珍珠质基质蛋白及其编码基因与克隆方法和应用

摘要

本发明公开了一种珍珠质基质蛋白与编码基因及其克隆方法和应用。一种珍珠质基质蛋白，具有序列表中序列2的氨基酸序列或将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有序列2蛋白活性的由序列2衍生的蛋白质。所述蛋白序列的碳端还连接有序列表中序列3的信号肽。一种编码珍珠质基质蛋白的DNA序列，它具有下列序列之一：1)序列表中序列1的DNA序列；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的DNA序列。本发明的珍珠质基质蛋白，可以广泛应用于提高珍珠的产量与质量、珍珠的体外培养、珍珠质作为新型生物材料及制备医用生物新材料的开发利用等领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种珍珠质基质蛋白与编码基因及其克隆方法和应用。

背景技术

珍珠是软体动物珍珠贝体内生物矿化的产物，它作为装饰品和医药及化妆品原料有着巨大的商业价值，近年来发现珍珠还有可能作为一种新型生物材料进一步开发利用。合浦珠母贝(Pinctada fucata)是世界上用于生产海水珍珠的最主要贝类，我国的海水珍珠几乎都为合浦珠母贝所产。目前，在珍珠的体外培养和珍珠质作为医用新材料的应用方面已取得一定进展，但由于蛋白质分离纯化水平的限制，阻碍了研究的进展，同时在矿化相关功能蛋白及其编码基因的分离鉴定方面进展也较缓慢。

发明内容

本发明的目的是提供一种珍珠质基质蛋白及其表达方法，该珍珠质基质蛋白的编码基因及其克隆方法。

一种珍珠质基质蛋白，具有序列表中序列2的氨基酸序列或将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有序列2蛋白活性的由序列2衍生的蛋白质。

所述蛋白序列的碳端还连接有序列表中序列3的信号肽。

一种体外表达上述珍珠质基质蛋白的方法，包括以下步骤：

1)根据编码权利要求1所述蛋白的基因序列的两端设计引物，在引物的两端分别加上BamHI和XhoI酶切位点；

2)通过PCR方法在含有目的基因的克隆中扩增该基因，使产物两端也加上酶切位点；

3)利用设计的酶切位点将目的基因插入表达载体；

4)转化大肠杆菌；

5)表达、分离、纯化目的蛋白。

一种编码珍珠质基质蛋白的DNA序列，它具有下列序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的DNA序列。

其中，所说的严格条件是指在通常采用的杂交体系中，杂交温度在42℃以上。

一种克隆上述珍珠质基质蛋白基因的方法，包括下述步骤：

1)构建合浦珠母贝外套膜cDNA文库；

2)通过PCR方法利用简并引物对cDNA文库进行筛选；

3)对所得到的阳性克隆进行序列分析；

本发明分离、鉴定出的珍珠质基质蛋白的编码基因及其编码的珍珠质基质蛋白，可以广泛应用于提高珍珠的产量与质量、珍珠的体外培养、珍珠质作为新型生物材料及制备医用生物新材料的开发利用等领域。

在饱和碳酸钙溶液中加入本发明珍珠质基质蛋白，可使碳酸钙结晶形成有序的文石晶体，而不是天然条件下形成的方解石晶体。由于其独特的晶体结构和机械强度，所形成的晶体可进一步开发成新型医用生物材料。

与其它珍珠质基质蛋白配合使用，本发明珍珠质基质蛋白可使碳酸钙在体外形成珍珠质样晶体，使珍珠的工业生产成为可能。

随着生物工程技术的发展，可通过控制本发明珍珠质基质蛋白编码基因在珍珠贝体内的表达周期，人为控制珍珠形成的时期，从而提高珍珠质量与产量。

具体实施方式

实施例1、克隆编码珍珠质基质蛋白的基因序列

克隆编码珍珠质基质蛋白的基因序列，包括以下步骤：

1)提取合浦珠母贝外套膜总RNA；

2)以Oligo(dT)为引物，提取mRNA；

3)将mRNA反转录成cDNA；

4)将cDNA连接到Uni-ZAP XR Vector上；

5)用Gigapack III Gold extract(Stratagene)进行包装，从而完成外套膜cDNA文库的构建；

6)根据合浦珠母贝珍珠质基质蛋白MSI31的信号肽序列合成简并引物；

7)通过PCR方法利用简并引物对cDNA文库进行筛选；

8)对所得到的阳性克隆进行序列分析；

9)所得序列经分析确定为序列表中的序列2。

实施例2、序列表中的序列2在体外的表达

本发明的第二个目的是提供一种体外表达珍珠质基质蛋白的方法，包括以下步骤：

1)根据编码成熟蛋白的氨基酸序列的两端设计引物，在引物的两端分别加上BamHI和XhoI酶切位点；所设计引物的序列为：

上游引物：GCGGATCCGGCGGAGATGGTGAC；

下游因物：GCCTCGAGTTATTGCAAAAAAATGAATATC

2)通过PCR方法在含有目的基因的克隆中扩增该基因，使产物两端也加上酶切位点，其中，PCR的条件为50μl反应体系，加入含有目的基因的质粒1μl为模板，两种引物各50pmol，95℃变性后加入2U Taq DNA聚合酶，95℃变性45sec，54℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环后于72℃延伸10min。

3)利用设计的酶切位点将目的基因插入pGEX-4T表达载体；

6)转化大肠杆菌；

7)表达、分离目的蛋白；

8)纯化目的蛋白。

经分析证实得到的蛋白质为碳端连接有序列表中序列3信号肽的序列2蛋白质。

                              序列表<160>3<210>1<211>362<212>DNA<213>合浦珠母贝(Pinctada fucata)<220><223><400>1gcacgaggca gataaaaggt cggtgcccaa ccacagtcat gaaacccttt gttacactcg 60caagcttgat cgtcttaatt gcctctgttt ctgccggcgg agatggtgac tatggcaaat 120acggcggtgt cagttacgga cctggcatca accttggagg tggtagtcta agtgccggag 180gaggtgttat cgggcttgga ggcgtcggag gtggtagtct aggtgccgga ggcgtcggcc 240cagttggtgg aattaccata tggactcacc ttttcacctg gatatacctt tttcatggat 300gtttgatatt catttttttg caataaatgg ccgggcacat acaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360aa                                                                362<210>2<211>76<212>PRT<213>合浦珠母贝(Pinctada fucata)<220><223><400>2gly gly asp gly asp tyr gly lys tyr gly gly val ser tyr gly 1               5                  10                  15pro gly ile asn leu gly gly gly ser leu ser ala gly gly gly

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