抗HnRNP A2/B1抗原的单克隆抗体,其制备方法及应用

摘要

本发明提供了一种与人类癌细胞及组织胞浆中HnRNP A2/B1抗原决定簇特异性结合的单克隆抗体，其重链可变区具有SEQ ID NO：2中31－35、50－66、99－108位氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：4中24－38、54－60、93－100位氨基酸序列。本发明还提供了编码该抗体的核酸分子、该抗体的制备方法及其用于诊断和/或治疗人类肿瘤的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种单克隆抗体，该单克隆抗体对人类癌细胞及组织胞浆中HnRNP A2/B1抗原有特异反应活性能力。

背景技术

随着现代工业的发展，环境污染日益加重，肺癌发病率亦逐年上升。在欧美等发达国家肺癌死亡率已占恶性肿瘤之首，而我国近20年来发病率亦显著提高。统计资料表明：男性肺癌死亡率增加120.93％，女性增加90.41％，农村增长比城市更为明显(周华清主编肺癌基础研究与临床治疗进展，第1版，北京：科学出版社，1999，1-15)。

目前肺癌尚无特效的治疗方法，早期发现、早期诊断盒早期治疗使提高生存率的关键。近年来研究发现：核内不均一核糖核蛋白(heterogeneous ouclearRNA-ribonucleoprotein，HnRNP)A2/B1在早期肺癌与癌前病变中过渡表达，且通过痰检即可检出，这为肺癌的早期发现及诊断提供T可能(史艳霞中国肺癌杂志2001年10月第4卷第5期)。

HnRNP是一种核内的RNA结合蛋白，它是由30个蛋白质小分子构成的复合物，包括A1-U等30多个小分子。其中，A1、A2、B1、B2、C1、C2为主要核心成分，特别是A、B组为基本核心成分(Annu Rey Biochem.1993，62：289-321)。

HnRNP复合体结构类似于核糖体，由HnRNP蛋白和RNA以一定程度的特异性结果方式组成。其功能与RNA的转录、外显子剪接、位点的选择相关。

在研究中通过RNA Northern分析发现，HnRNP A2/B1在正常的支气管上皮细胞中表达水平低，在肺癌细胞中表达水平很高，在正常支气管上皮细胞初级培养物中的表达是受增生控制的，但在SV40转化的支气管上皮细胞和瘤细胞中则不受此控制。这些现象与临床资料吻合，说明HnRNP A2/B1是肺上皮细胞转化癌变的一个早期标记物。HnRNP A2/B1在胚胎肺中有较高表达，但它在成熟组织中的表达是受限制的，其在癌中的表达形式类似于胚肺生长中所见，这种表达形式在蛋白质水平和信号分子水平是一致的，显示HnRNP A2/B1可能是一种癌生长蛋白(Montuenga LM et a1.Am J Respir Cell Mol Biol，1998；19：554)。

综上所述，HnRNP A2/B1与肺癌密切相关，若它调节的正常细胞的转录翻译过程失去正常的控制，会导致癌的发生(史艳霞中国肺癌杂志2001年10月第4卷第5期)。由于HnRNP A2/B1是HnRNP与端粒重复序列结合的主要成分，因此检测HnRNP A2/B1在肺癌组织中的表达，研究它与端粒的相互作用，探讨HnRNP A2/B1表达的意义及其能否作为肺癌早期诊断的标志物，具有十分重要的意义。

最近，亦有HnRNP A2/B1用于非肺癌的其它肿瘤诊断的报道，如用于口腔癌、食管癌等，均取得了较好的效果(Jph J Cancer Res 999，90(12)：1358-1363)。以上结果说明，与端粒酶相似，HnRNP A2/B1是一种组织特异性较差的标志物，它在肿瘤中广泛异常表达，也说明它在肿瘤发生的共同机制中可能起着重要作用。

因此，本领域中迫切需要提供一种针对HnRNP A2/B1的抗体及其药物组合物和复合物。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种与人类癌细胞及组织胞浆中HnRNP A2/B1抗原决定簇特异性结合的小鼠单克隆抗体并获得编码所述抗体之可变区核酸序列。

本发明另一个目的是产生并维持能与人“HnRNP A2/B1”抗原决定簇相结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，以达到所需要的功能特异性。

已知单克隆抗体可被各种不同标记物所标记，以备检测、诊断性分析或治疗应用。在上述各种情况下，标记的单克隆抗体与抗原决定簇部位的结合将成为检定非正常细胞的信号，并可用于治疗。本发明的第三个目的是提供一种新的治疗肿瘤的药物靶点及一种抗人类肿瘤药物组合物，药物组合物结构中存在所述的单克隆抗体及偶联在单抗上的各种效应物质。本发明的特别应用在于将偶联各种效应物质的单克隆抗体用于表达“HnRNP A2/B1”抗原的非正常细胞的诊断和治疗。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种与人类癌细胞及组织胞浆中HnRNP A2/B1抗原决定簇特异性结合的单克隆抗体，其重链可变区具有SEQ IDNO：2中31-35、50-66、99-108位氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：4中24-38、54-60、93-100位氨基酸序列。在一个较佳的实施方案中，该抗体是小鼠抗体。在另一较佳的实施方案中，该单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.0854的杂交瘤细胞产生。在另一较佳的实施方案中，该抗体的重链可变区具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

本发明另一方面提供了一种分离的编码上述抗体的核酸分子。

本发明另一方面提供了一种表达载体，该表达载体含有上述核酸分子以及与该核酸分子操作性相连的表达调控元件。

本发明另一方面提供了一种宿主细胞，它包含上述表达载体。

本发明另一方面提供了一种制备本发明抗体的方法，该方法包括：a)培养权利要求7所述的宿主细胞，使所述抗体表达；和b)分离纯化获得所述抗体。

本发明另一方面提供了一种杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No.0854。

本发明另一方面提供了一种药物组合物，它包含本发明上述的单克隆抗体以及药学上可接受的载体。

本发明另一方面提供了一种抗肿瘤复合物，该复合物含有本发明上述的单克隆抗体以及效应物。在一个较佳的实施方案中，所述效应物选自放射性核素、毒素、化疗药、前药、激素、生物反应调节剂、重组融合蛋白、免疫脂质体。这种抗肿瘤复合物可以对肺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌等癌组织进行针对性治疗。

本发明还涉及本发明的单克隆抗体在制备用于治疗肿瘤的药物以及用于检测肿瘤的试剂盒中的应用。

附图简述

图1显示了免疫组织化学鉴定试验阳性结果照片，其中图1A为肺鳞癌组织，图1B为肺泡癌组织，图1C为肺腺癌组织。

图2显示了腹腔注射标记抗体片段48、72和120小时后的聚集试验断层扫描显象照片，箭头所指为瘤体。

图3显示了杂交瘤细胞CGMCC0854的RT-PCR电泳结果图谱。

具体实施方式

本发明首次获得了对人类非小细胞肺癌等癌组织胞浆内HnRNP A2/B1抗原特异的单克隆抗体(以下简称“HnRNP A2/B1”单克隆抗体)，该抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：2中31-35、50-66、99-108位氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：4中24-38、54-60、93-100位氨基酸序列。对该单克隆抗体进行抗体类型鉴定，该抗体属于IgG1/K链抗体。

本文所用的术语“抗体”包括单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、针对可溶或结合形式被标记的抗体的抗独特型(抗-Id)抗体。术语“抗体”不仅包括完整的分子，还包括其片段，例如Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、和Fv片段等。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本发明还提供了一种编码本发明抗体的分离的核酸分子。在本说明书中，术语“核酸分子”指聚核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，另外还包括核苷酸等效物、核苷酸类似物，单链(有义链或反义链)和双链聚核苷酸及其同源序列。

本发明的“HnRNP A2/B1”单克隆抗体可通过多种方法获得，例如可用本发明提供的保藏号为CGMCC No.0854的杂交瘤细胞产生。也可通过从CGMCC No.0854杂交瘤细胞系中提取mRNA，应用反转录-聚合酶链反应技术从mRNA中扩增出可变区基因，从而获得编码“HnRNP A2/B1”单克隆抗体重链和轻链可变区的核酸序列，进而通过常规的重组方法来获得本发明的抗体。

对与“HnRNP A2/B1”单克隆抗体特性结合的“HnRNP A2/B1抗原”进行分子量测定。采用电泳方法测定并以该抗原的泳动率与具有已知分子量的已知标志蛋白相比较发现分子量约在36千道尔顿。同时完成了“HnRNP A2/B1抗原”和“HnRNP A2/B1”单克隆抗体的特异性鉴定，通过Dot-Blot检测和Western-Blot检测证实两者的特异性结合。

本发明的“HnRNP A2/B1”单克隆抗体经试验证明在癌组织上有明显胞浆内抗原分布，而在正常人组织则没有特异的或阳性的染色谱。该抗体对正常和人肺癌组织的反应活性是通过生物素/抗生素蛋白免疫过氧化物酶测定的。将固定的酶和石蜡包埋的组织、冷冻切片、新鲜肿瘤细胞和细胞系用于证明HnRNPA2/B1的组织分布。将大部分肿瘤细胞具有明显的膜和/或胞浆阳性染色视为用“HnRNP A2/B1”单克隆抗体所作的阳性结果。整个筛选分析过程未见有正常组织标本或正常细胞的特异反应活性。

用“HnRNP A2/B1”抗体试验了104例实体瘤等肿瘤组织(包括肺、结肠、乳腺、胃、前列腺、肾、肝等肿瘤组织)和100例正常组织。所有这些都是经过微波修复处理并用石蜡包埋的组织，结果93％(97/104)的恶性肿瘤组织与“HnRNP A2/B1”单克隆抗体呈阳性反应，即观察到深度胞浆和细胞表面的特异染色。所有阳性染色均只出现于癌细胞上，而所有正常组织则不受影响。有7％呈阴性，这是由于肿瘤的异质性造成的。由于不同肿瘤细胞对“HnRNP A2/B1”抗原表达量的不同，导致用免疫组织化学的方法对“HnRNP A2/B1”抗原低表达量的肿瘤组织切片无法检测。还存在的可能是组织样品制备不好，出现了假阴性结果。

进一步分析是通过标记的“HnRNP A2/B1”单克隆抗体在动物体内的聚集试验完成的。根据“HnRNP A2/B1”单克隆抗体能特异结合“HnRNP A2/B1”抗原的生物学特性，将该单抗与同位素、酶、和荧光化合物等物质进行标记，可用这种标记物易于被检测的原理，达到鉴定目的。即，用探测物质标记的单克隆抗体接种至已成瘤的动物体内，利用“HnRNP A2/B1”单克隆抗体与成瘤的动物体内肿瘤细胞胞浆中“HnRNP A2/B1”抗原的特异性结合作用，大量单克隆抗体在肿瘤组织处聚集，可以通过检测探测标记物质来检测单克隆抗体在成瘤动物体内的聚集情况。结果显示，“HnRNP A2/B1”单克隆抗体在小鼠肺部肿瘤组织处明显聚集。在该方法中，探测物质是用以标记抗体可以是放射性元素，如¹²⁵I、^99mTc、¹⁸⁸Re等。如果对探测物质的检测是在体外进行，则所述的探测物质可以是荧光化合物，如四乙基罗达明、异柳氰酸荧光素等；酶，如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等；化学发光物，如氨基苯二酰肼类、苯酚类化合物、芳基草酸酯类等或电子密集化合物，如胶体金、铁蛋白等。

本发明的“HnRNP A2/B1”单克隆抗体可用于制备检测肿瘤的试剂盒。作为诊断工具，可将“HnRNP A2/B1”单克隆抗体与人类癌细胞的生物学样品相接触，检测生物学样品中由单克隆抗体和癌细胞之间形成的免疫复合物。上述复合物可通过以人类癌肿瘤的那种生物学样品与能够结合HnRNP A2/B1单克隆抗体的第二抗体接触得以检测。所说的第二抗体是用经选择的可检测化合物(指示族，detector group)标记的。第二抗体与对HnRNP A2/B1抗原特异性的单克隆抗体结合时，即可使结合的复合物被检测为带标记的。为了诊断上的应用，所谓的指示基团可选自荧光化合物，酶、放射性元素，或电子密集化合物。适用于这种功能的探测物质包括荧光化合物如荧光素、罗丹明、藻红素、氨腈染料、以及其它能发射荧光的物质。另一类探测物质包括可形成荧光化合物的酶底物产物如N-甲基酮-B-D半乳糖苷酶，或吸收化合物如DAB(二氨基联苯胺)，这一类中尚有其它几种目前最常使用的化合物。电子密集指示族，目前已知的包括金和铁氯化物。虽然这项研究主要用于体外癌症诊断方面，但是也不排除将类似的标记之HnRNP A2/B1抗体用于体内诊断和治疗。

HnRNP A2/B1单克隆抗体可用于检测人类癌肿瘤。在这项应用中，是用可检测信号标记HnRNP A2/B1单克隆抗体，然后注入病人体内，当单克隆抗体与其抗原决定簇结合时便可标记肿瘤。这种可检测的标记包括放射性元素、荧光化合物或其它事宜的可检测标记物或化合物。这一项研究方法同样地适合于对冰冻、固定、或固定并处理(石蜡包埋)的组织上的癌细胞进行体外诊断性检测。另外的体外应用包括对血清、血浆、或其它液体生物学样品如脑脊液、尿和痰中的HnRNP A2/B1抗原，进行放射免疫分析、放射免疫定量测定、酶免疫分析或比浊测定。

本发明的“HnRNP A2/B1”单克隆抗体还可用于制备抗肿瘤药物。例如，将适当的效应物质/毒性剂连接的HnRNP A2/B1单克隆抗体以控制的给药程序注射到病人体内，使所说的单克隆抗体或单克隆抗体-毒性剂结合物与肿瘤结合，以杀伤肿瘤细胞。这样的效应物质/毒性剂可以是放射性核素、毒素、化疗药、前药、激素、生物反应调节剂、重组融合蛋白、免疫脂质体等。放射核素如¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、⁹⁹mTc、¹⁸⁸Re、¹⁸⁶Re等。毒素包括一类须经细胞的内化发挥作用的内化毒素，如微生物毒素中的白喉毒素、假单孢菌外毒素等，植物毒素中的蓖麻毒素、红豆毒素、肥皂草毒素等，另一类是无需内化而直接杀伤细胞膜的毒素，如链球菌溶血素和穿孔素等。化疗药物如烷化剂中的抗瘤氨素、磷酰酰胺，抗代谢中甲氨叠呤、5-氟尿嘧啶，抗生素类阿霉素、表阿霉素等。激素如黑素瘤细胞刺激激素。前药如苯甲酸氢芥的谷氨酸衍生物等，还包括活性酶如碱性磷酸酶、胞嘧啶脱氨酶等。生物调节剂如细胞因子、干扰素、肿瘤坏死因子等。因此，本发明另一方面还提供了一种含有本发明的“HnRNP A2/B1”单克隆抗体和上述效应物质的复合物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1获得单克隆抗体

1)免疫小鼠并获得脾细胞原液

将人肺癌细胞系GLC82，向Balb/C小鼠腹腔注射2000万细胞，并于之后再注射同样数量的细胞加强免疫4次。在最后一次注射24小时后，分离小鼠的脾脏，制备脾细胞原液：在超净台中小鼠剪开腹腔，取出脾脏，置于含有20ml无血清RPMI-1640培养液的平皿中的筛网内。用两个弯头滴管，一个固定脾脏，一个刮压脾脏，挤出脾细胞，制成脾细胞悬液，移入离心管(计数一般2亿以上比较好)，1200rpm离心10分钟。吸去上清，加入10ml无血清RPMI-1640培养基(Hyclone)将细胞悬起，离心1200rpm，10分钟。吸去上清液，加入5ml无血清RPMI-1640培养基将细胞悬起。

2)制备骨髓瘤细胞

本实验用骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14为不表达任何免疫球蛋白重链和轻链的小鼠骨髓瘤系。在小鼠肩膀处注射SP2/0细胞500万/0.5mlPBS/点，成瘤后取瘤细胞于1640培养基中。

3)细胞融合

将制得的脾细胞和骨髓瘤细胞以1∶10的比例混合，960rpm离心8分钟。吸去上清，5秒后准备融合。取出上述混合细胞管，振荡管底，使细胞沉淀散开成糊状。逐滴加入50％PEG(0.7ml)，与PEG充分接触，全部PEG用1分钟时间加完。静置90秒，沿离心管壁流加1640约10ml洗液，不要将细胞冲起。将滴管头插到离心管底，慢慢从离心管底向上搅拌，使细胞悬起，成均匀悬液，960rpm离心8分钟，吸去上清。将融合细胞移入培养液瓶中：沿管壁慢慢加入吸15mlHAT培养液，将细胞搅起，细胞悬液移入HAT培养基培养液大瓶中。充分混匀，然后接种至96孔板，每孔2滴。置37℃5％二氧化碳孵箱培养。

4)杂交瘤细胞的克隆化培养

对杂交瘤的克隆化培养采用有限稀释法，利用这种方法按每孔平均0.5个细胞分布在96孔板，将1.6×10⁵的小鼠巨噬细胞作为喂养细胞加至每一孔中。将这种克隆过程中产生的抗人肺癌细胞抗体的细胞在10％二甲基亚砜，90％的小牛血清中，在液氮进行冷冻保存。

所得杂交瘤细胞株GLC82C238已经于2002年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市海淀区中关村)，保藏号为CGMCCNo.0854。

5)制备大量的单克隆抗体

为了在10-15天后获得含有抗体的腹水，对已经腹腔注射过0.5ml降植烷的小鼠再腹腔注射该杂交瘤细胞。

实施例2单克隆抗体类型的鉴定

对实施例1所得的单克隆抗体类型及亚型进行鉴定。

选用Pierce公司的ImmunoPureMonoclonal antibody isotyping kit检测抗体试剂盒对CGMCC0854杂交瘤细胞培养的上清液进行检测，结果发现所述单克隆抗体属于IgG1/κ链类型。

实施例3免疫组化鉴定试验

将石蜡切片进行常规二甲苯脱蜡、酒精脱水。之后用3％的过氧化氢-甲醇孵育20分钟。PBS缓冲液冲洗，此后于pH6.0柠檬酸缓冲液中微波修复，PBS冲洗。将待检腹水以1∶100；1∶1000；1∶10000三个稀释比例稀释，将稀释好的腹水滴加于切片上。37℃孵育1小时。滴加抗IgG多聚过氧化物酶37℃孵育20分钟后用PBS冲洗。之后采用DAB显色，苏木素复染、透明、中性树胶封片。显微镜下观察，并作出结果判定。并将阳性结果拍照。结果显示在图1中。结果表明，“HnRNP A2/B1”单克隆抗体在癌组织上有明显胞浆内抗原分布，而在正常人组织则没有特异的或阳性的染色。

实施例4聚集鉴定试验

将纯化的“HnRNP A2/B1”单克隆抗体用胃蛋白酶(Sigma P-7000，1∶10000)对获得的HnRNP A2/B1单克隆抗体进行酶切，酶与抗体质量比为1∶10，按体积比9∶1加入1M，pH3.8NaAc的酶切缓冲液，37℃水浴，得到F(ab’)₂片段。将F(ab’)₂片段用氯胺-T法标记I¹²⁵，取CGMCC 0854.IgG F(ab’)₂ 60ug，加NaI¹²⁵3.2mci，过SephodexG25柱去除游离碘分子。体外免疫活性检测其结合率在34％左右。将人肺癌培养细胞以6×10⁶(单位)接种于BALB/c裸鼠(裸鼠年龄在3-4周)右腋下，约7天成瘤，约15天扩增至直径1.0cm以上即可进行实验，实验前24小时使小鼠饮用1％的KI溶液，以封闭其甲状腺。2只荷人肺癌裸鼠分别经腹腔注入碘标抗体片段(100uci/只鼠)。分别在注射后48小时，72小时和120小时用单光子发射计算机x线断层扫描成像术显像。结果显示在图2中。结果表明，“HnRNP A2/B1”单克隆抗体在小鼠肺部肿瘤组织处明显聚集。

实施例5抗体的序列测定

1)杂交瘤中提取mRNA

取10ml杂交瘤细胞CGMCC0854.(约含5×10⁶个)，低速离心机1200rmp离心10分钟。弃去绝大部分上清，将细胞沉淀转移至1.5ml的Eppendorf管，离心去上清。加入1ml Trizol试剂，反复摇匀至细胞完全裂解至基本澄清。室温(25-30℃)静置15分钟，加入0.2ml氯仿，反复摇匀，室温静置10分钟。4℃，12000g离心10分钟。小心吸取上层水相于另一无菌的新Eppendorf管中。于管中加入0.5ml异丙醇，室温沉淀10分钟。4℃，12000g离心10分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇(1ml)洗一遍。7500g，4℃，离心5分钟，弃去乙醇，让沉淀的RNA在室温自然干燥。加10μl无RNase的纯水重悬干燥后的RNA，以备用于cDNA合成或置-70℃长期保存。

2)逆转录

按TakaRa mRNA Selective PCR Kit说明书操作

1.按下列组成在PCR反应系中调制反应液

2×mRNA选择性PCR缓冲液I           25μl

MgCl₂                            10μl

dNTP/类似物化合物                 5μl

RNase抑制剂                       1μl

AMV RTase XL                      1μl

Oligo dT引物                      1μl

样品RNA                           2μl

无RNase dH₂O                     5μl

总量                              50μl

反应条件

30℃  10分钟

42℃  30分钟

5℃   5分钟

反应结束后，cDNA置于-20℃保存。

PCR扩增鼠单克隆抗体的重链及轻链可变区基因片段

反应体系(50μl)

PCR反应体系             用量      终浓度

cDNA模板               4μl       约含50ng模板cDNA

10×缓冲液(含MgCl₂)   5μl       10μmol/L上游引物     1μl

0.5μmol/L

10μmol/L下游引物      1μl       0.5μmol/L

2mmol/L 4dNTPs         5μl       0.2mmol/L

Pfu(或Taq)聚合酶       0.5μl     2.5U/50μl

H₂O                   加至50μL

反应条件(热启动)：94℃热变性5分钟，然后加入Taq DNA聚合酶和Pyrobest聚合酶的混合物(摩尔比4∶1)，进行30个循环：94℃变性1分钟；55℃退火1分钟；72℃延伸2分钟，最后，72℃延伸5分钟。

3)引物设计

扩增重链可变区的上游引物为：

5’ATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT 3’(SEQ ID NO：5)

下游引物为：

5’A(TC)CTCCACACACAGG(AG)(AG)CCAGTGGATAGAC 3’(SEQ ID NO：6)

用该引物可以扩增出450bp左右的重链可变区基因片段(见图3泳道1)

扩增轻链可变区的上游引物为：

5’ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 3’(SEQ ID NO：7)

下游引物：

5’GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTT 3’(SEQ ID NO：8)

用该引物可以扩增出400bp左右的轻链可变区基因片段(见图3泳道6)。

4)DNA片段的回收和纯化

按Qiagen试剂盒说明操作，回收DNA片段。

DNA片段的连接与转化按TaKaRa公司的DNA Ligation Kit操作进行。

5)连接产物的转化

(1)感受态细胞的制备：接种一个单菌落于20ml培养液中，于37℃摇床培养过夜8小时(200r/分钟)，往一个500ml的烧瓶中加入100ml LB培养液，再加入1ml过夜培养液，于37℃摇床(200r/分钟)培养至OD600为0.4左右，细菌生长处于对数早期或中期。将培养液分装到4个50ml预冷无菌的聚丙烯离心管管中，于冰上放置10分钟，4℃，1600g离心10分钟。弃上清，倒置离心管一分钟，分别加入5ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬其中的两管，将悬液倒入另两管，将悬液共10ml合并到一管，冰上放置20分钟，于4℃，1200g离心10分钟。弃上清，用3ml冰冷的CaCl₂溶液重悬，加入80％的甘油至甘油终浓度为12％。于每预冷的Eppendorf管中100μl分装，保存于-70℃冰箱。

(2)转化：取连接产物10μl加至含100μl感受态细胞的1.5ml的Eppendorf中，混匀，置冰上20分钟，42℃热休克90秒，迅速放回冰中，冷却1～2分钟，加入450μl LB，置摇床37℃，150r/分钟摇30分钟，然后取200μl转化混合物涂于含抗菌素的培养皿中，倒置培养皿于37℃培养12～16小时。

6)序列测定：

对抗体进行序列测定，其重链可变区DNA序列如SEQ ID NO：1所示，该DNA序列编码SEQ ID NO：2所示的重链可变区，其中CDR位于SEQ ID NO：2中31-35、50-66、99-108位。抗体轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO：3所示，其编码SEQID NO：4所示的轻链可变区，其中CDR位于SEQ ID NO：4中24-38、54-60、93-100位的氨基酸序列。

实施例6抗原鉴定试验

将纯化的抗原进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将目的条带割胶回收。用胰蛋白酶切割对胶上蛋白于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂，断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测定，这一技术能够完成的肽质量可精确到0.1个分子量单位，所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相匹配，找到匹配肽段，根据匹配情况，从而最终鉴定出目的蛋白。用质谱鉴定的方法分析得到蛋白的分子量为35984道尔顿，等电点为8.67。

实施例7 ¹³¹I标记的HnRNP A2/B1单克隆抗体药效学试验

1)建立荷瘤Balb/c裸鼠并分组

选择3-4周龄的Balb/c裸鼠100只，于其每只右下肢根部皮下注射人肺癌细胞系GLC82细胞6×10⁶个细胞/只，待肿瘤直径长至10mm时，挑选肿瘤大小一致的小鼠随机分为6组，每组8只。

具体分组：

(1)空白对照组：生理盐水或PBS溶液

(2)¹³¹I给药组

(3)HnRNP A2/B1单克隆抗体给药组

(4)¹³¹I标记HnRNP A2/B1单克隆抗体低剂量给药组100uCi；1次注射

(5)¹³¹I标记HnRNP A2/B1单克隆抗体中剂量给药组200uCi；1次注射

(6)¹³¹I标记HnRNP A2/B1单克隆抗体高剂量给药组500uCi；1次注射

2)观察及给药方法

给药前称体重，测瘤体积。采用尾静脉注射方式给药；从给药之日起每天观察裸鼠体重和瘤体积变化。用游标卡尺测量肿瘤的三维直径(d)，由公式V＝(长径+短径2)/2。于第30天活杀鼠，称瘤重。

3)疗效评估

计算：瘤体抑制率＝(1-实验组净增体积/对照组净增体积)×100％

      瘤重抑制率＝(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％

4)病理组织学观察

用福尔马林液固定肿瘤组织(取肿瘤组织，用纱布包裹，侵入福尔马林液)，石蜡常规包埋、切片、HE染色，普通光学显微镜下观察肿瘤细胞学形态及肿瘤组织有无坏死及坏死程度。观察心、肝、肾、肺、脾、胃、脑、肌肉、肠各种组织细胞学形态变化。

5)药效试验结果

空白对照组、¹³¹I给药组和HnRNP A2/B1单克隆抗体给药组这三组见肿瘤体积无明显差异(P＞0.05)，¹³¹I标记HnRNP A2/B1单克隆抗体治疗组中肿瘤的生长明显受到抑制，与三个对照组比较存在显著性差异(P＜0.001)。三个由低到高剂量组的抑瘤率分别为40％、65％、85％。光学显微镜下各治疗组均可见肿瘤组织内有灶状坏死，肿瘤坏死现象以中、高剂量治疗组最为明显，呈广泛大片坏死。电子显微镜下见各对照组的肿瘤细胞结构基本正常，而各治疗组可见到较多的变性、坏死的肿瘤细胞。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

                          序列表

<110>上海我武生物技术有限公司

<120>抗HnRNP A2/B1抗原的单克隆抗体，其制备方法及应用

<130>030923

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>351

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>1

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact    120

ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtagtta ctcctactat    180

ccagacaata tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac    240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt tttactgtgc aagacaggag    300

gactggtact tcgatatctg gggcgcaggg accacggtca ccgtctcctc a             351

<210>2

<211>117

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Asn Met

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Gln Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Ala Gly Thr Thr

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>3

<211>333

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>3

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttggctgtat ctctggggca gagggccacc     60

atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggtac    120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctacaatct    180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat    240

cctgtggagg aggagaatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga gctgtacacg    300

ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa cgg                                 333

<210>4

<211>111

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>4

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

            20                  25                  30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

        35                  40                  45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ala

    50                  55                  60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65                  70                  75                  80

Pro Val Glu Glu Glu Asn Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

                85                  90                  95

Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

            100                 105                 110

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

atgracttcg ggytgagctk ggtttt                                        26

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

ayctccacac acaggrrcca gtggatagac                                    30

<210>7

<211>25

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<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

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<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

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