大额牛精液低温冷冻保存方法

摘要

本发明涉及一种大额牛精液低温冷冻保存方法，属生物技术领域。本发明利用滴冻法对大额牛精液进行冷冻保存。冷冻液的配方为卵黄15％－20％v/v、甘油3％－6％v/v、乳糖1.0M－1.5M和蔗糖1.0M－1.5M；防冻液与精液稀释比例为1∶10、稀释后的精液放置在室温下平衡1小时，再转移到4℃冰箱中平衡3小时；冷冻精液的品质判定指标为：解冻复速率不低于70％；精子体外存活时间在解冻后放入37℃、5％CO2培养箱中进行培养1小时后，运动度不小于30％；金黄地鼠裸卵穿透率不低于38％；精液在50mOsm/kg的低渗溶液中，38℃的5％CO2培养相中培养1小时，精子肿胀率不低于39％。本发明具有实用且效果可靠，提供的大额牛冷冻精液品质的评定方法和判定指标科学、规范等优点。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种大额牛精液低温冷冻保存方法，属生物技术领域。

背景技术：

精液的冷冻保存在现代畜牧业中起着十分重要的作用。使用冷冻精液可以不受时间、地域和种畜寿命的限制，减少公畜饲养数量，降低生产成本，提高优良畜种的利用率，为畜牧业生产带来巨大的经济效益。同时，精液的冷冻和冷冻精液的使用在畜种引进、血缘更新、疾病控制、濒危品种以及遗传多样性保护上都有极其重要的意义。

大额牛(Bos frontalis)是一种半野生、半家养的世界珍贵动物品种，具有耐粗饲、抗逆性强、肉质细嫩等特点，是一种有待开发、极有推广前景的品种。由于无计划宰杀，数量锐减，濒于灭绝，1997年被农业部列为国家重点保护品种。

大额牛由于发现较晚，有关研究还只见于细胞核型、起源和进化以及遗传多样性等方面。发明者将本发明的方法和结果在相关文献数据库中进行搜索比较，未发现有任何相同记载。

发明内容：

本发明的目的是基于前人的基础研究，提供一种适合大额牛精液低温冷冻保存及冷冻精液的品质评定指标，为物种保护和合理利用提供有益的技术。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

一、大额牛精液的低温冷冻保存

1)精液的采集和常规检查：按奶牛的现有方法进行。

2)防冻液配置：卵黄15％-20％(v/v)，甘油3％-6％(v/v)，乳糖1.0M-1.5M，蔗糖1.0M-1.5M。按量称取乳糖和蔗糖，溶于60-70毫升超纯水中。取新鲜鸡蛋，用75％乙醇消毒蛋壳，去掉蛋清，把包有完整卵黄膜的卵黄放在干净的滤纸上，用滤纸吸干卵黄膜上的蛋清，持干净注射器刺破卵黄膜，抽取卵黄，按所需用量把卵黄加入糖溶液中，拌匀，再用双层纱布过滤一次，取滤液，10000g离心20分钟。取上清液加青霉素100IU/ml，硫酸链霉素100μg/ml，按量加入甘油。定容，置低温冰箱中保存。

3)精液的稀释：将防冻液预热到37℃，按1∶10稀释(防冻液∶精液)。稀释后的精液放置在室温下平衡1小时，再转移到4℃冰箱中平衡3小时。

4)精液的冷冻和保存：冷冻采用滴冻法。在干冰上或在预冷到-80℃左右的铜板上进行。每滴约0.2ml，滴在干冰上或铜板上的精液滴几分钟内便可硬化，表面变光亮，5-7分钟后立刻转移到液氮中，冷冻的精液做好标记，放入液氮中保存。

5)冷冻精液的解冻：取1mlPBS解冻液放入试管内，预热至37℃，取一颗冷冻精液放入试管中复苏，轻轻摇匀。

二、冷冻精液的品质评定方法和判定指标

1)精子解冻复速率：解冻后检查活精子数，复速率不低于70％。

2)精子体外存活时间：精液解冻后放入37℃、5％CO₂培养箱中进行培养1小时后，运动度不小于30％。

3)黄地鼠裸卵穿透检测(SPA)：金黄地鼠经过超排、裸卵制备，精子经过获能、穿透培养。精卵共培3-5小时后固定，观察穿透率。穿透率不应低于38％。穿透率的计算为穿透率(％)＝被穿透的裸卵数/裸卵总数)×100％。

4)精子低渗肿胀试验(HOS test)：精液在50mOsm/kg的低渗溶液中，38℃的5％CO₂培养相中培养1小时，精子肿胀率不低于39％。精子肿胀率(％)＝(起肿胀反应的精子数/总精子数)×100％。

本发明的大额牛精液冷冻保存方法具有实用且效果可靠，提供的大额牛冷冻精液品质的评定方法和判定指标科学、规范等优点。

具体实施方式：

实施例一：

大额牛精液低温冷冻保存方法，经精液的采集、检查、防冻液配置、精液的稀释、精液的冷冻和保存、冷冻精液的解冻、冷冻精液的品质评定等步骤完成。部分步骤同现有技术。不同之处为：

1、液的配方为卵黄15％v/v，甘油3％v/v，乳糖1.0M，蔗糖1.0M，其余超纯水为60毫升；

2、精液的稀释为将冷冻液预热到37℃，按防冻液：精液稀释为1∶10进行稀释，稀释后的精液放置在室温下平衡1小时，再转移到4℃冰箱中平衡3小时；

3、精液的冷冻采用滴冻法，即在干冰上或在预冷到-80℃的铜板上滴0.2m的精液，当滴在干冰上或铜板上的精液滴硬化且表面变光亮5分钟后，放入液氮中保存；

4、冷冻精液的品质判定指标为：解冻复速率不低于70％；精子体外存活时间在解冻后放入37℃、5％CO₂培养箱中进行培养1小时后，运动度不小于30％；金黄地鼠裸卵穿透率不低于38％；精液在50mOsm/kg的低渗溶液中，38℃的5％CO₂培养相中培养1小时，精子肿胀率不低于39％。

实施例二：

基本同实施例一。不同之处为：

1、冻液的配方为卵黄17.5％v/v，甘油4.5％v/v，乳糖1.25M，蔗糖1.25M，超纯水为65毫升；

2、当滴在干冰上或铜板上的精液滴硬化且表面变光亮6分钟后，放入液氮中保存。

实施例三：

基本同实施例一。不同之处为：

1、冻液的配方为卵黄20％v/v，甘油6％v/v，乳糖1.5M，蔗糖1.5M，超纯水70毫升；

2、当滴在干冰上或铜板上的精液滴硬化且表面变光亮5-7分钟后，放入液氮中保存；