光肩星天牛的PCR鉴定方法

摘要

本发明涉及一种林木蛀干害虫光肩星天牛的PCR鉴定方法，测定光肩星天牛的线粒体DNA CO I基因序列，包含保守与变异序列，利用DNA SIS软件对这些DNA序列进行比较，根据光肩星天牛特有的一段保守序列设计特异引物：上游引物5′TATAAGATTTTGATTACTCCCG 3 ′下游引物5′CGATCTGTTAAAAGTATAGTA 3′提取虫样的DNA进行PCR扩增，取扩增产物采用1.3～1.5％的琼脂糖凝胶，在70～100V下电泳20～40分钟，紫外灯下检测，如存在分子量为341 bp DNA条带，则确定所检昆虫为光肩星天牛。本方法对在口岸木材及货物木质包装检疫中截获的光肩星天牛进行快速、有效地鉴定。

说明书

(技术领域)

本发明涉及林木蛀干害虫光肩星天牛的PCR鉴定方法，属于生物技术领域。主要用于出入境原木、木质包装检疫及林间检测中对光肩星天牛(包括卵、幼虫、蛹、成虫各虫态)的高灵敏快速鉴定。

(背景技术)

光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)和黄斑星天牛(Anoplophora nobilis)是林木的重要蛀干害虫，在我国广泛分布，可危害杨、柳、榆、槭等20余种树木，主要以幼虫蛀食韧皮部和边材，并在木质部内蛀成不规则坑道，形成永久性的空洞和缺失，不但有损木材材质的工艺价值，还严重阻碍树木中养分和水分的输送，影响树木的正常生长并使林木抗病能力减弱，容易产生风折木，严重时可使树木枯死。我国跨越13省、市、自治区的“三北”防护林工程，以杨树为主要造林树种，但近十几年来，杨树天牛灾害越来越突出，特别是光肩星天牛和黄斑星天牛，在局部地区，内蒙古的呼市、包头、乌海市以及伊盟等地泛滥成灾，青海省的西宁市于1992年首次发现黄斑星天牛危害后，1994年又在互助、民和、湟中和共和5县相继发生该虫危害，对林业发展造成严重危害。

美国1996年在纽约，1998年在芝加哥发现光肩星天牛的野外定殖和严重危害，美方及时进行了有害生物的风险评估，认为该虫在美国喜食树种多(如槭树)并在林分中所占比例大，自然控制力弱，在危害初期不易被发现，因此对其根治和防治较困难。因而认为光肩星天牛对美国的森林，庭院树木，旅游和槭糖业等方面潜在威胁巨大。

美国原无星天牛属的分布，但从中国输美的货物实木包装材料(SWPM)中多次截获了光肩星天牛。从美方提供的资料看，1985-1988年美国检疫部门从中国输美货物上截获354批次天牛，其中：2批次鉴定为光肩星天牛，21批次鉴定为星天牛属Anoplophora。美方认为，因为天牛幼虫的鉴定较为困难，加上星天牛属Anoplophora在美国原无分布，鉴定资料较缺，故定为星天牛属Anoplophora的21批次中，很多有可能就是光肩星天牛，即使原来鉴定的沟脛天牛亚科(Lamiinae)或天牛科的截获物(天牛幼虫)也有可能是光肩星天牛；同时在11个州的仓库，从来自中国的货物(SWPM)中发现了光肩星天牛成虫和鉴定为星天牛属Anoplophora的幼虫。据此美国方面于1998年9月发布临时法案，要求对中国输美货物的木包装材料采取超常的检疫处理措施，即熏蒸，加热和防腐剂这三种特殊处理。这一规定的实施对我国输美一半的货物产生影响，从而严重影响我国对美国的出口贸易，引起我国政府的高度重视。

由于星天牛属幼虫的形态特征非常相似，利用常规的形态分类鉴定十分困难，目前迫切需要尽快建立一套快速灵敏的鉴定检测方法，以确保中美贸易的正常发展。

近年来，利用PCR扩增生物体基因某一特异分子片段进行有害生物的检测、鉴定及病虫害诊断的方法为国际上广泛使用。由于这种方法快速、准确和简便的特点，越来越受到各国植物保护学家的重视。但迄今为止，关于光肩星天牛的分子鉴定技术国内外尚未见报道。

(发明内容)

本发明的目的是针对常规的形态方法难以进行星天牛属幼虫的分类鉴定的技术难题，提供光肩星天牛的PCR鉴定方法，以便对光肩星天牛作出准确、快速的鉴定。需要特别说明的是，经研究认为，光肩星天牛和黄斑星天牛尚未达到种级分类水平，应归为同一种下的不同型，因此，本发明PCR鉴定方法同时适用于光肩星天牛和黄斑星天牛(以下统称为光肩星天牛)。

本发明PCR鉴定方法首先用通用引物扩增、测定了不同地理种源的光肩星天牛及其近缘种的线粒体DNA CO I基因序列(另附)，利用DNA SIS软件对这些DNA序列进行比较，根据光肩星天牛特有的一段保守序列设计特异引物如下：

上游引物  5′TATAAGATTTTGATTACTCCCG 3′

下游引物  5′CGATCTGTTAAAAGTATAGTA 3′

然后按下步骤操作：

①提取虫样的DNA：

样品为幼虫时，从腹面剖开虫体，剥掉消化道，用0.9％的生理盐水洗净虫体，剪碎；样品为成虫时，剖开虫体，取胸部肌肉剪碎。

取0.1～0.2g虫样到玻璃匀浆器中，加入1mL SDS消化液(20mmol/L Tris-Cl，pH7.4；20mmol/L EDTA，pH8.0；0.5％SDS)，充分匀浆，将混合液移入小塑料管内，加30μL 20mg/mL的蛋白酶K，摇匀，在50～55℃的水浴锅中消化过夜；

消化后样品经12000r/m离心5～10分钟，取上清；

加入酚和氯仿异戊醇各0.5mL，充分摇匀，12000r/m离心10分钟，取上清，并重复此步骤一次；

加入1mL的氯仿异戊醇，摇匀，12000r/m离心10分钟，取上清；

加入相当于上清2倍体积的无水乙醇及0.1倍体积的醋酸钠，摇匀，-20℃下至少静置2小时，使DNA沉淀；

12000r/m离心10分钟，倒掉水相，沉淀物用300μL 70％乙醇进行漂洗，12000r/m再离心10分钟，倒掉乙醇，风干；

将风干沉淀物溶于50μL双蒸水或1×TE中，置于50～60℃水浴3～5分钟；后于-20℃冰箱中存贮，用于PCR扩增。

②PCR检测：

每次PCR检测的反应体系总体积为50μL，包括：31μL双蒸水；2.5μL二甲亚砜；5μL 10×Buffer；4μL MgCl₂；4μL dNTP；上、下游引物各1μL；1μL DNA及0.5μL Taq酶。

PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；后进行35个循环：94℃变性30秒，57℃退火1分钟，72℃延伸1分30秒；最后72℃再延伸7分钟。

取扩增产物8μL，采用1.3～1.5％的琼脂糖凝胶在电压70～100V下电泳约20～40分钟后，在紫外灯下检测，如果存在分子量约为341bp的DNA条带，则确定所检昆虫为光肩星天牛。

本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：

(1)本方法在林木及木材检疫中能快速、有效地鉴定出幼虫态的光肩星天牛。

(2)本发明根据发明人所测的不同地理种源光肩星天牛及其近缘种的线粒体DNA CO I基因序列，利用DNA SIS软件对这些DNA序列进行比较，根据光肩星天牛特有的一段保守序列设计特异引物。利用设计的特异性引物进行扩增比较，为光肩星天牛的鉴定提供了很好的靶位，检测准确性高；

(3)本方法只需0.1～0.2g昆虫样品提取DNA，而PCR扩增时更是只需25ng/μL的DNA即可进行有效的检测鉴定，其PCR扩增的灵敏度较高。

(附图说明)

图1 PCR检测鉴定光肩星天牛及其近似种的电泳图。

图2 PCR检测鉴定送检虫样的扩增产物的电泳图。

图1表示，1～9泳道为不同地理种源的光肩星天牛或黄斑星天牛，10～15泳道为其它近似种。

各泳道表示的天牛种类或地理种群、具体如下：

1：光肩星天牛(甘肃)Anoplophora glabripennis；

2：光肩星天牛(宁夏)A.glabripennis；

3：光肩星天牛(河北)A.glabripennis；

4：光肩星天牛(内蒙古)A.glabripennis；

5：光肩星天牛(纽约)A.glabripennis；

6：光肩星天牛(芝加哥)A.glabripennis；

7：光肩星天牛(浙江)A.glabripennis；

8：黄斑星天牛(甘肃)A.nobilis；

9：黄斑星天牛(河北)A.nobilis；

10：星天牛(福建)A.chinensis；

11：星天牛(江苏)A.chinensis；

12：四川星天牛(重庆)A.freyi；

13：楝星天牛Anoplophora horsfieldi

14：松墨天牛Monochamus alternatus；

15：云斑天牛Batocera horsfieldi

图2中，1～5泳道为送检虫样；6泳道为光肩星天牛(河北)阳性对照；7泳道为星天牛(江苏)阴性对照。

(具体实施方式)

实施例：对港口送检的五个幼虫样品的鉴定

设计光肩星天牛的特异引物序列：

上游引物：5′TATAAGATTTTGATTACTCCCG 3′

下游引物：5′CGATCTGTTAAAAGTATAGTA 3′

准备鉴定试剂盒包括：2mL双蒸水；1mL二甲亚砜溶液(分析纯)；1mL装10×Buffer(100mM Tris-HCl，500mM KCl)；1mL装25mM的MgCl₂；1mL装2.5mM的dNTP；250μL装约20pmol/μL的上、下游引物(0.5OD)；500单位装的Taq DNA聚合酶。

分别对各样品按以下步骤鉴定：

1)提取虫样的DNA：

样品为幼虫时从腹面剖开虫体，剥掉消化道，用0.9％的生理盐水洗净虫体，剪碎；取0.1～0.2g样品到玻璃匀浆器中，加入1mL SDS消化液(20mmol/L Tris-Cl，pH7.4；20mmol/L EDTA，pH8.0；0.5％SDS)，充分匀浆，将混合液移入小塑料管内，加30μL 20mg/mL的蛋白酶K，摇匀，在50～55℃的水浴锅中消化过夜；

水浴消化后，12000r/m离心5～10分钟，取上清；

加入酚和氯仿异戊醇各0.5mL，充分摇匀，12000r/m离心10分钟，取上清，并重复此步骤一次；

加入1mL的氯仿异戊醇，摇匀，离心(12000r/m)10分钟，取上清；

加入相当于上清液2倍体积的无水乙醇(约1mL)及0.1倍体积的醋酸钠(约50μL)，轻轻摇匀，置于-20℃冰箱中至少沉淀DNA 2小时；

沉淀后，离心(12000r/m)10分钟，倒掉水相，每管加入300μL70％乙醇进行漂洗，再离心(12000r/m)10分钟，倒掉乙醇，然后让其自然风干或置于35℃左右的烘箱中烘干；

将沉淀物溶于50μL 1×TE(pH8.0)或双蒸水中，置于50～60℃水浴3～5分钟；于-20℃冰箱中存贮，用于PCR扩增。

2)  光肩星天牛的PCR检测：

每次PCR检测的反应体系总体积为50μL，包括：31μL双蒸水；2.5μL二甲亚砜；5μL 10×Buffer；4μL MgCl₂；4μL dNTP；上、下游引物各1μL；1μL DNA及0.5μL Taq酶。

PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；后进行35个循环：94℃变性30秒，57℃退火1分钟，72℃延伸1分30秒；最后72℃再延伸7分钟。

3)扩增产物的电泳检测：取8μL扩增产物，采用1.3～1.5％的琼脂糖凝胶，在电压70～100V下电泳20～40分钟后在紫外灯下检测，电泳图如图2。从图2可见，2、5道存在分子量为341bp的DNA条带，则证明所检昆虫为光肩星天牛。

经PCR检测鉴定实验，确定2、5道虫样为光肩星天牛，其余3个不是。

不同地理来源的光肩星天牛及其近缘种的线粒体DNA CO I序列

1、星天牛(采集地：安徽)Anoplophora chinensis

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2、星天牛(采集地：福建)Anoplophora chinensis

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3、星天牛(采集地：广东)Anoplophora chinensis

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4、星天牛(采集地：河南)Anoplophora chinensis

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5、四川星天牛Anoplophora freyi

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6、楝星天牛Anoplophora horsfieldi

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7、光肩星天牛(采集地：安徽)Anoplophora glabripennis

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8、光肩星天牛(采集地：美国芝加哥)Anoplophora glabripennis

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9、光肩星天牛(采集地：甘肃)Anoplophora glabripennis

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10、光肩星天牛(采集地：河北)Anoplophora glabripennis

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11、光肩星天牛(采集地：湖北)[1号标本]Anoplophora glabripennis

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12、光肩星天牛(采集地：湖北)[2号标本]Anoplophora glabripennis

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13、光肩星天牛(采集地：内蒙古)Anoplophora glabripennis

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14、光肩星天牛(采集地：宁夏)Anoplophora glabripennis

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15、光肩星天牛(采集地：美国纽约)Anoplophora glabripennis

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16、光肩星天牛(采集地：山东青岛)Anoplophora glabripennis

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17、光肩星天牛(采集地：西安)Anoplophora glabripennis

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18、光肩星天牛(采集地：美国新泽西州)Anoplophora glabripennis

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19、光肩星天牛(采集地：浙江)Anoplophora glabripennis

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20、光肩星天牛(采集地：韩国)Anoplophora glabripennis

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21、黄斑星天牛(采集地：甘肃)Anoplophora nobilis

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22、黄斑星天牛(采集地：河北)Anoplophora nobilis

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23、黄斑星天牛(采集地：宁夏)[1号标本]Anoplophora nobilis

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24、黄斑星天牛(采集地：宁夏)[2号标本]Anoplophora nobilis

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说明：以上光肩星天牛和黄斑星天牛序列中的黑体部分，即为本专利设计发明

      的用于鉴定光肩星天牛(包括黄斑星天牛)的特异引物序列。