家畜口蹄疫病毒A、O型基因工程双价多肽疫苗及其制备方法

摘要

涉及一种家畜口蹄疫病毒和双价多肽疫苗以及遗传工程领域，尤其是一种A、O型基因工程双价多肽疫苗及其制备方法。克隆了A、O型口蹄疫病毒VP1的抗原决定簇，将其串联与能显著提高其免疫原性的大片段相连后，插入原核表达载体，诱导表达的蛋白经纯化后制成具有口蹄疫A、O型免疫原性的双价多肽疫苗。其制备方法为在湿菌加缓冲液，离心，收集上清；将平衡的Ni+－NTA－Sepharose 6B加至上清中，将凝胶装到层析柱上；用缓冲液洗脱；收集，用SDS－PAGE分析；再作SDS－PAGE分析。能同时有效地预防A、O型口蹄疫病毒，安全可靠。

说明书

(1)技术领域

本发明涉及一种家畜口蹄疫病毒(FMDV)和双价多肽疫苗以及遗传工程领域，尤其是一种A、O型基因工程双价多肽疫苗及其制备方法。

(2)背景技术

口蹄疫是致偶蹄动物的一种急性、高度接触性、发热性传染病，以传播迅速、感染性高而著称，国际兽疫局将其列为A类传染病之首。传统的疫苗主要是灭活的和减毒的致病物质，即病原体在培养、纯化后，或者被灭活，或者被降低其毒性。这两种疫苗虽然具有较好的免疫原性，但是生产的安全性较差，需要对实验室以及参加实验的工作人员采取保护措施，保证不被致病物质污染：保证病毒不泄漏。在疫苗生产过程中，病毒有可能没有完全杀死或充分减毒，会导致疫苗中含有高毒性致病物质，进而导致被免疫动物发病而使疾病大规模流行。绝大多数的现行疫苗的有效期都很短，而且常常需要冷冻保存，这增大了疫苗在农村推广使用的难度。DNA重组技术的发展为制造新一代的重组疫苗提供了新思路。虽然目前已克隆了口蹄疫病毒VP1蛋白并制成口蹄疫疫苗，但是其免疫原性弱，对动物的保护效果尚不理想。口蹄疫属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，共包括A、O、C等7种血清型。我国主要以O型为主，A型口蹄疫也时有发生。目前口蹄疫的基因工程疫苗均为单价。1986年美国伊莱公司(CN86103718A)提出一种口蹄疫疫苗的制备方法，它是有治疗或预防口蹄疫活性的化合物。这种化合物含有结构式X-A-Y-B-Z序列，其中A和B是组成口蹄疫病毒VP外壳蛋白血清型序列的氨基酸残基序列，其中一个含有18到24氨基酸残基，并包括O血清型141-158位上氨基酸残基序列或其它血清型的相同序列，而另一个含有14到20氨基酸残基，并包括O血清型200到213位上的氨基酸残基序列或其它血清型的相同序列。1999年香港科技大学(CN1270839A)提出一种口蹄疫的抗原化抗体疫苗，它属于一种治疗猪口蹄疫的疫苗，此疫苗是将得自FMDV的肽表位移植到猪抗体CDR环而产生的抗原化抗体疫苗。可通过PCR由FMDV的VP1基因克隆FMDV肽表位。使用重叠的PCR法将FMDV肽表位插入到猪免疫球蛋白重链和轻链基因的CDR区域内，将所得的抗原化抗体基因克隆至哺乳动物表达载体。将质粒转染至CHO或骨髓瘤细胞，选择稳定的转染子细胞系以大量产生所需的蛋白质疫苗。2000年中国科学院上海植物生理研究所提出一种新型口蹄疫苗及其制备方法，它是一种新的含口蹄疫病毒抗原小肽的融合蛋白及其编码序列，以及这些融合蛋白在口蹄疫的诊断和预防上的用途。还提供了含有这些新型融合蛋白的口蹄疫疫苗及其制备方法。所说的融合蛋白，是在烟草花叶病毒外壳蛋白的第155-156位氨基酸之间插入有长度为10-20个氨基酸的口蹄疫病毒特异性表位。该口蹄疫病毒特异性表位的长度为11-14个氨基酸。该口蹄疫病毒特异性表位选自下组：SEQ ID NO：2、3和4。2001年深圳市三方圆信息技术有限公司提出一种家畜口蹄疫基因工程苗及其制造方法，工程苗是由病毒RNA反转录获得并可编码VP1蛋白的全DNA序列，是在包括植物的根茎叶和种子在内的植物反应器中形成的立体结构的总和，分子量为30-150KDa，通过将VP1全基因插入质粒载体、重组质粒转入植物中表达和转基因种子种入土壤获得可作为疫苗的植物等过程。

(3)发明内容

本发明的目的在于提供一种能同时有效地预防A、O型口蹄疫病毒的、安全可靠的疫苗及其制备方法。

本发明克隆了A、O型口蹄疫病毒VP1的抗原决定簇，将其串联与能显著提高其免疫原性的大片段相连后，插入原核表达载体，诱导表达的蛋白经纯化后制成具有口蹄疫A、O型免疫原性的双价多肽疫苗。

本发明是一种能预防A、O型口蹄疫病毒的双价多肽疫苗。是将编码A、O型口蹄疫病毒毒株的VP1蛋白中的抗原决定簇部分连接。为增强其免疫原性，在该基因的末端连接上一段中间包含O、A型口蹄疫病毒抗原簇的大片段。其核苷酸序列为：

1    GGATCCATGGCTGTGCCAAACTTGCGTGGCGATTTGCAGGTGTTGGCTCAGAAAGTGGCT

61   CGTACTTTGCCAGAGCTCCGATCG CGTCATAAACAGAAAATTGTGGCTCCAGTGAAACAG

121  ACTTTGGAATTCGGCTCTGGCCGTCGTGGCGACGATATGGGCTCTTTGGCTGCTCGTGTGGTG

181  AAACAGTTGCCAGGTACCGTCGACATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCT

241  GTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGAC

301  ACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCAT

361  ACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTG

421  GGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCAGTCGACGCAGTTCCAAACTTGCGTGGTGATTTGCAG

481  GTTTTGGCACAGAAAGTTGCTCGTACCTTGCCAGGCTCTGGCCGTCGTGGCGATATGGGC

541  TCTTTGGCTGCTCGTGTGGTGAAACAGTTGCCACTCGAGTCCAGGGAATTAGTAGTCAGC

601  TATGTCAATGTTATGGGCCTAAAAATCAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTT

661  ACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACT

721  CCTCCTGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTT

781  GTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCT

841  CAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGAAGCTT

其中7～72，85～126，451～513为VP1蛋白的O型抗原决定簇；

133～192，514～573为VP1蛋白的A型抗原决定簇；

205～450，574～894为有利于FMDV多肽疫苗形成一定空间结构的载体蛋白；

其他序列为连接片段。

本发明的疫苗，其包涵体变性蛋白经Ni⁺-NTA-Sepharose 6B亲和层析柱在非变性的条件下直接分离纯化，具体步骤如下：

1)在湿菌加缓冲液(buffer)A(6M盐酸胍，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH8.0)，离心，收集上清；

2)将用buffer A平衡的Ni⁺-NTA-Sepharose 6B加至上清中，将凝胶装到层析柱上；

3)用buffer A和buffer B(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH8.0)洗脱；

4)用buffer C(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH6.3)洗脱；

5)用buffer D(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH5.9)洗脱，再用buffer E(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH4.5)洗脱，收集，用SDS-PAGE分析；

6)用buffer F(6M盐酸胍，0.2M乙酸)洗涤，收集，作SDS-PAGE分析。

表达产物分别用以下四种溶液依次透析复性12～24h：

1)8M尿素，5mM EDTA，1×PBS；

2)2M尿素，5mM EDTA，1×PBS；

3)0.2M尿素，5mM EDTA，1×PBS；

4)5mM EDTA，1×PBS。

(4)附图说明

图1为诱导表达产物的SDS-PAGE电泳图。

图2为蛋白质过柱纯化图。

图3为纯化的重组蛋白和包涵体的Dot-Elisa分析。

(5)具体实施方式

以下将结合附图对本发明作进一步的说明。

原核表达载体pET-28a经BamH I和Hind III双酶切后的产物，纯化后与以上片段通过T₄ DNA连接酶于16℃连接过夜。次日转化感受态pET28a表达菌BL21(DE3)细胞。经酶切及PCR鉴定得阳性克隆pET28a-T8-3S。

将此阳性克隆置于具有Kan^r的LB培养基中，37℃下培养过夜，次日取300～700uL过夜培养液接种于10mL LB培养基中，30～37℃培养3h，使菌种OD₆₀₀达0.6～0.9，吸1mL作为对照，然后加IPTG使其终浓度为1mmol/L，37℃诱导3～6h，每隔一小时从培养液中取1mL转移至离心管中，12,000g离心1～5min，收集菌体，沉淀重悬于100μL的1×SDS加样缓冲液中，100℃加热3～10min，进行SDS-PAGE(浓缩胶8％，分离胶12％)电泳后进行考马斯亮蓝染色4～10h，用甲醇∶冰醋酸∶水(45∶45∶10，V/V/V)溶液中45℃脱色1～4h。与pET-28a空载体诱导表达样品的SDS-PAGE电泳相比，发现诱导后第二个小时开始便出现了明显的重组融合蛋白条带，分子量与计算的相吻合，为34KD左右，参见图1，其中第一道为pET-28a未诱导表达；第二道为pET-28a诱导表达4h；第三道为pET28a-T8-3S未诱导表达；第四道为pET28a-T8-3S诱导表达2h；第五道为pET28a-T8-3S诱导表达3h；第六道为蛋白标准样品。

本发明的疫苗，其包涵体变性蛋白经Ni⁺-NTA-Sepharose 6B亲和层析柱在非变性的条件下直接分离纯化(参见图2，其中横坐标为时间T/Min，纵坐标为紫外吸收值a/(280nm))，

具体步骤如下：

1)每克湿菌加4～5mL buffer A(6M盐酸胍，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH8.0)，室温搅拌；10,000g离心10～20min收集上清；

2)将4～5mL用buffer A平衡的Ni⁺-NTA-Sepharose 6B加至上清中，室温搅拌40～60min，将凝胶装到直径为1.6cm的层析柱上；

3)用10个床体积的buffer A和5个床体积的buffer B(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01MTris/HCl，pH8.0)洗脱，如必要，洗至A 280＜0.01；

4)用buffer C(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH6.3)洗脱，洗至A280＜0.01；

5)用10-20mL buffer D(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH5.9)先洗，再用10-20mLbuffer E(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH4.5)洗，每3mL收集一管，用SDS-PAGE分析；

6)用20 mLbuffer F(6M盐酸胍，0.2M乙酸)洗涤，每3mL收集一管，作SDS-PAGE分析。

表达产物分别用以下四种溶液依次透析复性12～24h：

1)8M尿素，5mM EDTA，1×PBS；

2)2M尿素，5mM EDTA，1×PBS；

3)0.2M尿素，5mM EDTA，1×PBS；

4)5mM EDTA，1×PBS。

为进一步确证该融合蛋白是以何形式在大肠杆菌中表达，我们将收集的表达后菌体经10mM Tris-Cl(pH7.6)的缓冲液重悬，冰浴中进行超声波破碎菌体(破碎8～40次，每次30～60s，间隔30～60s)，细胞裂解液于4℃，12,000g离心15min，吸上清，与上样缓冲液以1∶1混合，沉淀重悬于1×SDS上样缓冲液中，100℃加热3min，于8％浓缩胶，12％分离胶中进行SDS-PAGE电泳，经染色脱色后分析该融合表达蛋白是以包涵体的形式存在的。

为了检测融合重组蛋白是否具有FMDV抗A和抗O的抗原性，以小鼠FMDV标准抗A和抗O抗体作为第一抗体，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，对纯化的重组蛋白和包涵体进行Dot-Elisa检测，结果表明：纯化的重组蛋白和包涵体均能与抗A和抗O抗体发生免疫反应，表明包涵体和纯化的蛋白均具有抗A和抗O双重抗原性(参见图3)，其中第一道为纯化的重组蛋白，第二道为包涵体；1：一抗为小鼠标准FMDV抗A型免疫血清；2：一抗为小鼠标准FMDV抗O型免疫血清；3：一抗为小鼠阴性血清。将纯化后的融合重组蛋白、包涵体经12％SDS-PAGE电泳分离后，电转移转至硝酸纤维素膜上，用封闭液封闭后，以FMDV标准抗A和抗O抗体作为第一抗体，以辣根过氧化物酶标记的IgG为二抗，进行WesternBlotting分析，在包涵体和纯化后的融合重组蛋白样品中可以检测到一个特异性条带，分子量大小约33KD，与计算值相吻合，而pET-28a诱导表达产物样品中无相应条带。这进一步说明了包涵体和纯化的蛋白均具有抗A和抗O双重抗原性。

将纯化的重组蛋白50～100μg与完全佐剂等体积混合注射小鼠，半月后相同剂量加强免疫一次，一周后以相同剂量再免疫一次，一周后眼眶采血，制备血清供Elisa检测用。ELISA板每孔包被5～10μg纯化的重组蛋白质，4℃过夜，洗涤液洗涤5～10min，用封闭液封闭1～2h，按系列梯度稀释免疫后的待测血清，加阴性、阳性血清作为对照，37℃温育1h，洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，加200μL/孔TMB显色底物，室温避光30min，加终止液终止反应，酶标仪波长450nm处测OD值，用空白孔调零点，如OD值大于阴性对照OD值的2.1倍，认为是阳性。测纯化蛋白免疫后血清的效价为1280。

实施例：

用化学方法合成编码O和A型口蹄疫病毒VP1蛋白中抗原决定簇的DNA片段，将此三片段串联后与一段中间包含O、A型口蹄疫病毒抗原簇的大片段连接，与pET-28a原核表达载体质粒，分别悬浮于TE缓冲液中，经BamHI和HindIII双酶切后，跑1％的琼脂糖凝胶电泳，经EB染色后回收亮带，用少量胶回收试剂盒回收DNA。两者混合后，加入1单位的T₄ DNA连接酶，在16℃连接过夜，加入到40μL现制的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，4℃保持30min，经37℃热激，冰浴2min后，加入360μL未加抗性的LB液体培养基，37℃摇菌45min，倒入带有Kan^r的LB培养基，37℃培养一夜后挑取单克隆提取质粒后酶切鉴定，选出阳性克隆子。通过DNA测序，该克隆子与设计相符。

将阳性克隆子接种于少量Kan^r培养基中，37℃过夜振荡，次日取1000μL过夜培养液接种于含Kan^r的100mL LB培养基中，37℃摇菌3h，使菌液OD₆₀₀达到0.8左右，加IPTG使其终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达4h，12,000g离心1min，收集菌体，用两倍体积的10mmol/LTris-Cl(pH7.6)的缓冲液重悬，冰浴中用超声波破碎菌体，破碎60次，每次40s，间隔1min，菌体于10,000g离心30min，即得到重组的融合蛋白，其融合蛋白含量约占40％。每克菌体加4～5mL buffer A(6M盐酸胍，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH8.0)，室温搅拌；10,000g离心10～20min收集上清：将4～5mL用buffer A平衡的Ni⁺-NTA-Sepharose 6B加至上清中，室温搅拌40～60min，将凝胶装到直径为1.6cm的层析柱上；用10个床体积的buffer A和5个床体积的buffer B(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH8.0)洗脱，如必要，洗至A280＜0.01；用buffer C(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH6.3)，洗至A280＜0.01：用10个床体积buffer D(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH5.9)先洗，再用10个床体积buffer E(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH4.5)洗，每3mL收集一管，用SDS-PAGE分析。用20mL buffer F(6M盐酸胍，0.2M乙酸)洗涤，每3mL收集一管，作SDS-PAGE分析。表达产物分别用以下四种溶液依次透析复性12～24h：

1)、8M尿素，5mM EDTA，1×PBS；

2)、2M尿素，5mM EDTA，1×PBS；

3)、0.2M尿素，5mM EDTA，1×PBS；

4)、5mM EDTA，1×PBS。