从莲子心中分离制备莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的方法

摘要

本发明公开的从莲子心中分离莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的方法，采用的是逆流色谱方法，用于分离的溶剂可为正构烷烃、卤代烃、脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯、醚类或水中的两种或两种以上的混合物，该方法能直接分离大量粗提样品或合成混合物，具有能保证较高的峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂的特点。适用于用各种型号的逆流色谱仪对各种途径获得的粗品提纯、分离制备莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱单体，分离结果纯度可达到95％以上。

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用色谱法从莲子心中分离制备出高纯度单体莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱的方法。

背景技术

莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱是莲子心的主要生物碱。莲子心为睡莲科莲属植物种子的胚芽，是我国重要的中药之一，具有清心火、降血压、强心等功用。大量的研究表明莲子心的有效成分是这三种生物碱。由于这三种生物碱在心脑血管等方面的突出疗效，分离制备高纯的化合物单体成为研究的一个重要内容。然而，这三种酚性生物碱的化学性质却不稳定，易氧化，而且也不易形成结晶。因此，采用传统的分离技术如薄层色谱、柱色谱以及高效液相色谱等时，常常因为固体载体的吸附而产生拖尾、污染、损耗，结果很难获得较高纯度的化合物单体的。

中国专利CN1117735C公开了一种从莲子心中提取纯化异莲心碱和莲心碱的方法，这种方法是将莲子芯生物碱总碱成盐后分步结晶，操作步骤繁琐，难以规模化生产。因此，迫切需要一种高效、快速的分离方法，使莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱从莲子心生物碱粗品中以较高的收率被分离制备出来。

发明内容

本发明的目的是提供一种低成本、高回收率、适合于大规模从莲子心中分离制备莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的方法。

本发明的从莲子心中分离制备莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的方法，采用的是逆流色谱方法，包括以下步骤：

1)将莲子心粉用有机溶剂反复浸提，将提取液合并、浓缩成浸膏，所得浸膏用浓度低于20％酸水溶液溶解，过滤，滤液调PH至碱性，析出沉淀物，得到莲子心生物碱粗品；或者将莲子心粉直接用浓度低于20％酸水溶液浸提，过滤，滤液调PH至碱性，析出沉淀物，得到莲子心生物碱粗品；

2)将用于分离的溶剂倒入分液器中，形成互不相溶的上下两相溶剂，上下两相的体积比为0.5-2.0；

3)将莲子心生物碱粗品溶于步骤2)的两相溶剂中，得到莲子心生物碱样品溶液；  

4)将步骤2)两相溶剂中的一相注入逆流色谱仪分离柱内作为固定相，将步骤3)所得的莲子心生物碱粗品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，注入两相溶剂中的另一相作移动相，莲子心生物碱便在逆流色谱仪内进行连续的分配，通过在线检测器的检测，收集、合并流出物，分别得到纯化的莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱。

上述步骤1)所说的有机溶剂可以是正构烷烃、卤代烃、脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯或醚。

上述步骤2)所说的用于分离的溶剂可为正构烷烃、卤代烃、脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯、醚类或水中的两种或两种以上的混合物，这些溶剂对莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱有较好的分配系数。

本发明采用的逆流色谱方法是一种连续的无需任何固体支持物的液液分配色谱方法，它避免了固态支持体或载体造成的吸附、损耗和变性等问题，具有能保证较高的峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂等特点，能直接分离大量粗提样品或合成混合物，分离结果纯度可达到95％以上。而且所用的逆流色谱仪为普通仪器，它较高效液相色谱仪远为简单便宜，其溶剂由普通溶剂配制，价格便宜，因此是一种经济的从莲子心提取物中分离莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的方法。

附图说明

图1为实施例1中莲子心生物碱粗品的高效液相分析图；

图2为实施例1中莲子心生物碱分离的逆流色谱及纯化的化合物的高效液相分析图；

图3为实施例1中莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的化学结构图；

图4为实施例2中莲子心生物碱分离的逆流色谱及纯化的化合物的高效液相分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。

实施例1

1.将12kg干的莲子心粉用95％乙醇10L室温冷浸48小时，抽滤出溶剂，在滤渣中再加入10L的95％乙醇，重复以上操作三次，将提取液合并用旋转蒸发器减压浓缩成浸膏，浓缩温度为40℃。所得浸膏用4L的1.5％的盐酸溶解，抽滤，滤液用10％氨水调PH至8.5，析出淡黄色沉淀。收集析出的淡黄色沉淀，得85g莲子心生物碱粗品。高效液相色谱分析(如图1，图中1为莲心碱，2为异莲心碱，3为甲基莲心碱)表明三种主要成分的含量分别为15.4％，15.9％，47.6％。

2.用逆流色谱仪分离莲子心生物碱提取物。用石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳、氯仿、甲醇和水，按体积比为1∶1∶4∶4∶6∶1配制两相溶剂，在分液容器中静置分层，分出上下相。将莲子心生物碱粗品1102mg溶于9ml上相和9ml下相中形成样品溶液。逆流色谱柱内径4mm，柱体积为1600ml。以上相作固定相，下相为移动相，待逆流色谱仪分离柱内中注满固定相后，将样品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，转速为450转，以5ml/min的流速注入移动相，通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长280nm，收集、合并流出物，分别得到莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱，其纯度分别为97.45％，95.32％，98.43％，见图2，图中1为莲心碱，2为异莲心碱，3为甲基莲心碱。经现代波谱测试证明经逆流色谱分离得到的化合物结构如图3所示，图中1为莲心碱，2为异莲心碱，3为甲基莲心碱。表1-表6分别列出了所得的莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的一维和二维核磁共振波谱数据。

表1.莲心碱的¹H-NMR和¹H-¹H COSY谱图数据

原子序号  化学位移  δ，ppm    多重性    ¹H-¹H COSY    1    3.50  1H，d，J＝8.30Hz    H-9    2-CH₃    2.58  3H，s    3ax    2.74  1H，m    H-3eq，H-4    3eq    3.19  1H，m    H-3ax，H-4    4    2.84  2H，m    H-4ax，H-3    5    6.67  1H，s    6-OCH₃    3.88  3H，s    8    6.45  1H，s    9ax    2.69  1H，m    H-9eq，H-1    9eq    3.22  1H，m    H-1，H-9ax    11    6.98  1H，d，J＝8.15    H-12    12    6.79  1H，d，J＝8.15    H-11    14    6.79  1H，d，J＝8.15    H-15    15    6.98  1H，d，J＝8.15    H-14

    1′    3.69    1H，d，J＝9.00Hz    H-9′    2′-CH₃    2.54    3H，s    3′ax    3.00    1H，m    H-3′eq，H-4′    3′-eq    3.46    1H，m    H-4′，H-3′ax    4′ax    2.59    1H，m    H-4′eq，H-3′    4′eq    3.01    1H，m    H-3′，H-4′ax    5′    6.58    1H，s    6′-OCH₃    3.84    3H，s    7′-OCH₃    3.43    3H，s    8′    5.71    1H，s    9′ax    2.62    1H，m    H-9′eq，H-1′    9′eq    3.13    1H，m    H-9′ax，H-1′    11′    6.81    1H，s    14′    6.72    1H，d，J＝8.15    H-15′    15′    6.39    1H，d，J＝8.15    H-14′

表2.莲心碱的¹³C-NMR和2D NMR谱图数据

原子序号 ¹³C-NMRDEPT^a    HMQC    HMBC    1  65.604  CH    3.5    H9，2-CH₃    2-CH₃  42.709  CH₃    2.58    H-1，H-3    3  48.143  CH₂    3.19，2.74    H-4，2-CH₃    4  26.57  CH₂    2.84    H-3，H-5    4a  129.773  q^b    H-8，H-4    5  112.17  CH    6.67    6  148.223  q    H-5，H-8，6-OCH₃    6-OCH₃  55.985  CH₃    3.88    7  143.378  q    H-5，H-8    8  118.027  CH    6.45    H-1    8a  130.671  q    H-1，H-8    9  40.087  CH₂    3.22，2.69    H-1，H-11，H-15

    10  130.725  q    H-9，H-11，H-15    11  130.992  CH    6.98    H-12，H-15    12  116.921  CH    6.79    H-11，H-14    13  155.755  q    H-11，H-15，H-12，H-14    14  116.921  CH    6.79    H-12，H-15    15  130.992  CH    6.98    H-11，H-14    1′  64.655  CH    3.69    H-9′，2′-CH₃    2′-CH₃  40.435  CH₃    2.54    H-3′，H-1′    3′  44.237  CH₂    3.46，3.00    H-4′，2′-CH₃    4′  21.705  CH₂    3.01，2.59    H-5′    4′a  123.427  q    H-4′，H-3′，H-8′    5′  111.349  CH    6.58    6′  147.75  q    H-5′，H-8′，6′-OCH₃    6′-OCH₃  55.826  CH₃    3.84    7′  146.307  q    H-5′，H-8′，7′-OCH₃    7′-OCH₃  55.423  CH₃    3.43    8′  111.474  CH    5.71    H-1′    8′a  126.654  q    H-5′，H-1′，H-9′    9′  42.546  CH₂    3.13，2.62    H-1′，H-11′，H-15′    10′  130.725  q    H-11′，H-14′，H-9′    11′  121.827  CH    6.81    H-15′，H-9′    12′  144.101  q    H-11′，H-14′    13′  146.462  q    H-14′，H-15′，H-11′    14′  115.377  CH    6.72    15′  127.496  CH    6.39    H-11′，H-9′

^a DEPT 135.    ^b季碳.

表3.异莲心碱的¹H-NMR和¹H-¹H COSY谱图数据

原子序号  化学位移δ，ppm  多重性  ¹H-¹H COSY    1    3.66    1H，m    H-9  2-CH₃    2.39    3H，s

    3ax    2.64    1H，m    H-3eq，H-4    3eq    3.08    1H，m    H-4，H-3ax    4ax    2.47    1H，m    H-4eq，H-3    4eq    2.70    1H，m    H-4ax，H-3    5    6.47    1H，s    6-OCH₃    3.81    3H，s    8    6.34    1H，s    9ax    2.77    1H，m    H-9eq，H-1    9eq    3.03    1H，m    H-9ax，H-1    11    6.90    1H，d，J＝8.42    H-12    12    6.70    1H，d，J＝8.42    H-11    13-OCH₃    3.73    3H，s    14    6.70    1H，d，J＝8.42    H-15    15    6.90    1H，d，J＝8.42    H-14    1′    3.57    1H，m    H-9′    2′-CH₃    2.51    3H，s    3′ax    2.78    1H，m    H-3′eq，H-4′    3′eq    3.16    1H，m    H-4′，H-3′ax    4′ax    2.66    1H，m    H-4′eq，H-3′    4′eq    2.87    1H，m    H-4′ax，H-3′    5′    6.64    1H，s    6′-OCH₃    3.79    3H，s    8′    6.30    1H，s    9′ax    2.80    1H，m    H-9′eq，H-1′    9′eq    2.93    1H，m    H-9′ax，H-1′    11′    6.46    1H，s    14′    6.81    1H，d，J＝8.16    H-15′    15′    6.72    1H，J＝8.16    H-14′

表4.异莲心碱的¹³C-NMR和2D NMR谱图数据

原子序号   ¹³C-NMRDEPT^a  HMQC    HMBC    1    64.569  CH    3.66    H-8，2-CH₃，H-9    2-CH₃    42.692  CH₃    2.39    3    47.468  CH₂    3.08，2.64    2-CH₃    4    25.562  CH₂    2.70，2.47    H-5，H-3    4a    130.034  qb    H-5    5    110.640  CH    6.47    6    145.254  q    H-5，6-OCH₃    6-OCH₃    55.982  CH₃    3.81    7    143.568  q    H-5，H-8    8    113.869  CH    6.34    8a    125.601  q    H-8，H-4    9    39.339  CH₂    3.03，2.77    H-11，H-15    10    131.436  q    H-12，H-14    11    130.503  CH    6.90    H-9，H-12    12    113.572  CH    6.70    H-11    13    157.867  q    13-OCH₃，    H-11，H-15，H-12，H-14    13-OCH₃    55.206  CH₃    3.73    14    113.572  CH    6.70    H-15    15    130.503  CH    6.90    H-9，H-14    1′    64.418  CH    3.57    H-8′2′-CH₃，H-9′    2′-CH₃    42.748  CH₃    2.51    3′    46.952  CH₂    3.16，2.78    2′-CH₃    4′    26.115  CH₂    2.87，2.66    H-3′，H-5′    4′a    130.699  q    H-1′，H-5′    5′    112.455  CH    6.64    H-4′eq    6′    149.090  q    H-5′，H-8′，6′-OCH₃    6′-OCH₃    55.821  CH₃    3.79

    7′    142.866    q    H-5′，H-8′    8′    120.067    CH    6.30    8′a    130.383    q    H-1′，H-5′    9′    40.679    CH₂    2.93，2.80    H-11′，H-15′    10′    131.810    q    H-14′    11′    119.085    CH    6.46    H-15′，H-9′    12′    144.577    q    H-11′，H-14′    13′    145.254    q    H-15′，H-11′    14′    115.427    CH    6.81    15′    125.239    CH    6.72    H-11′

^aDEPT 135.    ^b季碳.

表5.甲基莲心碱的¹H-NMR和¹H-¹H COSY谱图数据

原子序号    ¹H-NMRδ，ppm    多重性  ¹H-¹H COSY  1    3.62    1H，m    H-9  2-CH₃    2.48    3H，s  3ax    2.73    1H，m    H-3eq  3eq    3.13    1H，m    H-3ax，H-4  ax    2.62    1H，m    H-4eq，H-3  eq    2.79    1H，m    H-4ax，H-3  5    6.61    1H，s  6-OCH₃    3.79    3H，s  8    6.34    1H，s  9ax    2.77    1H，m    H-9eq，H-1  9eq    2.98    1H，m    H-9ax，H-1  11    6.89    1H，s    H-12  12    6.67    1H，d，J＝7.06    H-11  13-OCH₃    3.70    3H，s  14    6.67    1H，d，J＝7.06    H-15  15    6.89    1H，d，J＝7.06    H-14  1′    3.62    1H，m    H-9′

  2′-CH₃    2.45    3H，s  3′ax    2.73    1H，m    H-3′eq，H-4′  3′eq    3.08    1H，m    H-3′ax，H-4′  4′ax    2.59    1H，m    H-4′eq，H-3′  4′eq    2.78    1H，m    H-4′ax，H-3′  5′    6.49    1H，s  6′-OCH₃    3.76    3H，s  7′-OCH₃    3.52    3H，s  8′    5.97    1H，s  9′ax    2.67    1H，m    H-9′eq，H-1′  9′eq    3.06    1H，m    H-9′ax，H-1′  11′    6.51    1H，s  14′    6.82    1H，d，J＝6.68    H-15′  15′    6.66    1H，d，J＝6.68    H-14′

表6.甲基莲心碱¹³C-NMR和2D NMR谱图数据

原子序号   ¹³C-NMR  DEPT^a    HMQC    HMBC    1    64.48    CH    3.62    2-CH₃，H-8    2-CH₃    42.766    CH₃    2.48    3    47.275    CH₂    3.13，2.73    2-CH₃    4    26.194    CH₂    2.79，2.62    H-3，H-5    4a    130.466    q^b    H-5    5    112.421    CH    6.61    6    149.064    q    H-5，H-6，H-8    6-OCH₃    55.794    CH₃    3.79    7    142.893    q    H-5，H-8    8    120.094    CH    6.34    8a    130.979    q    H-8，H-5，H-4    9    39.94    CH₂    2.98，2.77    H-15，H-11    10    131.506    q    H-12，H14，H-9

    11    130.555    CH    6.89    H-12，H-9，H-15    12    113.515    CH    6.67    H-11，H-14    13    157.877    q    H-11，H-15，H-12，    H-14，13-OCH₃    13-OCH₃    55.191    CH₃    3.70    14    113.515    CH    6.67    H-12，H-15    15    130.555    CH    6.89    H-14，H-9，H-11    1′    64.834    CH    3.62    2′-CH₃，H-8′    2′-CH₃    42.521    CH₃    2.45    3′    46.644    CH₂    3.08，2.73    2′-CH₃    4′    25.214    CH₂    2.78，2.59    H-5′    4′a    129.07    q    H-5′，H-8′    5′    111.211    CH    6.49    6′    147.298    q    H-5′，H-8′，H6′-OCH₃    6′-OCH₃    55.919    CH₃    3.76    7′    146.367    q    H-5′，7′-OCH₃，H-8′    7′-OCH₃    55.537    CH₃    3.52    8′    111.066    CH    5.97    8′a    125.653    q    H-8′    9′    40.706    CH₂    3.06，2.67    H-15′，H-11′    10′    131.720    q    H-11′，H-15′，H-9′    11′    119.265    CH    6.51    H-9′，H-15′    12′    144.995    q    H-14′    13′    145.715    q    H-15′，H-11′    14′    115.879    CH    6.82    15′    125.299    CH    6.66    H-9′，H-11′

^aDEPT 135.    ^b季碳

实施例2：

莲子心生物碱粗品制备方式同实施例1，用逆流色谱仪分离莲子心生物碱提取物。用乙酸乙酯、四氯化碳、甲醇和水，按体积比为1∶6∶4∶1配制两相溶剂，在分液容器中静置分层，分出上下相。将莲子心生物碱粗品5850mg溶于15ml上相和15ml下相中形成样品溶液。逆流色谱柱内径4mm，柱体积为1600ml。以上相作固定相，下相为移动相，待逆流色谱仪分离柱内中注满固定相后，将样品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，转速为450转，以5ml/min的流速注入移动相，通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长280nm，收集、合并流出物，分别得到莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱，其纯度分别为98.52％，97.12％，99.54％，见图4。

实施例3：

莲子心生物碱粗品制备方式同实施例1，用逆流色谱仪分离莲子心生物碱提取物。用乙醚、乙酸乙酯、四氯化碳、甲醇和水，按体积比为1∶1∶7.5∶5∶1配制两相溶剂，在分液容器中静置分层，分出上下相。将莲子心生物碱粗品150mg溶于1.5ml上相和1.5ml下相中形成样品溶液。逆流色谱柱内径2mm，柱体积为380ml。以上相作固定相，下相为移动相，待逆流色谱仪分离柱内中注满固定相后，将样品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，转速为550转，以1.5ml/min的流速注入移动相，通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长280nm，收集、合并流出物，分别得到莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱，其纯度分别为96.54％，95.13％，97.27％。

实施例4：

莲子心生物碱粗品制备方式同实施例1，用逆流色谱仪分离莲子心生物碱提取物。用正己烷和水，按体积比为10∶7配制两相溶剂，在分液容器中静置分层，分出上下相。将莲子心生物碱粗品55mg溶于1ml上相和1ml下相中形成样品溶液。逆流色谱柱内径1.6mm，柱体积为280ml。以上相作固定相，下相为移动相，待逆流色谱仪分离柱内中注满固定相后，将样品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，转速为550转，以1ml/min的流速注入移动相，通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长280nm，收集、合并流出物，分别得到莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱，其纯度分别为97.24％，95.45％，96.33％。