人钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白α，其编码序列及用途

摘要

本发明涉及了一种新型钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白α(Calcium/Calmodulin－Dependent Protein Kinase II Inhibitorα，CaM－KIINα)。本发明提供编码此蛋白分子的多核苷酸和经重组技术产生这种蛋白分子的方法。本发明还公开了这种新型钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白α及其编码序列的用途。本发明还证实了CaM－KIINα能够结合和抑制钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II的活性。本发明还公开了抗此蛋白分子用于疾病的诊断及治疗的策略，特别是可用于癌症治疗。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码人钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白α(Calcium/Calmodulin-DependentProtein Kinase II Inhibitorα，简称为“CaM-KIINα”)多肽的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。本发明还涉及CaM-KIINα对细胞生长的抑制活性。本发明的CaM-KIINα是一种新的与细胞增殖、生长以及细胞周期信号有关的细胞内可溶性蛋白。

背景技术

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞内信号传导系统的一个重要组成部分，是Ca2⁺/CaM调节蛋白家族中的一个主要成员。CaMK II是CaM的重要靶酶之一，许多酶或蛋白质都可以作为它的底物。CaMKII由α，β，γ，δ四种亚单位组成，编码十多种同功酶。几乎所有的亚单位都包含有催化区、调节区和结合区，调节区又是由自身抑制区(281-309)、钙调蛋白结合区(296-311)和自身磷酸化位点(苏氨酸286，305，306；丝氨酸314)组成。

CaMKII的分子量大约为此00-700Kd，亚单位的分子量为50-62kd。CaMKII活化需要Ca²⁺/CaM的启动，Ca²⁺/CaM结合到钙调素结合区，解除了自身抑制区对活化点的抑制使酶活化，该酶自身磷酸化后，其活性即失去Ca²⁺/CaM的依赖性。

CaMKII主要存在于神经组织，在某些区域可占总蛋白量的2％(如鼠的海马回)。除此以外，在哺乳动物的骨骼肌、心脏、肺、肝脏、胰腺、视网膜、肾、甲状旁腺、乳腺、子宫、睾丸、小肠的刷状缘等组织中都可检测到。CaMKII的亚单位分布因组织而异，α和β亚单位只存在于神经组织，而γ和δ亚单位可存在于除脑以外的其它组织中。随着对CaMKII的结构、组织分布和生物学功能研究的深入，人们发现CaMKII在多种生物学事件中均发挥重要功能。它在调节神经元的活动，肌肉的收缩，细胞周期的控制，细胞的分泌，DNA损伤的修补，碳水化合物的代谢，基因的表达等方面有着重要的生物学作用。

目前报道的天然的内源性抑制性蛋白仅有大鼠脑细胞来源的钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIINβ、CaM-KIINα和人源的内源性抑制性蛋白CaM-KIINβ。化学合成的CaMKII抑制剂KN-62、KN-93的是通过与CaM结合位点的相互作用，阻止CaM与CaMKII的结合，特异性地抑制CaMKII的活性，使CaMKII不能自身磷酸化而不被激活。内源性CaMKII抑制性蛋白CaM-KIIN具有高特异性抑制CaMKII活性的能力，且实验证明内源性CaMKII抑制性蛋白CaM-KIIN只能与活化的CaMKII相互结合作用。据有文献报道CaMKII抑制剂能引起DNA的损伤，周期蛋白表达的改变，阻止细胞进入s期，从而导致细胞发生调亡。CaMKII抑制剂可增强P53的表达，将细胞阻滞在G2期。这种特异性抑制CaMKII活性的能力提示这些物质可能参与促进肿瘤细胞的调亡与坏死环节。

研究已表明，钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白与多种生命活动相关。因此，为诊断和治疗目的研究和开发新的钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白有重要意义。然而，目前为止却仍然没有发现人的钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白α。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的人钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白α(CaM-KIINα蛋白)以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

本发明经过广泛而深入的研究，发现了新型的人钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白αCaM-KIINα，它与已知大鼠来源的同源蛋白以及人CaM-KIINβ有极高的同源性。与化学性抑制剂对细胞的作用相似，人源CaM-KIINα可以阻遏细胞增殖，具有细胞生长抑制活性。因此，CaM-KIINα与其他抑制剂一样可以通过特异性结合CaMKII，阻止CaMKII的磷酸化激活，调控多种生理和病理活动，发挥重要作用，并可能在抗感染、抗炎症反应、抗肿瘤以及神经生长修复、免疫功能调节等多个领域的免疫诊断和免疫治疗方面具有重要的开发和应用价值。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的CaM-KIINα蛋白，该多肽是人源的，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段(尤其是具有第41-58位抑制性保守区的片段)、或其活性衍生物。

较佳地，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，更佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有结合和抑制钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II活性的功能的由(a)衍生的多肽。

更佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少80％相同性：(a)编码上述人CaM-KIINα的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中401-634位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-860位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有人CaM-KIINα蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达人CaM-KIINα蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人CaM-KIINα蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的人CaM-KIINα蛋白特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的15-860个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人CaM-KIINα蛋白活性的化合物，以及抑制人CaM-KIINα蛋白的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人CaM-KIINα蛋白的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在CaM-KIINα蛋白的方法，它包括：将样品与CaM-KIINα蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CaM-KIINα蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与人CaM-KIINα蛋白异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人CaM-KIINα蛋白活性的激动剂，或者筛选抑制人CaM-KIINα蛋白活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人CaM-KIINα蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人CaM-KIINα蛋白或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗肿瘤、炎症、神经系统和心血管病等病症。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1是本发明的人CaM-KIINα的cDNA序列，其中非编码序列用小写字母表示，编码序列用大写常规字母表示。

图2是本发明的人CaM-KIINα蛋白的全长氨基酸序列。

图3是本发明的人CaM-KIINα蛋白与大鼠来源其他钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白的氨基酸序列同源性比较。上方序列是人CaM-KIINα，下方序列是大鼠来源的CaM-KIIN蛋白。阴影部分是一致序列，边框部分是相似序列。

图4是本发明的人CaM-KIINα RT-PCR表达分析，提示CaM-KIINα表达于某些肿瘤细胞中；在人外周血单核细胞来源的树突状细胞成熟并受KLH刺激的活化过程中具有一定的表达模式。其中“Marker”表示分子量标准物。

图5是本发明的人CaM-KIINα在胞内高钙离子的条件下与CaMKII相互结合检测。

图6是本发明的人CaM-KIINα对CaMKII酶活性的抑制试验，提示具有抑制活性。

具体实施方式

在本发明中，术语“CaM-KIINα蛋白”、“CaM-KIINα蛋白”或“钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白α”可互换使用，都指具有人钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白αCaM-KIINα氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白αCaM-KIINα。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的CaM-KIINα蛋白或多肽”是指CaM-KIINα蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CaM-KIINα蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人CaM-KIINα蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人CaM-KIINα蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人CaM-KIINα蛋白”指具有人CaM-KIINα蛋白活性的SEQID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人CaM-KIINα蛋白相同功能的、SEQ IDNO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人CaM-KIINα蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人CaM-KIINα DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人CaM-KIINα蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人CaM-KIINα蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人CaM-KIINα蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有人CaM-KIINα蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，最佳地至少约70个连续氨基酸。

发明还提供人CaM-KIINα蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人CaM-KIINα蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人CaM-KIINα蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                      表1

 最初的残基代表性的取代优选的取代 Ala(A)Val；Leu；Ile Val Arg(R)Lys；Gln；Asn Lys Asn(N)Gln；His；Lys；Arg Gln Asp(D)Glu Glu Cys(C)Ser Ser Gln(Q)Asn Asn Glu(E)Asp Asp Gly(G)Pro；Ala Ala His(H)Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile  (I)Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu Leu(L)Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K)Arg；Gln；Asn Arg Met(M)Leu；Phe；Ile Leu Phe(F)Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu Pro(P)Ala Ala Ser(S)Thr Thr Thr(T)Ser Ser Trp(W)Tyr；Phe Tyr Tyr(Y)Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V)Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码CaM-KIINα蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人CaM-KIINα核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或CaM-KIINα蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的CaM-KIINα蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人CaM-KIINα蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人CaM-KIINα多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人CaM-KIINα编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人CaM-KIINα蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗CaM-KIINα蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗CaM-KIINα蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人CaM-KIINα蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人CaM-KIINα蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人CaM-KIINα DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人CaM-KIINα基因产物或片段。较佳地，指那些能与人CaM-KIINα基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人CaM-KIINα蛋白的分子，也包括那些并不影响人CaM-KIINα蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人CaM-KIINα基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人CaM-KIINα基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人CaM-KIINα蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人CaM-KIINα蛋白功能的抗体以及不影响人CaM-KIINα蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人CaM-KIINα基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人CaM-KIINα基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人CaM-KIINα蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人CaM-KIINα蛋白。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人CaM-KIINα蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人CaM-KIINα蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人CaM-KIINα蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人CaM-KIINα蛋白阳性的细胞。

多克隆抗体的生产可用人CaM-KIINα蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CaM-KIINα蛋白发生相互作用的物质，如配体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于肿瘤等方面的治疗。在使用本发明CaM-KIINα蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明CaM-KIINα蛋白或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的CaM-KIINα蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人CaM-KIINα蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于CaM-KIINα蛋白的无表达或异常/无活性的CaM-KIINα蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的CaM-KIINα蛋白，以抑制内源性的CaM-KIINα蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将CaM-KIINα基因转移至细胞内。构建携带CaM-KIINα基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人CaM-KIINα基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制人CaM-KIINα mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与人CaM-KIINα蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人CaM-KIINα蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测人CaM-KIINα蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人CaM-KIINα蛋白水平，可以用作解释人CaM-KIINα蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断CaM-KIINα蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在CaM-KIINα蛋白的方法是利用CaM-KIINα蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与CaM-KIINα蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CaM-KIINα蛋白。

CaM-KIINα蛋白的多聚核苷酸可用于CaM-KIINα蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，CaM-KIINα蛋白的多聚核苷酸可用于检测CaM-KIINα蛋白的表达与否或在疾病状态下CaM-KIINα蛋白的异常表达。如CaM-KIINαDNA序列可用于对活检标本的杂交以判断CaM-KIINα蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用CaM-KIINα蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测CaM-KIINα蛋白的转录产物。

检测CaM-KIINα基因的突变也可用于诊断CaM-KIINα蛋白相关的疾病。CaM-KIINα蛋白突变的形式包括与正常野生型CaM-KIINαDNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明CaM-KIINα蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从人树突状细胞cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为860个碱基，其开放读框位于401-634位，编码全长为78个氨基酸的人CaM-KIINα蛋白(SEQ IDNO：2)。该CaM-KIINα蛋白属于钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白家族分子，与大鼠来源的钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白α(CaM-KIINα)和钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白β(CaM-KIINβ)氨基酸序列高度同源，其中与CaM-KIINα一致性和相似性可高达98％，与CaM-KIINβ一致性为66％，相似性则为79％。人CaM-KIINα蛋白质分子量为8552.62Da，等电点5.22。RT-PCR分析表明CaM-KIINα在某些肿瘤细胞HeLa cell S3、MCF7、Reh和K-562细胞系中具有特定表达。Northern印迹分析表明在大脑、小脑、海马、组织中均有表达，已进行的研究提示，CaM-KIINα可能与其他抑制剂一样可以通过特异性结合CaMKII，阻止CaMKII的磷酸化激活，调控多种生理和病理活动，发挥重要作用，并可能在抗感染、抗炎症反应、抗肿瘤以及神经生长修复、免疫功能调节等多个领域的免疫诊断和免疫治疗方面具有重要的开发和应用价值。因此，CaM-KIINα蛋白或其相关的拮抗剂、激动剂等可为治疗肿瘤、炎症、神经系统和心血管病等疾病提供新的免疫诊断和靶向治疗途径，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

人CaM-KIINα cDNA的克隆

用Trizol试剂(Life Technologies公司)提取人树突状细胞总RNA。然后，从总RNA中分离poly(A)mRNA。将poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA后，用SuperScriptII克隆试剂盒(购自Gibco)将cDNA片段定向插入到载体的多克隆位点上，转化DH5α细菌形成cDNA质粒文库。用双脱氧法测定随机挑选克隆的5′末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库进行比较，结果发现有一个cDNA克隆的DNA序列为新的全长cDNA。通过合成一系列引物对新克隆所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，克隆所含的全长cDNA是一个新的cDNA序列(如SEQ ID NO：1所示)，编码一个新的蛋白质(如SEQ ID NO：2所示)。此蛋白质被命名为人钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白α(Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II Inhibitorα，CaM-KIINα)，其编码基因命名为人钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白α基因，即CaM-KIINα基因。

序列SEQ ID NO：1全长为860 bp(图1和SEQ ID NO：1)，包括400bp的5’端非编码区和223bp的3’端非编码区，编码含78个氨基酸的多肽(图2和SEQ IDNO：2)。理论上计算未糖基化的成熟分子的分子量约为8552.62Da，等电点5.22。

BLAST分析表明其与已知基因不同，与大鼠来源的钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIINα高度同源，一致性和相似性可高达98％(图3)，大鼠来源的钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIINβ一致性为66％，相似性则为79％(图3)。这表明它属于钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白家族分子。

实施例2

用RT-PCR方法获得人CaM-KIINα编码序列及对细胞表达的分析

(1)用RT-PCR方法获得人CaM-KIINα编码序列

用Trizol试剂提取处于对数生长期相应细胞系、人外周血单核细胞及经LPS刺激不同时间的人外周血单核细胞来源的树突状细胞总RNA，取5μg细胞总RNA与1μg Oligo-dT12-18混合，进行反转录。反转录体系为20μl，反应结束后加80μl ddH2O进行稀释。PCR扩增CaM-KIINα所用的引物如下：有义引物5’CCG AGG ATG TGA GTCCTG CTC(SEQ ID NO：3)，反义引物5’GAG GAG CCC AGA GCC TTC TC(SEQ ID NO：4)，同时以β-actin作为阳性对照。PCR反应体积为50μl，其中含反转录模板10μl、0.5mM引物、0.2mM dNTP和1U rTaq DNA聚合酶(Takara Inc.)，扩增参数为94℃20秒、59℃30秒、72℃40秒，30个循环后PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳初步确认。DNA序列分析结果表明该PCR产物的编码DNA序列与SEQ ID NO：1所示的127-840完全相同。

结果显示，人CaM-KIINαmRNA在人外周血单核细胞来源的树突状细胞不同成熟状态下，并受KLH刺激的活化过程中具有一定的表达模式(图4)。

(2)用RT-PCR方法对CaM-KIINα细胞表达的分析    

取不同组织和细胞，按上述相同反应条件进行RT-PCR，获得人CaM-KIINαRT-PCR表达分析图谱(图4)。结果提示人CaM-KIINαmRNA还表达于某些实体肿瘤细胞中，如乳腺癌细胞MCF-7、胶质瘤细胞A172、宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞SMMC7721、前列腺癌细胞PC-3、肺癌细胞A549；人CaM-KIINαmRNA还表达于某些造血系肿瘤细胞中，如单核细胞白血病细胞THP-1、组细胞白血病细胞U937、T淋巴瘤细胞Jurkat、B淋巴瘤细胞Raji和Daudi。而在新鲜分离的外周血T、B细胞及单核细胞、结肠癌细胞LoVo、卵巢癌细胞CaoV-3、髓系白血病细胞HL-60和NB4、以及急性淋巴细胞白血病细胞Reh中未见表达。

实施例3

人CaM-KIINα重组表达

在该实施例中，以实施例2中获得的RT-PCR扩增产物为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人CaM-KIINα全长编码区DNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-AC GGA TCC ATG TCG GAG GTG CTG CCC T-3’(SEQ ID NO：5)

该引物含有BamH I限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是人CaM-KIINα的全部编码序列；

3’端引物序列为：

5’-TC GAA TTC TTA GAC ACC AGG AGG TGC CT-3’(SEQ ID NO：6)

该引物含有EcoR I限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人CaM-KIINα的全部编码序列。

以实施例2中获得的RT-PCR扩增产物为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得编码人CaM-KIINαN端1-41个氨基酸的DNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-AC GGA TCC ATG TCG GAG GTG CTG CCC T-3’(SEQ ID NO：5)

该引物含有BamH I限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是人CaM-KIINα的编码序列；

3’端引物序列为：

5’-TC GAA TTC TTA GTT CTG CCC GGC GCC GA-3’(SEQ ID NO：7)

该引物含有EcoR I限制性内切酶的酶切位点和人CaM-KIINα的41位氨基酸之前的编码序列。

将获得的PCR产物纯化后经EcoR I-BamH I酶切再与原核GST融合表达质粒pGEX-4T3(Amersham-Pharmacia公司)按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDyeTerminator试剂盒，PE公司)。经测序证实，已插入了所设计的人CaM-KIINα全长或1-41位氨基酸编码序列。正确序列的载体称为pGEX-4T-人CaM-KIINα，和pGEX-4T-人CaM-KIINα(1-41)。

挑表达CaM-KIINα全长或1-41位氨基酸的阳性BL21克隆接种于100ml2×YTA培养基中，37℃300rpm振荡培养12-15hr，1∶10稀释于预热的2×YTA培养基继续振荡培养1.5hr，加100mM IPTG至0.1mM后30℃诱导2-6hr，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mMNa₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.3)重悬，超声(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％轻摇30min，然后12,000g 4℃离心10min，上清用0.8μm滤膜过滤后，过1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B层析柱，1×PBS充分洗涤后，加入500ul谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH 8.0)室温静置30分钟后收集洗脱液，重复洗脱2-3次，得到GST-CaM-KIINα融合蛋白，或GST-CaM-KIINα(1-41)融合蛋白。

实施例4：抗人CaM-KIINα抗体的产生

将实施例3中获得的重组蛋白全长人CaM-KIINα用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人CaM-KIINα基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。

实施例5：人CaM-KIINα真核表达载体的构建

在该实施例中，以实施例2中获得的RT-PCR扩增产物为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人CaM-KIINα全长编码区DNA作为插入片段。PCR反应参数为95℃ 15秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒，20循环后72℃延伸10分钟，

上游引物为5′-AC GAA TTC ATG TCG GAG GTG CTG CCC T-3′(5′端含BamHI位点，以及人CaM-KIINα编码区的起始码)(SEQ ID NO：8)，下游引物为5′-TGAA GCT TAC ACC AGG AGG TGC CTT G-3′(5′端含Kpn I位点)(SEQ ID NO：9)。

PCR产物纯化后直接与pGEM-T载体(Promega)按常规方法重组并转化至感受态细菌DH5α。挑取白色克隆进行鉴定、纯化并测序(测序引物为T7和SP6)。将正确序列的BamH I-Kpn I酶切片段经纯化后克隆至表达载体pcDNA3.1/Myc-His(-)B(Invitrogen公司)。经酶切鉴定阳性克隆后，重组子记为pcDNA-人CaM-KIINα。经测序证实，已插入了人CaM-KIINα编码序列。

实施例6：人CaM-KIINα和CaMKII的相互作用

以实施例5中所构建的人CaM-KIINα的真核表达载体质粒DNA利用LipofectAMINE试剂(Invitrogen)进行真核细胞NIH 3T3的基因转染，以pcDNA3.1/Myc-His(-)B质粒载体作为无关对照。转染后48小时，加入终浓度5nmol/ml离子霉素处理5分钟后，收集细胞(5×10⁶细胞/样品)，用PBS洗一遍后，用T-PER组织蛋白提取试剂(PIERCE)提取细胞全蛋白，用BCA法(PIERCE)测定蛋白浓度。各样品间蛋白浓度调节至一致后，200μg蛋白样品以Ni-NTA-Beads免疫沉淀，免疫沉淀物以抗CaMKII抗体(Santa Cruz)进行Western印迹检测人CaM-KIINα和CaMKII的相互结合。

Western印迹检测：每20μl与4μl 6倍上样缓冲液(100mmol/L Tris-HCL，200mmol/L DTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油，PH6.8)混匀，于100℃水浴煮沸5分钟后，行12％SDS-PAGE电泳，随后以100V恒定电压于4℃把聚丙烯酰胺中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，丽春红染色并标记方向，标出Marker所在位置。室温阻断4小时(10％脱脂奶粉的TBST溶液)，将兔源ERK、MEK1/2多抗按1∶1000稀释于脱脂奶粉溶液中，与硝酸纤维素薄膜于室温反应2小时后，用TBST(0.05％Tween20的TBS溶液)洗涤3次，每次10分钟。然后加以辣根过氧化物酶标记的相应二抗，室温孵育60分钟，TBST洗三次，每次10分钟，将Western印迹荧光检测试剂中的A液和B液以等体积混和，室温孵育1分钟后，甩干，压膜，曝光，显影。

结果显示，经离子霉素处理提高胞内Ca²⁺浓度后，以Ni-NTA-Beads沉淀的人CaM-KIINα及其相互作用蛋白中可检测到CaMKII的存在，证实人CaM-KIINα能够与活化状态的CaMKII发生相互结合(图5)。

实施例7：人CaM-KIINα对CaMKII酶活性的抑制作用

利用实施例3中重组表达的人CaM-KIINα全长或1-41位氨基酸的重组蛋白，建立CaMKII酶活性检测体系(New England Biolab公司)，具体试验步骤按照试剂盒说明书。通过CaMKII作用底物的磷酸化水平的变化来反映CaMKIIN对CaMKII酶活性的影响。

结果显示，不同浓度的全长人CaM-KIINα融合蛋白均可以抑制CaMKII对底物的磷酸化，而缺乏41-58位氨基酸抑制性保守区的人CaM-KIINα(1-41)融合蛋白和对照GST蛋白均不能抑制CaMKII的活性。提示人CaM-KIINα能够通过其抑制性保守区来抑制CaMKII的激酶活性(图6)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                         序列表

<110>第二军医大学免疫学研究所

<120>人钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制性蛋白α，其编码序列及用途

<130>033707

<160>9

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>860

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(401)..(634)

<223>

<400>1

cccgcccggc acccggggtg cgccctcctc ggtcccgcgc cctccgggct cgcagggacg     60

tctcctccct cccggctcgc ggccccgccc ggcccggccc ccgcccagag ccccagcgcg    120

ccgaggatgt gagtcctgct cgcctctggc ggagcagcag ccactcgcgc gcggagccgg    180

agcgcagcgc agcgcagccg cgggcgctct ccgggccgct cgcgcgagtg ccgcgctctt    240

gccctagcgg cgtcccccgg cctctcgccg gcgccaccgc cgcagcagcc cgcgggccgt    300

ccccggccgg ccgcccccgg ccccagcgcc gctgaccctg tccgccgcgg gcggggacgc    360

gggcggagga ggcgccgcgg cggagccccc ggacgcgacc atg tcg gag gtg ctg      415

                                           Met Ser Glu Val Leu 

                                           1               5

ccc tac ggc gac gag aag ctg agc ccc tac ggc gac ggc ggc gac gtg      463

Pro Tyr Gly Asp Glu Lys Leu Ser Pro Tyr Gly Asp Gly Gly Asp Val

               10                  15                  20

ggc cag atc ttc tcc tgc cgc ctg cag gac acc aac aac ttc ttc ggc      511

Gly Gln Ile Phe Ser Cys Arg Leu Gln Asp Thr Asn Asn Phe Phe Gly

            25                 30                  35

gcc ggg cag aac aag cgg ccg ccc aag ctg ggc cag atc ggc cgg agc      559

Ala Gly Gln Asn Lys Arg Pro Pro Lys Leu Gly Gln Ile Gly Arg Ser

        40                  45                 50

aag cgg gtt gtt att gaa gat gat agg att gat gac gtg ctg aaa aat      607

Lys Arg Val Val Ile Glu Asp Asp Arg Ile Asp Asp Val Leu Lys Asn

    55                  60                 65

atg acc gac aag gca cct cct ggt gtc taactccccc aaagacaatg            654

Met Thr Asp Lys Ala Pro Pro Gly Val

70                  75

agttaaggga gagaataaga acggcggtaa cagttattgg caaaaagcat gaaaagagaa    714

agcactttga aatttattac tagcttgcta cccacgatga aatcaacaac ctgtatctgg    774

tatcaggccg ggagacagat gaggcgagag gaggaggagg aggaggagaa ggctctgggc    834

tcctctgcaa aaaaaaaaaa aaaaaa                                         860

<210>2

<211>78

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Ser Glu Val Leu Pro Tyr Gly Asp Glu Lys Leu Ser Pro Tyr Gly

1               5                  10                  15

Asp Gly Gly Asp Val Gly Gln Ile Phe Ser Cys Arg Leu Gln Asp Thr

            20                 25                  30

Asn Asn Phe Phe Gly Ala Gly Gln Asn Lys Arg Pro Pro Lys Leu Gly

        35                 40                  45

Gln Ile Gly Arg Ser Lys Arg Val Val Ile Glu Asp Asp Arg Ile Asp

    50                 55                  60

Asp Val Leu Lys Asn Met Thr Asp Lys Ala Pro Pro Gly Val

65                 70                  75

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

ccgaggatgt gagtcctgct c                                               21

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

gaggagccca gagccttctc                                                 20

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

acggatccat gtcggaggtg ctgccct                                         27

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

tcgaattctt agacaccagg aggtgcct                                        28

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

tcgaattctt agttctgccc ggcgccga                                     28

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

acgaattcat gtcggaggtg ctgccct                                        27

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

tgaagcttac accaggaggt gccttg                                         26