穿龙薯蓣体外微块茎繁殖方法

摘要

本发明属植物栽培繁殖技术特别涉及药用植物穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica Makino)的体外组织培养和微块茎的繁殖方法。本发明公开了应用体外组织培养和试管苗移栽等项技术进行野生药用植物穿龙薯蓣的体外微块茎培养和室外栽培方法。在体外培养条件下，利用穿龙薯蓣地上嫩茎切段、试管苗的带芽茎段以及试管苗小微块茎的带芽小块等为外植体，通过调制培养基，诱导试管植株。经过特殊处理使试管植株生成微块茎。发明还公开了将微块茎进行室外栽培的方法。本发明具有：1繁殖周期短；2移栽成活率高；3节省土地；4生产不受季节限制等优点。本发明可以应用于该植物的大规模工厂化生产领域。

说明书

技术领域

本发明属植物栽培繁殖技术特别涉及药用植物穿龙薯(Dioscorea nipponica Makino)的体外组织培养和微块茎的繁殖方法。

背景技术

穿龙薯蓣是我国常用的重要中药材品种之一，以根状茎入药，其主要有效成分为薯蓣总皂苷，既是生产治疗心血管疾病药物的主要药源，又是用于合成多种甾体激素类和避孕类药物的薯蓣皂苷元(diosgenin)的重要药源之一。由于市场需求逐年增加，野生资源逐年减少，穿龙薯蓣已成为濒危稀缺中药材。

种子繁殖因种子饱满度差、空秕率高，而难以解决大规模生产需要；常规的块茎繁殖不仅要消耗大量的块茎，而且繁殖系数低，生根困难，增殖速度和数量有限，也难以大规模推广。不管是野生品种还是栽培品种，生长周期一般为3-5年，块茎生长速度慢，同时易受到环境、季节、病虫害等影响，且多数药用薯蓣块茎不规则，不利于收获。

利用生物技术手段培养穿龙薯蓣是解决中草药种质资源短缺的重要途径，是现代最先进的中草药繁殖途径。它利用植物体细胞的全能性，即每一个细胞都含有与其母体相同的一套完整基因，都有成为一棵完整植株的潜力，可培育出保持原品种的固有性状和特性的微块茎。为了实现穿龙薯蓣的大规模工厂化生产，人们一直在努力寻找有效的途径。本发明的穿龙薯蓣体外微块茎繁殖方法为实现这一目标创造了条件。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过生物技术手段培养穿龙薯蓣微块茎的方法。

本发明提供的培养基为含有1.0-2.0毫克/升的6-苄基嘌呤(6-BA)、0.5-1.0毫克/升的萘乙酸(NAA)MS培养基(Murashige和Skoog氏培养基)。在诱导根培养基中，MS培养基中的各种成分均减至一半，并附加.1％-0.2％的活性炭，简称1/2MS培养基。

本发明使用的穿龙薯蓣外植体为穿龙薯蓣地上嫩茎切段、穿龙薯蓣试管苗的带芽茎段以及试管苗小微块茎的带芽小块。

培养穿龙薯蓣微块茎的方法，包括以下几个步骤；

(1)取生长旺盛的穿龙薯蓣的植株，减去所得嫩茎的叶片，按常规无菌方法在超净工作台上接种于含有1.0-2.0毫克/升的6-苄基嘌呤(6-BA)、0.5-1.0毫克/升的萘乙酸(NAA)MS诱导培养基中。在光照：1000-10000勒，每天14-20小时，温度18-24℃的条件下培养，诱导出带有茎和叶的无菌带根试管苗。

(2)在上一步骤中被诱导出的无菌带根试管苗移植在含有活性炭的成分减半的上述MS培养基中，在光照：1000-6000勒，每天8-16小时，温度18-24℃的条件下培养，直至主根膨大形成微块茎；或者：以其带芽茎段作为外植体进行再生培养，以继续诱导成无菌苗。

(3)将带有较大微块茎的无菌苗经炼苗后移至土壤中，先室内培养，然后转至室外。

(4)所得微块茎也可以作为外植体用于继续诱导无菌苗，其方法是，在无菌超净工作台上取出微块茎，以无菌蒸馏水洗净固体培养基，切成小块，每块作为一个外植体至少含一个芽点，即接种于MS培养基中，在光照：1000-10000勒，每天14-20小时，温度18-24℃的条件下培养。

实践证明，本发明采用的培养基较为适合培养穿龙薯蓣外植体形成微块茎，使得诱导、分化、成苗、生根能够一次完成；将MS培养基中的各种成分均减至一半，并附加.1％-0.2％的活性炭，即可作为促使微块茎生长的1/2MS培养基。方法简便，易于掌握，也便于工厂化生产和大面积推广。

下面将结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的范围并不局限于以下的实施例。

实施例

1.材料的制备与接种

从生长旺盛的穿龙薯蓣植株上剪下新发出的嫩茎段，用自来水冲洗2小时，再用蒸馏水洗2遍后；然后在超净工作台上先用70％乙醇浸泡约40秒，再用0.1％HgCl₂灭菌4分钟，无菌水洗6遍，以无菌滤纸吸干水后，切成0.5厘米左右的茎段(每段都带一个腋芽)，直立于MS培养基上。

2.诱导与增殖

接种在MS培养基上的外植体，2～3周以后，从原来的腋芽处开始长出1～2个小芽，以后，新长出的芽长至2～3个腋芽的小苗。

3.生根

待MS培养基上的小苗长高到3～4厘米(约3～4片叶)并有少量须根时转入1/2MS培养基上，5～15天后长出数条根。

4.产生微块茎

在MS培养基上生长的的小苗，少数有微块茎，较小；移至1/2MS培养基后，逐渐形成较大、较多的微块茎。

5.再分化

可将带多个腋芽的小苗剪成单株，接种在MS培养基上培养；也可以把小苗的顶芽剪下，接种至MS培养基上，让其再诱导芽；将对于带根小苗剪去须根，切成带芽茎段，接种至MS培养基上，再循环，就可以获得大量无菌苗，再进行微块茎诱导。

6.室外移栽

将带芽点的微块茎在培养基中培养，再生出植株后，打开盖，在室内炼苗2～3天，小心取出苗，以无菌水洗净培养基栽入已灭菌的土壤中。壮苗后，移到大田栽培。

尽管至此，已经详细地描述了本发明的内容和实施方式，本领域的技术人员在上述公开内容的基础上，有可能对本发明提出改进或变动，然而，应理解这些改进或变动仍未脱离本发明的范围和设计。