日本落叶松微体繁殖的根诱导方法

摘要

本发明涉及一种日本落叶松微体繁殖根诱导方法。即选择日本落叶松无性系的1年生材料，经茎诱导完成后，采用生根培养基，以变温培养和继代繁殖相结合的方法，实现根器官的再生，步骤：1)材料的采集及预处理：水培两周，水温为常温；2)制备改良MS培养基；3)接种腋芽：将水培后芽苞发亮的枝条流水洗涤，剪下腋芽，消毒后通过无菌操作接种于茎诱导培养基中，完成不定茎的伸长生长阶段；4)诱导生根：制备生根培养基，再将所述不定茎转接于生根培养基中，进入根生长阶段；5)变温处理及继代培养：将步骤4)所述不定茎置于变温条件下，进行继代培养，完成根器官的再生。本发明能够加快日本落叶松优良种质材料的繁殖速度和种群数量扩增。

说明书

技术领域

本发明涉及林业科学中林木繁殖及植株再生技术，具体地说是一种日本落叶松微体繁殖的根诱导方法。

背景技术

落叶松属松科(Pinaceae)中的落叶松亚科(Laricodeae)，本属种质资源丰富，据资料报道，全世界共有落叶松25个种及若干变种、杂种，其中17种分布在我国(文献1：王战(主编)，张颂云(副主编)，1992，中国落叶松林，北京：中国林业出版社，pp1-3)。它们分布广，遍及北半球的亚热带山区、温带山区及寒温带平原地区。落叶松具有适应性强、生长速度快、成林早、抗病虫害以及木材强度高、耐腐性强等优良品质，在工业上有广泛的用途并能作为重要的造纸原料。由于落叶松的上述特性，可作为大面积造林树种。

日本落叶松(Larix Kaempferi(Lamb)Carr.)原产于日本本州岛中部，迄今已在世界许多国家有了引种栽培，我国最早引种日本落叶松是在1884年，少量种植于青岛崂山。历经百年，引种范围已经扩大到北起黑龙江林口，南至湖南安化，东从青岛崂山，西至新疆哈密，但栽培区域主要集中在辽、吉、鲁、鄂、川、陕、甘等省。70年代和80年代进行的两次落叶松种间对比和日本落叶松种源联合实验表明，在我国降雨量500mm以上的温带山区和亚热带中高山区，日本落叶松同其他同属种相比，如长白落叶松(L.olgensis Henry)、华北落叶松(L.principis-rupprechtii Mayr.)、兴安落叶松(L.gmelini Rupr.)等，具有较大的生长优势(文献2：马常耕，王建华，1992，我国发展日本落叶松问题的探讨，落叶松种和种源的选择，北京：北京农业大学出版社，pp22-29)。但是由于日本落叶松种子年稀少，结实量少，种子不宜采集和发芽率低等弱点，利用天然的种子远远不能满足生产的需要，因此，人们对其进行了一系列的改良工作。国内日本落叶松的育种工作始于20世纪60年代，基本上经历了种和种源选择试验阶段、种子园阶段和无性系阶段，现已选育出一批具有优良性状的植株，但由于个体数量少，利用其它繁殖手段不能稳定地提供大量的优质种苗，所以难于满足商品林业的需要。

微体繁殖作为现代生物技术的一个重要组成部分，具有速度快、周期短、不受季节影响、后代稳定性高的特点，现已取得了显著成绩，并在农业、林业、医药、遗传育种等方面得到广泛应用。落叶松微体繁殖主要集中于欧洲落叶松(L.decidua Mill.)和欧日杂种落叶松(L.×eurolepis)两个树种上，如：Bonga(文献3：J.M.Bonga，1982，Shoot formation in callusfrom the stalks of young female strobili of Larix deciduas，Can.J.Bot.，60(8)：1357-1359)从欧洲落叶松雌球果部分经愈伤组织形成枝，从幼嫩组织中形成不定芽；最重大的突破是Nagimani(文献4：R.Nagmani；J.M.Bonga，1985，Embryo in subcultured callus of Larix deciduas.Can.J.For.Res.，15(6)：1088-1091)利用雌配子体诱导形成的欧洲落叶松再生植株，Laliberte和Lalonde(文献5：A.Laliberte；M.Lalonde，1988，Sustained caulogenesis incallus cultures of Larix ×eurolepis initiated from short shoot buds of a12-year-old tree，Am.J.Bot.，75(6)：767-777)培养的杂种落叶松再生植株，以及Klimaszewska(文献6：K.Klimaszewska，1989，Recovery of somaticembryos and plantlets from protoplast cultures of Larix ×eurolepis，Plant CellReports，8(8)：440-444)得到的落叶松属中第一个体胚再生植株--杂种落叶松未成熟合子胚的再生植株。上世纪90年代，Ewald(文献7：D.Ewald，1998，Advances in tissue culture of adult larch，Vitro Cellular andDevelopmental Biology Plant，34(4)：325-330)等在成树的微体繁殖如诱导生根等问题上取得了突破性进展，发现材料在无激素的培养基上连续继代，或微嫁接，可使成年材料恢复幼年性状。迄今，虽然已经在欧洲落叶松的幼树微体繁殖中建立了持续微体繁殖体系，但它们或者繁殖率低，如Itahana利用了日本落叶松的顶芽(文献8：N.Itahana，1995，Manual for budculture of Japanese larch，Bulletin of the National Forest Tree Breeding Center，13：145-149)，而每个枝条仅有1个顶芽；或者仅注重科学问题，如Klimaszewska利用杂种落叶松进行的原生质体途径再生植株的试验(见文献6)，因此距离生产应用尚有相当距离。目前在我国，对日本落叶松的微体繁殖还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于通过腋芽增殖和不经过愈伤组织的器官发生途径，提供一种日本落叶松微体繁殖的根诱导方法，本发明的方法能够加快优良种植材料的繁殖速度，满足商品林业生产对优良苗木的数量需求。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：选择日本落叶松无性系的1年生材料，经茎诱导完成后，采用生根培养基，以变温培养和继代繁殖相结合的方法，实现根器官的再生，具体可按如下步骤操作：

1)材料的采集及预处理：

选取日本落叶松无性系的1年生枝条，采集时间为冬末至初春间芽苞萌动时、萌动前或萌动后，水培两周，水温为常温；

2)微体繁殖培养基的制备：

(1)用常规方法制备改良MS培养基；

(2)分装、高压蒸汽灭菌，冷却后备用；

3)接种腋芽：

将水培后芽苞发亮的枝条流水洗涤，剪下腋芽，在无菌条件下灭菌接种于茎诱导培养基中，完成不定茎的伸长生长阶段；

4)诱导生根：制备生根培养基，在所述改良MS培养基中加入植物生长调节物质和/或促进物，加入浓度分别为：植物生长调节物质0～1.5mg/l，促进物1.0～10.0g/l，再将步骤3)所述不定茎转接于生根培养基中，进入根生长阶段；

5)变温处理及继代培养：

将步骤4)所述不定茎置于恒温暗光下培养3～5天，然后以光强2000～3000Lux，变温培养5～20周；变温培养的同时对诱导伸长的茎进行继代培养，每次转代时切去底部褐化部分，完成根器官的再生；

其中：所述步骤3)中剪下的腋芽尺寸为0.5～1cm；所述冬末至初春间芽苞萌动时、萌动前或萌动后枝条为芽苞苞鳞由无光泽的暗棕或暗褐色转变为有光泽的淡棕或淡褐色的枝条；所述植物生长调节物质为玉米素(Zea)0.01～0.1mg/l、萘乙酸(NAA)0～0.6mg/l和/或吲哚丁酸(IBA)0～0.8mg/l；所述促进物为AC；所述变温培养是指昼间培养温度在22～28℃，夜间培养温度在15～18℃范围内，所述变温培养过程中的光暗周期为14～20/4～10小时；所述继代繁殖次数可为1～10次，每次继代时间可为7～40天；所述继代操作重复步骤4)、5)；所述恒温培养温度为25～28℃。

本发明具有如下优点：

1.微体繁殖速度快。由生物学特性所决定，落叶松苗木经过13～15年的营养生长期才能进入开花结实的生殖生长阶段，其后代的优良性状还需不少于1/3生命史(30～40年)的时间方可表现出来，并作出选择(约需8～12年)，但此时植株的无性繁殖能力已显著下降，常规的扦插繁殖技术尚未有效解决恢复生根能力的问题。本发明通过继代培养的方法促进了成龄材料恢复幼年生长特性，是提高组织生根率的一条十分有效的途径，其与自然状态下采取种子繁殖或扦插繁殖的常规方法相比，利用本发明的方法，可使优良苗木种群的实现周期可缩短一半以上。

2.微体繁殖繁殖效率高。与现有技术仅利用顶芽进行繁殖相比，本发明利用了母树1年生枝条上的大量腋芽，可繁育出大量子代幼苗，在技术成熟条件下，以80m²的小型实验室配合必要育苗设施为例，可年产20万株以上，并且繁殖过程可不受自然季节影响(需人工设施条件保障)。

3.完善了日本落叶松遗传改良的技术路线。经过多年实践，日本落叶松已确立了“有性创造、无性利用”的遗传改良路线，但选择育种、杂交育种仅能获得的少量优良种苗，采用本发明能够充分利用少量的优良种苗，通过快速增殖培养过程，形成大批量的无性繁殖材料，从而完善了日本落叶松良种化进程中的一个主要技术环节，满足了商品林业生产上对优良苗木的数量需要。

附图说明

图1A为本发明不定茎生成过程中的一个实施例。

图1B为本发明接种在生根培养基上的一个实施例。

图2A、2B为本发明根诱导成功的一个实施例。

图2C、2D为本发明根诱导成功的另一个实施例。

图3A、3B、3C、3D为重复验证实验中的生根苗实施例。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例详述本发明。

实施例1

选取日本落叶松的无性系植株，以初春芽苞萌动前的1年生枝条为材料，经茎诱导完成后，选用经过改进的改良MS培养基，以变温培养和继代繁殖相结合的方法，实现日本落叶松微体繁殖的根诱导；具体操作如下：

1.材料的采集及预处理

选取辽宁省抚顺县五龙林场种子园的日本落叶松38号无性系，树龄10年，采集1年生树冠上部枝条，采集时间为初春芽苞萌动前，此时芽苞苞鳞由无光泽的暗棕色或暗褐色转变为有光泽的淡棕色或淡褐色，4℃下保存，取出后常温水培约两周，至芽苞发亮时止。

2.培养基制备

1)制备常规的改良MS培养基，其组成成分的浓度为：KNO₃ 950mg/l、NH₄NO₃ 825mg/l、KH₂PO₄ 170mg/l、CaCl₂·2H₂O 220mg/l、MgSO₄·7H₂O370mg/l、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/l、Na₂EDTA·2H₂O 37.3mg/l、H₃BO₃ 6.2mg/l、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/l、MnSO₄·4H₂O 22.3mg/l、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/l、KI0.83mg/l、CuSO₄·5H₂O 0.025mg/l、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2.0mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、琼脂6000mg/l。

2)分装、高压蒸汽灭菌，冷却后备用。

3.接种腋芽

将水培后长出腋芽的枝条分割成1～2cm的小段，无菌水洗涤后，浸入75％乙醇溶液中消毒1分钟，取出枝条小段上尺寸为0.5～1cm的腋芽，剥离包被在腋芽上的鳞片，腋芽投入0.1％升汞或3％过氧化氢溶液消毒10～30分钟，然后无菌水冲洗数次；将灭好菌的腋芽转接于事先制备好的装有茎诱导培养基的三角瓶内，每瓶内接1～3个腋芽，诱导不定茎的生成。图1A为茎诱导培养基，表示已完成茎诱导过程的不定茎。茎诱导培养基配方为：在改良MS培养基中添加玉米素(Zea)0.01～0.1mg/l、NAA 0.01～0.1mg/l、IBA 0.1～0.5mg/l。

4.诱导生根

制备生根培养基，在上述改良MS培养基中加入适量的NAA、IBA和AC，加入的浓度为：NAA 0.1mg/l、IBA 0.3mg/l、AC 1.5g/l，再将步骤3中生成的不定茎转接于盛装有生根培养基的三角瓶中，每瓶接1～3个不定茎，进入根生长阶段。图1B示转接到生根培养基上的不定茎，培养基呈黑色表示其中加入了活性炭(AC)。

5.变温处理及继代培养

将步骤4中接种了不定茎的三角瓶移至25℃下恒温暗光培养3天，然后在光强2500Lux条件下，继代培养共130天，光暗周期为16/8小时，培养温度昼间25～28℃，夜间18～20℃；每次继代时将底部褐化部分切去，20～25天继代1次，继代时更换生根培养基(生根培养基同步骤4)，共继代8次，完成植株再生。图2A、2B示本实施例中的再生植株，表明NAA与IBA协同处理，生根数量较多，根系比较粗壮。

本发明的原理是：

植物的细胞具有全能性，即在适当的生理条件和环境条件下，离体材料能够重建缺失的器官，形成再生植株。日本落叶松根诱导的关键是生长调节物质种类和浓度、基本培养基和附加促进物的选择以及环境条件的合理控制。不同植物根的诱导对各种生长调节物质的要求不同，它主要是植物本身内源激素的合成能力不尽相同所造成的。在各种生长调节物质中，生长素的生理作用主要是促进细胞伸长生长和细胞分裂，促进生根。培养基为植物发育分化提供了必需的养分元素，其生理作用一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；二是构成一些特殊的生理活性物质，参与新陈代谢，如构成植物激素、酶、辅酶以及作为酶的活化剂等；三是这些元素之间相互协调，维持离子浓度的平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面的作用；四是在发育方面，一定的元素影响到形态发生、组织和器官的建成。

依据其生理作用，本发明针对前人进行日本落叶松微体繁殖使用MS培养基造成离子浓度过高的缺陷，通过实验，在供选的几种培养基配方中选择了改良MS培养基。改良MS培养基中加入适量活性炭，一方面是因为活性炭具有强大的吸附能力(它主要吸附非极性物质)；另一方面，使培养基变黑可减少强光对根的抑制作用，特别是抑制内源激素吲哚乙酸(IAA)的光氧化过程，从而有利于日本落叶松不定茎的生根。同时，处在自然环境中的植株根系一般要求相对较低的温度才能良好发育，为此，本发明在根诱导阶段进行了昼夜变温处理，重复试验证明促进了根的形成。

其结果与自然状态下采取种子繁殖或扦插繁殖的常规方法相比，利用本发明的方法，可使优良苗木种群的实现周期缩短一半以上；以80m²的小型实验室配合必要育苗设施，可年产经过遗传改良的优良苗木20万株以上，并且繁殖过程不受自然季节影响。

实施例2

与实施例1不同之处在于：

选取28年生日本落叶松无性系朝6号植株，3月采集冬芽饱满的1年生枝条，以诱导伸长大于2cm的不定茎为材料；

制备生根培养基，在所述改良MS培养基中加入适量的NAA和AC，加入的浓度分别为：NAA 0.3mg/l、AC 1.0g/l；

将步骤4中接种了不定茎的三角瓶移至28℃下恒温暗光培养5天，然后在光强3,000Lux条件下，继代培养共70天，光暗周期为14/10小时，继代3次，结果在25个外植体中有5个生根，完成植株再生。图2C、2D示本实施例中的再生植株，表明单独使用本发明中适宜浓度的NAA也能够完成诱导生根过程。

实施例3

重复进行实施例1和实施例2的试验，条件分别同上述。图3A、3B、3C、3D示上述两个实施例重复试验的结果，其中图3A为本实施例1的生根培养基，图3B和3C为实施例1的验证结果，图3D为本实施例2的验证结果。