芥子碱在制备防治老年性痴呆疾病药物中的应用

摘要

源于十字花科植物种子的芥子碱在制备乙酰胆碱酯酶活性药物和/或抑制外钙内流药物中的应用，可治疗老年性痴呆病，尤其适用于治疗伴有高血压的老年性痴呆病人，有很强的体外抑制AchE的作用，且对脑组织AchE的抑制作用强，而对血浆AchE活性抑制弱，IC

说明书

技术领域

本发明属于一种芥子碱在药学上的新应用，具体为在制备治疗老年性痴呆疾病药物方面的用途。

背景技术

老年性痴呆疾病(Alzheimer’s disease，简称AD，又称早老性痴呆，下同)是一种老年性神经退行性疾病，其临床主要表现为进行性记忆减退、语言和行为障碍，是老年期痴呆的主要发病原因。AD生化表现为脑内神经递质如乙酰胆碱(ACh)、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、谷氨酸(Glu)及P物质等水平明显下降，其中以ACh水平的降低最为明显。乙酰胆碱是人脑内的一种重要的神经递质，与学习、记忆功能有关。现代药理学研究证明，早老性痴呆病是一种中枢胆碱能神经系统退行性疾病，患者大脑皮层和海马区的乙酰胆碱含量明显减少。乙酰胆碱酯酶是将乙酰胆碱催化分解为胆碱的酶，主要分布于神经组织，如脑白质和灰质、脊髓、神经节内的神经细胞和神经肌肉接头，还分布于红细胞和血清等非神经组织中。乙酰胆碱酯酶抑制剂是一类能与乙酰胆碱酯酶(AChE)结合，并抑制AChE活性的药物(也称抗胆碱酯酶药)，乙酰胆碱酯酶是体内迅速水解乙酰胆碱从而使Ach失活的酶。AChE抑制剂抑制AChE活性可以抑制乙酰胆碱的分解，使胆碱能神经末梢释放的Ach在突触间隙中贮存堆积的时间更长，从而延长了ACh对大脑中胆碱受体的兴奋作用，表现M样及N样作用增强，提高AD病人的胆碱能神经功能，故该类药又称拟胆碱药。可分为：①易逆性或短暂性胆碱酯酶抑制剂，如新斯的明、毒扁豆碱等；这类药物在临床上有治疗作用。②难逆性(或不可逆性)胆碱酯酶抑制剂，如有机磷酸酯类，包括农业杀虫剂和战争毒气。

乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂是最主要的，也是迄今为止唯一一类通过美国FDA批准用于治疗AD的药物。目前有4种AChE抑制剂获得美国FDA批准用于治疗AD，即华纳-兰伯特公司研制的他克林(Tacrine，商品名Cognex)、日本卫材公司和美国辉瑞公司研制的多奈哌齐(Donepezil，商品名Aricept)及诺华公司研制的利伐司替明(Rivastigmine，商品名艾斯能Exelon)，Shire公司的加兰他敏(Reminyl R，galanth amine)分别于1993年、1997年、2000年和2002年获准在美国上市。此外，尚有多种AChE抑制剂正处于研究阶段或已进入临床试验。但是，现有的胆碱酯酶抑制剂存在半衰期短，更主要的是有较严重的外周胆碱能系统副作用以及肝毒性等缺点，使它们的临床应用前景受到限制。因此，寻找作用时间长、副作用小的新一代胆碱酯酶抑制剂仍是国际各大药厂关注的热点。

发明内容

由于老年性痴呆治疗需长期用药，所以本发明要解决的技术问题是寻找来源于植物的、可逆性、高效、高选择性、作用时间长和副作用小的天然AChE抑制剂。

为解决上述问题，本发明提供下述技术方案。

芥子碱在制备抑制乙酰胆碱酯酶活性药物和/或抑制外钙内流药物中的应用，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂是防治老年性痴呆药物。本发明还包括芥子碱在制备治疗伴有高血压的老年性痴呆患者药物中的应用。一种防治老年性痴呆组合物，其特征在于含有芥子碱。

所以本发明用芥子碱是源于植物的天然AChE抑制剂，用来制备防治乙酰胆碱酯酶活性药物和/或抑制外钙内流药物时，如防治老年性痴呆药物尤其是防治伴有高血压的老年性痴呆患者药物时，具有可逆性、高效、高选择性、副作用小的优点，能够满足老年性痴呆治疗需长期用药需求。

本发明芥子碱在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂药物和/或抑制外钙内流药物时，如防治老年性痴呆药物或者防治伴有高血压的老年性痴呆药物时，可以另外加入各种矿物质，尤其优选能够补充生物体内容易不足的必需元素、微量必需元素效果的矿物质。此外，还可以另外加入其它天然药物、氨基酸和/或维生素。所包括的天然药物没有特殊的限制，首选对稳定精神有效的灵芝、地黄、大枣、五味子、酸枣仁、人参、刺五加、银杏、石杉、山药、薏苡仁、何首乌、当归、白药、黄精、山茱萸、枸杞子、沙棘、胡桃仁、桑椹、海马、淫羊藿、黄连、石菖蒲、天南星、郁金、川芎、丹参、葛根、山楂、天麻、鹿茸、茯苓、三七、冬虫夏草、白果、马钱子、麝香、肉苁蓉、黄芪、党参、益智仁、赤芍等。此外，也可选用有镇静与放松效果的薰衣草、柏子仁、远志、合欢皮、夜交藤、香附、柴胡、枳壳、百合、知母、胆南星等。这些植物药的形态可以是提取的浸膏、精油、药茶等，并无特殊的限制。氨基酸也没有特殊的限制，例如可以是谷氨酸胺、色氨酸、赖氨酸、亮氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等。维生素也没有特殊的限制，例如可以是维生素B6、维生素B1、维生素B2、叶酸、维生素C、维生素E等。本发明芥子碱在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂药物和/或抑制外钙内流药物时，可以另外加入其它成分，例如加入芦荟、蜂王浆、螺旋藻、银杏叶、双歧杆菌等。

具体实施方式

一.芥子碱的分离纯化：

(1.李书等，白芥子化学成分的研究，陕西新医药，12(9)，1983：57-58，2；王维兰等，莱菔子降压活性成分的研究，中草药，18(3)，1987：5-7。)

本发明实验表明三种植物的提取方法基本相同。

提取方法：取十字花科药用植物白芥子、莱菔子、葶苈子等各20kg粗碎后，分别加10倍量95％乙醇浸泡72hr，装入渗漉筒，收集10倍量渗漉液，减压浓缩至每毫升相当于生药5g，置冰箱中2-3天，析出粗结晶，滤取沉淀，用95％乙醇和水交替重结晶三次得淡黄色细针晶，为纯品芥子碱硫氰酸盐(含量大于98％，HPLC)。

结构式：

分子式：C₁₆H₂₄NO_5.SCN；分子量：368；熔点：177-178℃。

二.以乙酰胆碱酯酶为靶点，体外观察了芥子碱对乙酰胆碱酯酶活力的影响。

(一)芥子碱对脑、血清中乙酰胆碱酯酶(AchE)活力的影响

胆碱酯酶抑制剂通过抑制胆碱酯酶的活性，增加脑内乙酰胆碱的含量，恢复胆碱能神经传导，对轻、中度的老年痴呆患者取得了良好的治疗效果。本实验以乙酰胆碱酯酶为靶点，体外观察了芥子碱对乙酰胆碱酯酶活力的影响。

1  实验材料

1.1  动物：SD雄性大鼠，体重210±20g。由中国药科大学动物中心提供。

1.2药品和试剂乙酰胆碱酯酶测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20040507双缩脲总蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20040425受试化合物：芥子碱溶于稀盐酸，用PBS稀释成所需浓度。

其他试剂均为市售AR级。

1.3仪器设备

UV-722紫外分光光度计：上海第三分析仪器厂

电热恒温水浴锅：江苏省东台市电器厂，型号HH-S

离心沉淀机：上海手术器械厂，型号为80-1

电子天平：上海精科天平，型号为JA1003

2方法

2.1 AchE的制备

雄性大鼠，体重210±20g，3只。眼球取血3ml后断头，冰台快速取大脑，放入玻璃皿中(玻璃皿加入少量冰冷PBS)漂洗，用干净的滤纸吸去大脑组织表面的水分和血液。精密称重，大鼠脑重为2.351g，放入小烧杯中。加入少量冰冷的PBS(g/L：NaCl 8，KCl 0.2，Na₂HPO₄·12H₂O 3.5，KH₂PO₄ 0.2，pH7.4)于烧杯中，用眼科剪尽快剪碎组织块。将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中，再用少许冰冷PBS冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行冰浴匀浆。然后再加入冷冻的PBS，按脑组织重量与匀浆总体积1∶10的比例，稀释混匀。将制备好的10％脑匀浆以3000r/min离心15分钟，取上清待测。取出的血以1000r/min离心8分钟，取上层血清。测时将血清用PBS按1∶9稀释。

2.2总蛋白含量的测定

用双缩脲法测得大鼠脑组织匀浆总蛋白含量为3.97mg prot/ml。

2.3大鼠血清、脑匀浆AchE酶活力测定

用改良Ellman比色法测定AchE的活力，按乙酰胆碱脂酶测定试剂盒的方法测定。测定原理：乙酰胆碱脂酶水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸，胆碱可与巯基显色剂反应生成对三硝基苯黄色化合物，根据颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量可反映胆碱酯酶的活力。设标准管组、不加药测定管组、受试化合物测定管组，每组均设空白对照管和测定管，大鼠脑组织匀浆液和血清取样量为每管30μl。反应体系混匀，37℃准确反应6分钟，然后终止反应，混匀放置15分钟，在412nm波长测定各管吸光度(用PBS调零)。受试药分别配制成0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/ml水溶液，n＝3。按下列公式测得芥子碱对AchE的抑制率。

脑匀浆中AchE活力(U/mgprot)＝(测定管OD值-对照管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度(1μmol/ml)/蛋白含量(mgprot/ml)

每毫克组织蛋白样本在37℃保温6min，水解反应体系中1μmol基质为1个活力单位(U)。

血清中AchE活力(U/ml)＝(测定管OD值-对照管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度(1μmol/ml)×样品测试前稀释倍数

每毫升血清样本在37℃保温6min，水解反应体系中1μmol基质为1个活力单位(U)。

药物对AchE的抑制率(％)＝(不加药组酶活力-药物组酶活力)/不加药组酶活力×100％

表1、芥子碱对大鼠大脑匀浆Ach E的体外抑制作用(x±s，n＝3)。

药物         药物浓度     酶活力             抑制率     IC₅₀

(mg/ml)      (μM)        (U/mgprot)         (％)       (μM)

不加药       0            0.971±0.283       /

0.0005       1.359        0.705±0.119       27.41

0.001        2.717        0.579±0.178^*     40.33

0.005        13.59        0.205±0.046^**    78.92      3.661

0.01         27.17        0.159±0.031^**    83.65

0.05         135.9        0.074±0.018^**    92.37

0.1          271.7        0.031±0.010^**    96.81

0.5          1359         0.003±0.001^**    99.69

1            2717         0.000±0.001^**    100

与不加药组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。数据线性回归，y(抑制率)＝a+bx(lgC)：y＝35.93+24.96x r＝0.9301

据文献报道，加兰他敏在浓度(mg/ml)为0.005、0.01、0.05、0.1、0.5和1时，对大鼠脑匀浆AchE的体外抑制率分别为：39.10％、45.68％、65.61％、77.32％、91.69％和93.46％。本发明研究表明芥子碱在同浓度下对大鼠脑匀浆AchE的体外抑制作用强于加兰他敏。

表2、芥子碱对大鼠血清AchE的体外抑制作用(x±s，n＝3)。

药物         药物浓度     酶活力            抑制率       IC₅₀

(mg/ml)      (μM)        (U/ml)            (％)         (μM)

不加药       0            8.692±2.433      /

0.0005       1.359        7.118±1.708      18.11

0.001        2.717        6.129±1.783      29.48

0.005        13.59        5.098±0.969^*    41.35        22.12

0.01         27.17        3.127±0.844^**   64.02

0.05         135.9        1.918±0.431^**   77.93

0.1          271.7        1.219±0.365^**   85.98

0.5          1359         0.284±0.049^**   96.73

1            2717         0.012±0.004^**   99.86

与不加药组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。数据线性回归，y(抑制率)＝a+bx(lgC)：y＝8.522+30.84x r＝0.9741

上述实验数据表明：芥子碱有很强的体外抑制AchE的作用，且对脑组织AchE的抑制作用强，而对血浆AchE活性抑制弱，IC₅₀血清/IC₅₀脑＝6.042(倍)。这表明芥子碱可能作为中枢乙酰胆碱酯酶抑制剂应用治疗老年性痴呆病，不但选择性地抑制中枢乙酰胆碱酯酶，且对外周胆碱能系统副作用以及肝毒性将有可能显著减弱。

(二)芥子碱对细胞内钙的影响：

大量数据表明氧化应激导致神经细胞退化死亡在AD发病过程中起着重要作用，而各种原因引起的细胞内钙升高造成钙超载是神经细胞退化死亡的最终通路。一般而言，抑制外钙内流不但具有外周降压作用，而且保护神经细胞，对防治AD有协同作用。有关芥子碱对细胞外钙内流的影响未见报道。本实验以PC12细胞和VSMC为材料，采用荧光指示剂Fluo-3/AM负载细胞，测定芥子碱对高钾除极，谷氨酸(Glu)以及去甲肾上腺素(NE)引起的PC12细胞和VSMC外钙内流和细胞内游离钙浓度([Ca²⁺]_i)的影响，进一步从细胞水平探索芥子碱的作用机制。

1、实验材料

1.1细胞株

PC12细胞和主动脉平滑肌细胞均购自上海细胞所。

1.2药品与试剂

DMEM培养基：sigma产品。用超纯水配成DMEM培养液，每升溶液中含有NaHCO₃3.7g、Hepes3.6g，青霉素、链霉素各100mg，PH7.4。0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，分装，4℃冰箱保存备用。

Fluo-3/AM：Sigma公司进口，DMSO溶解，制成1mM母液，-20℃分装保存。

小牛血清：为杭州四季青工程材料研究所产品。56℃30分钟灭活，分装后-20℃保存。

L-谷氨酸钠(L-Glu)：中国医药集团上海化学试剂公司产品。

重酒石酸去甲肾上腺素(NE)：中国天丰药厂出品。

胰蛋白酶：华美生物工程公司产品。

PBS(g/L)：NaCl 8，KCl 0.2，NaHCO₃12H₂O 3.49，KH₂PO₄ 0.2。用超纯水充分溶解，定容至1000ml。高压灭菌，4℃保存备用。

D-Hanks溶液(g/L)：NaCl 8，KCl 0.4，Na₂HPO₄ 12H₂O 0.134，KH₂PO₄ 0.06，NaHCO₃ 0.35，酚红0.02。用超纯水充分溶解，定容至1000ml。高压灭菌，4℃保存备用。

Krebs液(g/L)：NaCl 8，KCl 0.4，MgSO_4.7H₂O 3，NaH₂PO_4.2H₂O 1.872，NaHCO₃ 2.1，Glucose2，CaCl₂ 0.2。

受试化合物芥子碱：分子量368，用37％HCL溶解，加PBS稀释至所需浓度。

胰蛋白酶：用D-Hanks溶液配成0.25％酶溶液

1.3主要仪器：XIDP超净台，苏州吴中实验动物器材厂产品；Victor II 1420多功能标记免疫分析仪，PerkinElmer Life science Co。

2、方法

2.1细胞培养

细胞接种于培养瓶中，用含15％小牛血清的DMEM培养液于37℃，5％CO₂培养箱中培养。细胞贴壁后，观察生长状况，待细胞铺满瓶底，倾去培养液，用0.25％胰蛋白酶消化2-3min，消化完全后加入含小牛血清的DMEM培养基终止消化，吸管吹打至单细胞悬液。将细胞接种到96孔培养板中培养。待细胞长满单层后，即可进行实验。

2.2细胞内钙测定

原理：Fluo-3/AM是1989年合成的第3代荧光探针，其酯化形式可透过细胞膜负载进细胞。进入胞内的Fluo-3/AM在酶的作用下水解成Fluo-3，与胞内的游离Ca²⁺结合形成复合物，在波长为500nm左右激发出荧光。胞内游离钙离子浓度越高所测得的荧光强度越强。因此由荧光强度值可反映出胞内钙离子浓度的变化。

方法：细胞接种于96孔培养板，分为KCl(终浓度75mM)模型组、L-Glu(终浓度10mM)模型组、NE(终浓度1μM)模型组、受试药物组(终浓度分别为10，1，0.1μM)。长满单层后，吸去培养液，用D-Hanks洗3次，每孔加入含有Fluo-3/AM(终浓度5μM)的Krebs液(Ca²⁺2mM)45μl，于37℃避光负载孵育45分钟，吸出负载液用Krebs轻轻荡洗3次，然后加入Krebs液45μl/孔。模型组分别加入终浓度为75mM的KCl、10mM的L-Glu、1μM的NE。受试药组先加受试药物作用15分钟，然后再加入各模型刺激剂。细胞内荧光强度(Fluorescent intensity，FI)用Victor II 1420多功能标记免疫分析仪于激发波长和发射波长分别为488nm和535nm处检测。[Ca²⁺]_i的变化用ΔFI来表示。

药物对细胞内钙升高的抑制率＝(ΔFI_模型组-ΔFI_药物组)/ΔFI_模型组×100％

ΔFI表示与静息钙荧光值相比各组荧光值的增加值

ΔFI_模型组＝FI_模型组-FI_静息       ΔFI_药物组＝FI_药物组-FI_静息

 统计方法：采用两样本均数比较的组间t检验，结果以x±S来表示。

 表3、芥子碱对KCl 75mmol/L所引起的PC12细胞内钙升高的影响(x±S，n＝10)

   药物             静息FI        KCI FI_峰值      ΔFI        抑制率(％)

 (μmol/L)

 模型组(不加药)    1188±163      4270±982^b      3082±854      /

     0.1           1167±148      3032±711^bc     1865±491     39.5

     1.0           1149±236      2586±804^bd     1437±445     53.7

     10            1141±217      2009±614^ad     868±283      71.8

 与相应的静息FI值相比，^aP＜0.01，^bP＜0.001；与高钾模型组FI相比，^cP＜0.05，^dP＜0.01。

 表4、芥子碱对Glu 10mmol/L诱导的PC12细胞内钙升高的影响(x±S，n＝10)

 药物          静息FI         Glu FI_峰值      ΔFI          抑制率(％)

 (μmol/L)

 模型组(不加   1256±175      3096±402^b      1840±313     /

 药)

 0.1           1222±237      2038±417^bd     816±220      55.7

 1.0           1184±239      1764±545^ad     580±191      68.5

 10            1210±318      1592±473^ad     382±116      79.2

 与相应的静息FI值相比，^aP＜0.01，^bP＜0.001；与Glu模型组FI相比，^cP＜0.05，^dP＜0.01。

 表5、芥子碱对KCl 75mmol/L所引起的主动脉平滑肌细胞内钙升高的影响(x±S，n＝10)

 药物          静息FI         KCl FI_峰值      ΔFI          抑制率(％)

 (μmol/L)

 模型组(不加   1201±143      4991±848^b      3790±603     /

 药)

 0.1           1259±291      3476±869^bc     2217±447     41.5

 1.0           1197±227      2702±574^bd     1505±406     60.3

 10            1225±381      2165±642^ad     940±298      75.2

与相应的静息FI值相比，^aP＜0.01，^bP＜0.001；与高钾模型组FI相比，^cP＜0.05，^dP＜0.01。

 表6、芥子碱对NE 1μmol/L诱导的主动脉平滑肌细胞内钙升高的影响(x±S，n＝10)

 药物           静息FI       NE FI_峰值       ΔFI           抑制率(％)

 (μmol/L)

 模型组(不加药) 1248±262    5298±1197^b     4050±1093     /

 0.1            1216±294    2941±823^bd     1725±362      57.4

 1.0            1177±348    2420±759^bd     1243±395      69.3

 10             1193±391    1958±642^ad     765±214       81.1

与相应的静息FI值相比，aP＜0.01，bP＜0.001；与NE模型组FI相比，cP＜0.05，dP＜0.01。

本发明实验表明：芥子碱可以阻断电压依赖型钙通道和受体依赖型钙通道开放引起的外钙内流，明显抑制Ca²⁺进入血管平滑肌细胞和PC12细胞，使细胞内游离Ca²⁺减少。Ca是细胞内第二信使，体内许多血管调节剂、激素、细胞因子等生物活性物质，通过各种途径最终改变细胞内Ca浓度而发挥调节生长、增殖的作用。细胞内钙浓度增高可促使血管平滑肌增殖与肥厚，使血管壁增厚，外周阻力增加，促使血压升高。因此，芥子碱抑制外钙内流是阻止血管平滑肌细胞增殖与肥大的重要环节，提示其可能有外周降压作用。由于细胞内钙升高造成钙超载是神经细胞退化死亡的最终通路，芥子碱对KCl和Glu引起的PC12细胞内钙升高的抑制作用提示其可能对中枢神经细胞有保护作用。而且从实验结果来看，芥子碱对Glu引起的PC12细胞内钙升高的抑制作用强于对KCl引起内钙升高的抑制，表明其阻断受体依赖型钙通道的作用强于对电压依赖型钙通道的阻断。所以，芥子碱尤其适用于伴有高血压的老年性痴呆病人。