埃坡霉素C、其制备方法以及作为细胞抑制剂和植物保护剂的应用

摘要

本发明涉及式(I)的埃坡霉素C(R＝氢)及其制备方法，以及其在制备治疗剂和植物保护剂中的应用，所述治疗剂特别是细胞抑制剂。

说明书

本申请是1997年11月18日提交的，发明名称为“Epothilone C、D、E和F，其制备方法，以及作为细胞抑制剂和植物保护剂的应用”的中国专利申请97199814.0的分案申请。

技术领域

本发明涉及埃坡霉素C、D、E和F，其制备方法，以及在制备治疗性组合物和用于植物保护之组合物中的应用。

发明内容

埃坡霉素C和D

根据一个实施方案，本发明涉及埃坡霉素(C和D)，它们是如下得到的：

(a)在吸附树脂存在下以本领域已知的方式培养Sorangiumcellulosum DSM 6773，

(b)从培养物中取出吸附树脂，并用水/甲醇混合物洗涤，

(c)用甲醇淋洗经洗涤的吸附树脂，然后浓缩洗脱液，得到粗提物，

(d)用乙酸乙酯提取上述得到的浓缩物，浓缩提取物，并在甲醇和己烷之间分配，

(e)浓缩甲醇相，得到残液，该浓缩物在Sephadex柱上进行分步提取，

(f)得到包含所用微生物之代谢产物的提取部分，

(g)在C18反相柱上用甲醇/水混合物对上述得到的部分进行色谱分离，并顺序得到：

-包含埃坡霉素A的第一部分，

-包含埃坡霉素B的第二部分，

-包含第一种其它埃坡霉素的第三部分，

-包含第二种其它埃坡霉素的第四部分；

然后分离

(h1)上述第三部分中的第一种其它埃坡霉素；和

(h2)上述第四部分中的第二种其它埃坡霉素。

本发明还涉及经验式为C₂₆H₃₉NO₅S的埃坡霉素(C)，其特征在于具有如表1所示的¹H-和¹³C-NMR光谱。

本发明还涉及以下式的埃坡霉素C：

埃坡霉素C：R＝H。

本发明还涉及经验式为C₂₇H₄₁NO₅S的埃坡霉素(D)，其特征在于具有如表1所示的¹H-和¹³C-NMR光谱。

本发明还涉及以下式的埃坡霉素D：

埃坡霉素D：R＝CH₃。

埃坡霉素C和D可用于制备下式1的化合物，其衍生化过程可参考WO-A-97/19086中描述的衍生法。

在上式1中：

R＝H，C_1-4-烷基；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵＝H，C_1-6-烷基，C_1-6-酰基苄氧基，C_1-4-三烷基甲硅烷基，苄基，苯基，C_1-6-烷氧基，C₆-烷基-、羟基-和卤素-取代的苄基或苯基；

R¹-R⁵基团中的两个也可合并形成基团-(CH₂)_n-(其中n＝1-6)，基团中包含的烷基或酰基是直链或支链基团；

Y和Z可相同或不同，分别是氢，卤素，如F、Cl、Br或I，假卤素，如-NCO、-NCS、或-N₃，OH，O-(C_1-6)-酰基，O-(C_1-6)-烷基，O-苄氧基；Y和Z也可是环氧化物中的O原子，但不要求保护埃坡霉素A和B，或者形成C＝C双键中的一个C-C键。

因此，12，13-双键可选择性地进行

-氢化，例如经催化或用二亚胺，所得到的式1化合物中Y＝Z＝H；或者

-环氧化，例如用二甲基二环氧乙烷或过酸，得到的式1化合物中Y与Z＝-O-，或者

-转化为二卤化物、二假卤化物或二叠氮化物，得到的式1化合物中Y和Z＝卤素、假卤素或N₃。

埃坡霉素E和F

根据另一个实施方案，本发明涉及埃坡霉素A的生物转化体，该生物转化体是如下得到的：

(a)在吸附树脂存在下按本领域已知的方式培养Sorangiumcellulosum DSM 6773，取出吸附树脂，如果需要，用埃坡霉素A的甲醇溶液处理全部或部分经分离的培养物；

(b)用埃坡霉素A处理的培养物进行温育，然后用吸附树脂处理；

(c)从培养物中分离吸附树脂，用甲醇淋洗，浓缩洗脱液，得到粗提物；

(d)在乙酸乙酯和水之间分配上述粗提物，分离出乙酸乙酯相，并浓缩至油状；

(e)在以下条件对上述油状物进行反相色谱分离：

柱材料：Nucleosil 100 C-18 7μm

柱尺寸：250×16mm

洗脱剂：甲醇/水＝60∶40

流速：10ml/min

并分离出含有生物转化体的部分，该部分可在254nm处通过UV消光来检测，其R_t值为20min，然后分离所述生物转化体。

本发明还涉及该类型之埃坡霉素A的生物转化体，其是在步骤(a)中培养物培养3或4或更多天时分离该培养物而得到的。

本发明还涉及该类型之埃坡霉素A的生物转化体，其是在步骤(b)中进行温育1或2或更多天而得到的。

本发明还涉及经验式为C₂₆N₃₉NO₇S的化合物，其特征在于具有以下¹H-NMR光谱(300MHz，CDCl₃)：δ＝2.38(2-H_a)，2.51(2-H_b)，4.17(3-H)，3.19(6-H)，3.74(7-H)，1.30-1.70(8-H，9-H₂，10-H₂，11-H₂)，2.89(12-H)，3.00(13-H)，1.88(14-H_a)，2.07(14-H_b)，5.40(15-H)，6.57(17-H)，7.08(19-H)，4.85(21-H₂)，1.05(22-H₃)，1.32(23-H₃)，1.17(24-H₃)，0.97(25-H₃)，2.04(27-H₃)。

本发明还涉及下式的化合物(埃坡霉素E)：

埃坡霉素E：R＝H。

根据再一个实施方案，本发明涉及埃坡霉素B的生物转化体，该生物转化体是如下得到的：

(a)在吸附树脂存在下按本领域已知的方式培养Sorangiumcellulosum DSM 6773，与吸附树脂分离，如果需要，用埃坡霉素B的甲醇溶液处理全部或部分经分离的培养物；

(b)用埃坡霉素B处理的培养物进行温育，然后用吸附树脂处理；

(c)从培养物中分离吸附树脂，用甲醇淋洗，浓缩洗脱液，得到粗提物；

(d)在乙酸乙酯和水之间分配上述粗提物，分出乙酸乙酯相，并浓缩至油状；

(e)在以下条件对上述油状物进行反相色谱分离：

柱材料：Nucleosil 100 C-18 7μm

柱尺寸：250×16mm

洗脱剂：甲醇/水＝60∶40

流速：10ml/min

并分离出含有生物转化体的部分，该部分可在254nm处通过UV消光来检测，其R_t值为24.5min，然后分离所述生物转化体。

本发明还涉及该类型之埃坡霉素B的生物转化体，其是在步骤(a)中培养物培养3或4或更多天时分离该培养物而得到的。

本发明还涉及该类型之埃坡霉素B的生物转化体，其是在步骤(b)中进行温育1或2或更多天而得到的。

本发明还涉及经验式为C₂₇N₄₁NO₇S的化合物，其特征在于具有以下¹H-NMR光谱(300MHz，CDCl₃)：δ＝2.37(2-H_a)，2.52(2-H_b)，4.20(3-H)，3.27(6-H)，3.74(7-H)，1.30-1.70(8-H，9-H₂，10-H₂，11-H₂)，2.78(13-H)，1.91(14-H)，2.06(14-Hb)，5.42(15-H)，6.58(17-H)，7.10(19-H)，4.89(21-H₂)，1.05(22-H₃)，1.26(23-H₃)，1.14(24-H₃)，0.98(25-H₃)，1.35(26-H₃)，2.06(27-H₃)。

本发明还涉及下式的化合物(埃坡霉素F)：

埃坡霉素F：R＝CH₃。

制备和组合物

根据本发明的化合物或埃坡霉素可通过上述方法得到。

本发明还涉及用于在农业、林业和/或园艺中保护植物的组合物，该组合物由上述埃坡霉素C、D、E和F中的一种或多种组成或者由一种或多种上述埃坡霉素以及一种或多种常规载体和/或稀释剂组成。

本发明最后涉及治疗性组合物，该组合物由一种或多种上述化合物或者一种或多种上述化合物与一种或多种常规载体和/或稀释剂组成。具体而言，这些组合物具有细胞毒性活性和/或产生免疫抑制作用和/或用于控制恶性肿瘤，它们特别优选用作细胞抑制剂。

附图说明

图1显示发酵结束时XAD洗脱液的HPLC分析。

图2显示在温育48小时后分析，加入埃坡霉素A和B后，发酵液中富含埃坡霉素E和F。

图3显示埃坡霉素A通过Sorangium cellulosum So ce 90向埃坡霉素E生物转化的动力学。

图4显示埃坡霉素A向埃坡霉素E的生物转化。

图5显示埃坡霉素B向埃坡霉素F的生物转化。

具体实施方式

以下将通过一些具体实施例的描述来更为详细地阐明和描述本发明。

                      实施例

实施例1：埃坡霉素C和D

A、根据埃坡霉素基础专利DE-B-41 38 042制备菌株和培养条件

B、用DSM 6773进行制备

如基础专利所述进行75升培养物的培养，并用于制备发酵罐的接种，该发酵罐中有700升制备培养基，其由0.8％淀粉、0.2％葡萄糖、0.2％大豆粉、0.2％酵母浸膏、0.1％CaCl₂·2H₂O、0.1％MgSO₄·7H₂O、8mg/l的Fe-EDTA组成，其pH＝7.4，以及任选的15升Amberlite XAD-16吸附树脂。发酵在30℃下持续7-10天，通气量为0.1NL/m³。控制旋转速度，使pO₂保持在30％。

C、分离

使用0.7m²、100目工艺过滤器从培养物中分离吸附树脂，用3倍床体积的水/甲醇2∶1洗涤，由此除去极性的伴随物质。用4倍床体积的甲醇淋洗，得到粗提物，真空蒸发该粗提物，直至出现水相。用相同体积的乙酸乙酯提取该物质三次。蒸发有机相，得到240g的粗提物，在甲醇和己烷之间分配该粗提物，以分离除去亲脂性伴随物质。真空蒸发，从甲醇相中得到180g残液。该残液在SephadexLH-20(柱20×100cm，20ml/min的甲醇)上分步提取，得到三个部分。埃坡霉素包含在总共72g的部分中，其洗脱保留时间为240-300min。为分离埃坡霉素，在Lichrosorb RP-18(15μm，柱10×40cm，洗脱剂180ml/min甲醇/水65∶35)上将所述部分色谱分离为三个部分。在埃坡霉素A和B后，洗脱出R_t＝90-95min的埃坡霉素C和R_t＝100-110min的埃坡霉素D，真空蒸发后分别得到0.3g的无色油状物。

D、物理性质

埃坡霉素C：R＝H

埃坡霉素C：R＝CH₃

埃坡霉素C

C₂₆H₃₉NO₅S(477)

ESI-MS(正离子)：478.5[M+H]⁺

¹H和¹³C见NMR表

TLC：R_f＝0.82

TLC铝箔60 F 254 Merck，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝9∶1

检测：254nm处的UV消光。用香草醛-硫酸试剂喷雾，加热至120℃时为兰灰色。

HPLC：R_t＝11.5min

柱：Nucleosil 100 C-18 7μm，125×4mm

洗脱剂：甲醇/水＝65∶35

流速：1ml/min

检测：二极管阵列

埃坡霉素D

C₂₇H₄₁NO₅S(491)

ESI-MS(正离子)：492.5[M+H]⁺

¹H和¹³C见NMR表

TLC：R_f＝0.82

TLC铝箔60 F 254 Merck，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝9∶1

检测：254nm处的UV消光。用香草醛-硫酸试剂喷雾，加热至120℃时为兰灰色。

HPLC：R_t＝15.3min

柱：Nucleosil 100 C-18 7μm，125×4mm

洗脱剂：甲醇/水＝65∶35

流速：1ml/min

检测：二极管阵列

表1：埃坡霉素C和埃坡霉素D在[D₆]DMSO中于300MHz时的¹H-和¹³C-NMR数据

                  埃坡霉素C              埃坡霉素D  H原子    δ(ppm)  C原子    δ(ppm)    δ(ppm)  C原子    δ(ppm)    1    170.3    1    170.1  2-Ha    2.38    2    38.4    2.35    2    39.0  2-Hb    2.50    3    71.2    2.38    3    70.8  3-H    3.97    4    53.1    4.10    4    53.2  3-OH    5.12    5    217.1    5.08    5    217.4  6-H    3.07    6    45.4    3.11    6    44.4  7-H    3.49    7    75.9    3.48    7    75.5  7-OH    4.46    8    35.4    4.46    8    36.3  8-H    1.34    9    27.6    1.29    9    29.9  9-Ha    1.15    10    30.0    1.14    10    25.9  9-Hb    1.40    11    27.6    1.38    11    31.8^*  10-Ha    1.15^*    12    124.6    1.14^*    12    138.3  10-Hb    1.35^*    13    133.1    1.35^*    13    120.3  11-Ha    1.90    14    31.1    1.75    14    31.6^*  11-Hb    2.18    15    76.3    2.10    15    76.6  12-H    5.38^**    16    137.3    16    137.2  13-H    5.44^**    17    119.1    5.08    17    119.2  14-Ha    2.35    18    152.1    2.30    18    152.1  14-Hb    2.70    19    117.7    2.65    19    117.7  15-H    5.27    20    164.2    5.29    20    164.3  17-H    6.50    21    18.8    6.51    21    18.9  19-H    7.35    22    20.8    7.35    22    19.7  21-H₃    2.65    23    22.6    2.65    23    22.5  22-H₃    0.94    24    16.7    0.90    24    16.4  23-H₃    1.21    25    18.4    1.19    25    18.4  24-H₃    1.06    27    14.2    1.07    26    22.9  25-H₃    0.90    0.91    27    14.1  26-H₃    1.63  27-H₃    2.10    2.11

^*、^**可以互换

实施例2：

埃坡霉素A和由埃坡霉素C得到的12，13-二环氧-埃坡霉素A

将50mg埃坡霉素A溶解在1.5ml丙酮中，用1.5ml之0.07mol二甲基二环氧乙烷丙酮溶液处理。在室温下静置6小时后，真空蒸发混合物，用制备性HPLC在硅胶上(洗脱剂：叔丁基甲醚/石油醚/甲醇33∶66∶1)分离残留物。

产量：

25mg的埃坡霉素A，R_t＝3.5min(分析HPLC，7μm，柱4×250mm，洗脱剂如上，流速1.5ml/min)，和

20mg的12，13-二环氧-埃坡霉素A，R_t＝3.7min，ESI-MS(正离子)：m/e＝494[M+H]⁺，¹H-NMR([D₄]甲醇)选择信号：δ＝4.32(3-H)，3.79(7-H)，3.06(12-H)，3.16(13-H)，5.54(15-H)，6.69(17-H)，1.20(22-H)，1.45(23-H)

12，13-二环氧-埃坡霉素A：R＝H

实施例3：埃坡霉素E和F，埃坡霉素A和B的新型生物转化产物制备菌株

GBF在1985年7月从Zambesi河岸的土壤样品中分离出Sorangium celluslosum So ce90菌株，并于1991年10月28日保藏在德国微生物保藏中心(German Collection for Microorganisms)中，保藏号为DSM 6773。

产物特征和培养条件描述在：H_lfe，G.；N.Bedorf，K.Gerth & HReichenbach：埃坡霉素s，制备方法和包含该物质的组合物(埃坡霉素s，processes for their preparation and compostions containing them)。DE41 38 042 A1，于1993年5月27日公布。

在发酵期间埃坡霉素E和F的形成

如下进行典型的发酵反应：100升生物反应器中装入60升培养基(0.8％淀粉、0.2％葡萄糖、0.2％大豆粉、0.2％酵母浸膏、0.1％CaCl₂·2H₂O、0.1％MgSO₄·7H₂O、8mg/l的Fe-EDTA，pH7.4)。另外加入2％的吸附树脂(XAD-16，Rohm & Haas)。对培养基进行高压灭菌(2小时，120℃)。用在相同培养基(另外加入50mM HEPES缓冲液，pH7.4)中于摇瓶(160rpm，30℃)中培养的预培养物10升进行接种。在32℃下进行发酵，搅拌器速度为500rpm，每小时每立方米引入0.2Nl的空气，通过添加氢氧化钾使pH保持在7.4。发酵持续7-10天。在发酵期间，所形成的埃坡霉素连续地结合在吸附树脂上。在除去培养液(例如用工艺过滤器进行过筛)后，用3倍床体积的水洗涤树脂，然后用4倍床体积的甲醇淋洗。洗脱液浓缩至干，并放入700ml甲醇中。

XAD洗脱液的HPLC分析

相对于反应器的起始体积(70升)，将洗脱液浓缩为100∶1。用Hewlett Packard的1090 HPLC装置进行分析。为分离组分，使用Machery-Nagel(Düren)的微孔柱(125/2 Nucleosil 120-5 C₁₈)。使用水/乙腈由开始75∶25至5.5分钟后50∶50的梯度进行洗脱。该比例保持至第7分钟，然后在第10分钟时增加至100％乙腈。

在250nm的波长、4nm的带宽下进行测量。在200-400nm的波长范围中测量二极管阵列光谱。在XAD洗脱液中，发现两种新型物质，R_t分别为5.29和5.91，它们的吸收光谱与埃坡霉素A和B的相同(图1，E相应于A，F相应于B)。这些物质在给定的条件下仅形成非常少的量。

埃坡霉素A和B向埃坡霉素E和F的生物转化

500ml的So ce90培养物，已培养4天，与吸附树脂在一起，用该培养物进行具体的生物转化。250ml该培养物转移至无菌的1升Erlenmeyer烧瓶中，而留下XAD。然后加入总共36mg埃坡霉素A+14mg埃坡霉素B的混合物的甲醇溶液，该烧瓶在振荡架上于30℃、200rpm下温育2天。埃坡霉素E和F的形成直接由10μl培养物的离心上清液来分析(图2)。仅在有细胞时才发生转化，而且取决于所用细胞的密度和时间。埃坡霉素A的转化作用动力学见图3。

埃坡霉素E和F的分离

为分离埃坡霉素E和F，合并三个生物转化用摇瓶中的物料(见上)，然后与20ml XAD-16振摇1小时。过滤得到XAD，用200ml甲醇淋洗。真空蒸发洗脱液，得到1.7g的粗提物。该粗提物在30ml乙酸乙酯和100ml水之间分配。真空蒸发，从乙酸乙酯相中得到330mg的油状残留物，该残留物在250×20mm的RP-18柱(洗脱剂甲醇/水58∶42，254nm检测)进行5轮色谱分离。

产量：埃坡霉素E：50mg

              F：10mg

埃坡霉素E的生物作用

在细胞培养物中，测定生长降低50％时的浓度(IC₅₀)，并与埃坡霉素A进行比较。

细胞株          IC₅₀(ng/ml)    埃坡霉素E    埃坡霉素AHeLa.KB-3.1(人)    5    1鼠成纤维细胞，L929    20    4

埃坡霉素E

C₂₆H₃₉NO₇S(509)

ESI-MS(正离子)：510.3[M+H]⁺

TLC：R_f＝0.58

TLC铝箔60 F 254 Merck，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝9∶1

检测：254nm处的UV消光。用香草醛-硫酸试剂喷雾，加热至120℃时为兰灰色。

HPLC：R_t＝5.0min

柱：Nucleosil 100 C-18 7μm，250×4mm

洗脱剂：甲醇/水＝60∶40

流速：1.2ml/min

检测：二极管阵列

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ＝2.38(2-H_a)，2.51(2-H_b)，4.17(3-H)，3.19(6-H)，3.74(7-H)，1.30-1.70(8-H，9-H₂，10-H₂，11-H₂)，2.89(12-H)，3.00(13-H)，1.88(14-H_a)，2.07(14-H_b)，5.40(15-H)，6.57(17-H)，7.08(19-H)，4.85(21-H₂)，1.05(22-H₃)，1.32(23-H₃)，1.17(24-H₃)，0.97(25-H₃)，2.04(27-H₃)

埃坡霉素F

C₂₇H₄₁NO₇S(523)

ESI-MS(正离子)：524.5[M+H]⁺

TLC：R_f＝0.58

TLC铝箔60 F 254 Merck，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝9∶1

检测：254nm处的UV消光。用香草醛-硫酸试剂喷雾，加热至120℃时为兰灰色。

HPLC：R_t＝5.4min

柱：Nucleosil 100 C-18 7μm，250×4mm

洗脱剂：甲醇/水＝60∶40

流速：1.2ml/min

检测：二极管阵列

¹H-NMR光谱(300MHz，CDCl₃)：δ＝2.37(2-H_a)，2.52(2-H_b)，4.20(3-H)，3.27(6-H)，3.74(7-H)，1.30-1.70(8-H，9-H₂，10-H₂，11-H₂)，2.78(13-H)，1.91(14-H)，2.06(14-H_b)，5.42(15-H)，6.58(17-H)，7.10(19-H)，4.89(21-H₂)，1.05(22-H₃)，1.26(23-H₃)，1.14(24-H₃)，0.98(25-H₃)，1.35(26-H₃)，2.06(27-H₃)。

实施例4

通过用Sorangium cellulosum So ce90生物转化制备埃坡霉素E和F

1)进行生物转化

为进行生物转化，使用Sorangium cellulosum So ce90的培养物，该培养物已在2％XAD 16吸附树脂(Rohm & Haas，Frankfurt/M.)存在下于30℃、160rpm下振摇了4天。培养基具有以下组成(g/升蒸馏水)：马铃薯淀粉(Maizena)，8；葡萄糖(Maizena)，8；脱脂大豆粉，2；酵母浸膏(Marcor)，2；乙二胺四乙酸，铁(III)钠盐，0.008；MgSO₄·7H₂O，1；CaCl₂·2H₂O，1；HEPES，11.5。在高压灭菌之前，用氢氧化钾将pH调节为7.4。用不锈钢筛网(筛孔宽200μm)过筛，由此从培养物中分离XAD。在10000rpm下离心10分钟，使细菌沉积，将沉淀物重新悬浮在1/5的培养物上清液中。然后以0.5g/升的浓度将甲醇溶液中的埃坡霉素A或埃坡霉素B添加至浓缩细菌悬浮液中。如上所述进一步培养培养物。为分析生物转化作用，在所希望的时间取1ml样品，加入0.1ml的XAD，然后在30℃下振摇样品30分钟。用甲醇淋洗XAD。浓缩洗脱液至干，然后再溶于0.2ml甲醇中。通过HPLC分析该样品。

图4是埃坡霉素A向埃坡霉素E转化的动力学。

图5是埃坡霉素B向埃坡霉素F转化的动力学。

2)通过生物转化1g埃坡霉素A来制备埃坡霉素E

在10升生物反应器中，Sorangium cellulosum So Ce90菌株于30℃在8.5升上述培养基(但没有XAD)中培养4天，旋转速度为150rpm，并引入0.1vvm的空气。

通过交叉流过滤将该培养物浓缩至3升。为此，使用0.6m²的膜，其孔径为0.3μm。

将经浓缩的培养物转移至一个4升的生物反应器中，然后加入1g埃坡霉素A在10ml甲醇中的溶液。进一步培养该培养物21.5小时。温度为32℃，搅拌器速度为455rpm，空气引入速率为6l/min。在收集时，加入100ml的XAD，再将该混合物温育1小时。过筛从细胞中分离XAD，并用甲醇完全洗脱。用HPLC分析经浓缩的洗脱液。

生物转化的平衡：

所用的埃坡霉素A：          1000mg ＝100％

21.5小时后回收的埃坡霉素A：53.7mg ＝5.4％

21.5小时后形成的埃坡霉素E：661.4mg＝66.1％

完全分解的埃坡霉素A：             ＝28.5％

实施例5

测试本发明之埃坡霉素对细胞培养物(表2)和促进聚合反应(表3)的作用。

表2：用细胞培养物进行的埃坡霉素实验

埃坡霉素    A493    B507    C477    D491    E509    F523                                          IC-50(ng/ml)鼠成纤维细胞L929    4    1    100    20    20    1.5人肿瘤细胞HL-60(白血病)    0.2    0.2    10    3    1    0.3K-562(白血病)    0.3    0.3    20    10    2    0.5U-937(淋巴瘤)    0.2    0.2    10    3    1    0.2KB-3.1(子宫颈癌)    1    0.6    20    12    5    0.5KB-V1(子宫颈癌)    0.3    0.3    15    3    5    0.6A-498(肾癌)    -    1.5    150    20    20    3A-549(肺癌)    0.7    0.1    30    10    3    0.1

表3：用埃坡霉素进行的聚合反应实验

参数：至与对照相比为半最大聚合反应时的时间

测量    w    x    y    z 试剂[s] 试剂[％]对照    20    170    180    210    190    100埃坡霉素A    95    60    70    70    74    39埃坡霉素B    23    25    30    26    14埃坡霉素C    125    76    95    80    94    49埃坡霉素D    125    73    120    106    56埃坡霉素E    80    60    50    45    59    31埃坡霉素F    80    40    30    50    50    26

标准实验用0.9mg的微管蛋白/ml和1μm样品浓度

聚合反应实验是体外实验，其使用从猪脑中纯制的微管蛋白。用分光光度计进行评估。促进聚合反应的物质如埃坡霉素降低达到半最大聚合反应所需要的时间，即、时间越短，化合物的活性越高。w、x、y和z是四个独立的实验，相对活性以最后一栏中对照的百分数来表示；该值最低表明活性最佳。排名表与细胞培养物中发现的值非常一致。