点；所制备的金纳米粒子粒径在20～40nm，多分散度降低到5～10％之间，更适合生物标记和免疫层析技术的要求。

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料制备技术领域，特别涉及一种免疫层析检测用球形单分散金纳米粒子的制备方法。

背景技术

金纳米粒子作为最稳定的贵金属溶胶之一，具有许多独特的与尺寸相关的光学和电学性质。近年来，利用金纳米粒子作为功能单元进行纳米结构的组装、分子电子学器件的设计和生物检测标记物的研究层出不穷。其中利用金纳米粒子作为示踪标记物和显色剂发展起来的金标免疫层析检测技术，以其操作简便、成本低廉、检测快速且灵敏度高等优点而受到人们的关注。金标免疫层析检测的核心技术之一就是金纳米粒子的制备技术，制备粒径均一、形貌可控、稳定性好的高质量金纳米粒子是该技术产业化中的关键问题之一。

经研究表明，金标免疫层析检测的灵敏度和所使用的金纳米粒子尺寸密切相关，尺寸小于10nm的金纳米粒子和生物分子的偶联效率高，但其显色效果较差，不易于肉眼观察检测结果。大尺寸的金纳米粒子显色效果好，但偶联效率相对较差，尺寸在20～40nm间的金纳米粒子可以较好的满足偶联效率和显色效果两方面的要求，因此最为适用。

目前生物标记用金纳米粒子制备普遍采用的制备方法是水相中四氯金酸(HAuCl₄)还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、硫氰化钠、白磷、硼氢化钠、抗坏血酸、单宁酸等，其中又以柠檬酸钠还原剂应用最为广泛。这种方法能够有效地获得尺寸为10～20nm的金纳米粒子，要想获得粒径在20～40nm间的粒子，可以通过改变柠檬酸钠与四氯金酸的摩尔比来增大粒子的尺寸，但随着尺寸的增加，粒子的多分散度也随之增加，粒子形貌表现为椭球或其它不规则形状，粒子稳定性降低，尤其是在批量合成中，很难控制不同合成批次间的重复性。

为克服这些缺陷，许多研究小组发展了一些新的制备技术。如Natan小组发展了一种晶种生长法来获得单分散的大尺寸金纳米粒子(Brown，K.R.；Natan，M.J.Langmuir 1998，14，726.)，但该方法获得的粒子浓度很低，不适于实际生产。也有利用硫醇或其他种类的有机配体来控制金纳米粒子粒径的的制备方法，但都存在反应条件难以控制，结果重现性差和粒子浓度低等问题而难以满足免疫层析检测技术的生产要求。

与本发明最相接近的金纳米粒子制备方法是Frens法，该方法公开了利用柠檬酸钠和四氯金酸的还原反应，通过改变柠檬酸钠在粒子成核阶段的浓度得到不同粒径的金纳米粒子(13～150nm)。Frens法制备粒径为13nm的金纳米粒子的具体过程如下：首先，取5ml浓度为1％的HAuCl₄溶液，用水稀释到100ml，加热到沸腾，在搅拌的条件下一次性加入1％的柠檬酸钠溶液5ml，此时柠檬酸钠与Au³⁺的摩尔比约为3.5∶1，保持沸腾5分钟，即可得到红色的金纳米粒子溶胶。此时金纳米粒子的平均粒径为13nm，粒子多分散度为9.8％，粒子基本上为球形。在Frens法中，不同粒径的金纳米粒子可以通过相同的制备过程获得，只需改变柠檬酸钠溶液加入的量，即改变柠檬酸钠与Au³⁺的摩尔比，既可获得不同粒径的金纳米粒子。一般来说，制备的金纳米粒子的粒径随着柠檬酸钠与Au³⁺的摩尔比的减小而逐渐增大。如要制备粒径为20～40nm的金纳米粒子，需要将柠檬酸钠与Au³⁺的摩尔比降低在2.7～1.4∶1之间，柠檬酸钠与Au³⁺的摩尔比的减小引起了粒子单分散性的下降。如粒径为20nm的金纳米粒子其多分散度为12.9％，粒径为28nm的金纳米粒子其多分散度为20.9％，粒径为35nm的金纳米粒子其多分散度为32％。并且Frens法制备的金纳米粒子随着尺寸的增加，其形状从球形变成椭圆形或其他不规则形状，无法满足免疫层析检测技术的实际应用要求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对目前金纳米粒子水相制备方法中的问题和缺陷，建立一种制备粒径在20～40nm间的、单分散的球形金纳米粒子的方法，该方法具有操作简便、重复性好、成本低廉、适于生产的特点，所制得的金纳米粒子粒径可控性和单分散性好，适用于免疫层析检测技术的需要。

本发明的球形单分散的金纳米粒子的制备方法是，利用柠檬酸钠在水相中还原四氯金酸(HAuCl₄)，通过提高柠檬酸钠和Au³⁺的摩尔比例来保持纳米粒子的单分散性，通过调控反应体系的pH值来控制反应中成核与生长的速度从而制备不同粒径的球形单分散金纳米粒子。

具体的是，以柠檬酸钠做还原剂，在水相中还原四氯金酸，其特征在于，柠檬酸钠和四氯金酸的摩尔比在7.0～20∶1范围；反应体系保持80～99℃；反应过程是将四氯金酸水溶液的pH值调节到2.0～5.0之间，在搅拌的条件下注入柠檬酸钠，继续搅拌反应至溶胶颜色恒定。

四氯金酸水溶液的浓度范围可以是0.05×10^-3～1.0×10^-3mol/L。

所说的四氯金酸水溶液的pH值的调控是，在确定的柠檬酸钠与四氯金酸的摩尔比下，通过外加酸、碱和相当于酸或碱的盐将四氯金酸水溶液的pH值调节到2.0～5.0。比较好的pH值范围是2.9～3.6。

本发明的方法具有操作简便、重复性好、成本低廉、适于生产的特点，所制备的金纳米粒子粒径多分散度由Frens法中的10～35％降低到5～10％之间，粒径在20～40nm之间可以连续调控，样品存放时间较长。这些优点所合成的金纳米粒子更适合生物标记和免疫层析技术的要求。

具体实施方式：

实施例1：

取500ml浓度是0.25×10^-3mol/L的HAuCl₄溶液，利用盐酸溶液(1mol/L)调节四氯金酸水溶液的pH值为2.9，将该溶液加热到99℃，在搅拌的条件下一次性加入5％的柠檬酸钠溶液5ml，柠檬酸钠与四氯金酸的摩尔比约为7∶1，继续搅拌并保持溶液99℃，至溶胶颜色(红色)不变化，即获得平均粒径为20.0nm，粒子多分散度为6.0％，基本为球形的金纳米粒子。

实施例2：

取500ml浓度是0.25×10^-3mol/L的HAuCl₄溶液，利用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节四氯金酸水溶液的pH值为3.3，将该溶液在磁力加热搅拌器上加热到99℃，在搅拌的条件下一次性加入5％的柠檬酸钠溶液5ml，柠檬酸钠与四氯金酸的摩尔比约为7∶1，继续搅拌并保持温度在99℃，直至溶胶颜色(红色)不变化，即获得平均粒径为26.4nm，粒子多分散度为3.7％，基本为球形的金纳米粒子。

实施例3：

取500ml浓度是0.25×10^-3mol/L的HAuCl₄溶液，利用盐酸溶液(1mol/L)调节四氯金酸水溶液的pH值为3.0，将该溶液在磁力加热搅拌器上加热到99℃，在搅拌的条件下一次性加入5％的柠檬酸钠溶液7.5ml，柠檬酸钠与四氯金酸的摩尔比约为10.5∶1；继续搅拌并保持反应温度99℃，至溶胶颜色(红色)不变化，即获得平均粒径为31.8nm，粒子多分散度为6.4％，基本为球形的金纳米粒子。

实施例4：

取500ml浓度是0.25×10^-3mol/L的HAuCl₄溶液，利用碳酸钾溶液(1mol/L)调节四氯金酸水溶液的pH值为3.6，将该溶液在磁力加热搅拌器上加热到99℃，在搅拌的条件下一次性加入5％的柠檬酸钠溶液5ml，柠檬酸钠与四氯金酸的摩尔比约为7∶1；继续搅拌并保持反应温度99℃，至溶胶颜色(红色)不变化，即获得平均粒径为36.1nm，粒子多分散度为6.7％，基本为球形的金纳米粒子。

实施例5：

取500ml浓度是0.25×10^-3mol/L的HAuCl₄溶液，利用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节四氯金酸水溶液的pH值3.3，将该溶液在磁力加热搅拌器上加热到99℃，在搅拌的条件下一次性加入5％的柠檬酸钠溶液12.5ml，柠檬酸钠与四氯金酸的摩尔比约为17.5∶1，继续搅拌并保持反应温度99℃，直至溶胶颜色(红色)不变化，即获得平均粒径为38.5nm，粒子多分散度为7.8％，基本为球形的金纳米粒子。

实施例6：

取500ml浓度是0.25×10^-3mol/L的HAuCl₄溶液，利用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节四氯金酸水溶液的pH值为3.3，将该溶液在磁力加热搅拌器上加热到90℃，在搅拌的条件下一次性加入5％的柠檬酸钠溶液5ml，柠檬酸钠与四氯金酸的摩尔比约为7∶1，继续搅拌并保持反应温度90℃，直至溶胶颜色(红色)不变化，即获得平均粒径为24.2nm，粒子多分散度为6.1％，基本为球形的金纳米粒子。

实施例7：

取500ml浓度是0.25×10^-3mol/L的HAuCl₄溶液，利用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节四氯金酸水溶液的pH值为3.3，将该溶液在磁力加热搅拌器上加热到80℃，在搅拌的条件下一次性加入5％的柠檬酸钠溶液5ml，柠檬酸钠与四氯金酸的摩尔比约为7∶1，继续搅拌并保持反应温度80℃，直至溶胶颜色(红色)不变化，即获得平均粒径为24.9nm，粒子多分散度为7.1％，基本为球形的金纳米粒子。

实施例8：

取500ml浓度是0.25×10^-3mol/L的HAuCl₄溶液，利用盐酸溶液(1mol/L)调节四氯金酸水溶液的pH值为2.0，将该溶液加热到90℃，在搅拌的条件下一次性加入5％的柠檬酸钠溶液10ml，柠檬酸钠与四氯金酸的摩尔比约为14∶1，继续搅拌并保持温度90℃，直至溶胶颜色(红色)不变化。制备的金纳米粒子平均粒径为24.0nm，粒子多分散度为7.3％，粒子基本为球形。

实施例9：

取500ml浓度是0.25×10^-3mol/L的HAuCl₄溶液，利用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节四氯金酸水溶液的pH值5.0，将该溶液在磁力加热搅拌器上加热到99℃，在搅拌的条件下一次性加入5％的柠檬酸钠溶液5ml，柠檬酸钠与四氯金酸的摩尔比约为7∶1，继续搅拌并保持沸腾，直至溶胶颜色(红色)不变化。制备的金纳米粒子平均粒径为35.5nm，粒子多分散度为7.2％，粒子基本为球形。

上述的实施例1～9中，HAuCl₄溶液的浓度可以在0.05×10^-3～1.0×10^-3mol/L范围内改变，对制得金纳米粒子的效果没有太大的影响，即金纳米粒子的粒径仍在20～40nm范围、多分散度仍在5～10％之间、粒子形状基本为球形。