制备重组CHO细胞乙型肝炎疫苗的新方法

摘要

本发明涉及将含有乙型肝炎病毒表面抗原的溶液，通过疏水层析、硫酸纤维素层析以及凝胶过滤层析等多步处理，获得纯化或部分纯化的乙型肝炎病毒表面抗原的方法，实施所述方法的装置系统，使用所述系统通过所述方法获得的乙肝病毒表面抗原纯品，以及利用该抗原纯品配制的疫苗。

说明书

                      技术领域

本发明涉及用作乙型肝炎疫苗的乙型肝炎病毒表面抗原的纯化工艺。具体地，本发明涉及用重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原的层析纯化方法及其管道化生产乙型肝炎疫苗的工艺。

                      背景技术

乙型肝炎是严重危害人民身体健康的疾病。中国有10％以上的人是乙型肝炎病毒携带者，约60％的人受到过乙型肝炎病毒感染，每年约有30万人死于与乙肝有关的疾病。目前尚无普遍有效的治疗方法，疫苗接种是主要的预防乙型肝炎的措施。乙型肝炎疫苗的主要活性成分是乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，它可来源于健康携带者的血液(血源疫苗)、基因工程构建的重组真核细胞的表达产物(酵母表达型疫苗，重组CHO细胞表达型疫苗)。

血源乙肝疫苗因其潜在危险性已在中国境内禁用。酵母表达的乙肝疫苗为胞内表达类型，虽然产量很高，但其糖基化程度有限，而且用于人体的免疫效果和长期保存的稳定性，都不及血源乙肝疫苗和重组CHO型乙肝疫苗(周平华等，微生物学杂志，1999，19(3)：7-8)。

目前，乙肝疫苗生产中所用的乙型肝炎病毒表面抗原，主要来自基因工程构建的重组细胞的表达产物。可将编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因(可选择包括一或多个拷贝的前S1和前S2基因)，导入哺乳动物细胞如CHO细胞而构建重组细胞，如中国预防医学科学院病毒学研究所，用中国乙型肝炎病毒主要流行株adr亚型的HBsAg基因和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，构建了乙肝表面抗原高效表达细胞株CHO-C₂₈。由该细胞株表达的HBsAg为分泌型蛋白，经还原性SDS-PAGE检测主要有三条带：P23，GP27，GP30。其中糖蛋白GP30未在天然HBsAg(如血源疫苗)中出现过。多项试验证实，这种直接来源于哺乳动物细胞的乙型肝炎病毒表面抗原，无论免疫效果和稳定性都较理想(周平华等，出处同上；陈万革等，疾病监测，16(6)：214-216，2001)。该细胞株目前已获得中国政府批准，用于乙型肝炎疫苗的生产。

采用重组细胞生产乙型肝炎疫苗的方法，可以通过培养可表达乙型肝炎病毒表面抗原的重组细胞和提纯乙型肝炎病毒表面抗原来实现。重组细胞的培养，如重组CHO细胞可以在诸如篮式生物反应器等大型反应器中，以适当的载体，如Cytodex载体或聚丙烯-聚酯纤维载体，进行连续培养(如王妍等，中国生物制品学杂志，1993，1(4)：161-163)；也可采用转瓶培养(如于洪涛等，中国生物制品学杂志，1993，6(2)：70-72)。培养后除去细胞，获得含有HBsAg的上清液。去除细胞可采用传统的连续流离心法。或者，可用柱式滤器过滤(陈万革等，中国医学理论与实践新进展，长春：吉林科学技术出版社，2001年6月第1版，250-251)。

重组CHO细胞乙型肝炎疫苗生产的现有纯化工艺，是将含有HBsAg的上清液依次经过硫酸铵沉淀→溴化钾密度梯度离心→凝胶过滤层析来实现(如梅雅芳等，病毒学报，1990，6(4)：305-311)。虽然报道的回收率可达约45-50％，但基于硫酸铵沉淀的纯化方法分辨率较低，当用于重组(CHO细胞)HBsAg的纯化时，所得产品纯度不太高，影响产品质量。而且，该工艺需要多步离心，对设备的投入大，不易扩大规模。此外，整个操作为开放式，不能实现管道化，增加了纯化过程中微生物污染的机会。

李彬等，中国生物制品学杂志，1995，8(2)：56-59报道了一种改进的纯化工艺：细胞液连续高速离心→疏水层析→脱盐→离子交换→超滤→凝胶过滤层析，其终产物中活性HBsAg的收率最高也只达40％左右。因此需要寻找更为理想的纯化方法，来替代现有的生产工艺。

本发明人意外发现，用硫酸纤维素层析取代脱盐和离子交换步骤，提高了乙型肝炎病毒表面抗原纯化工艺的回收率。此外，还可在不增加成本的基础上，实现对重组乙型肝炎病毒表面抗原的高效、管道化纯化，有效地解决了抗原在纯化工艺中受环境污染的难题，获得了意想不到的好效果。

                            发明目的

本发明的一个目的是将硫酸纤维素层析与现有技术中的疏水层析和凝胶过滤层析组合而对由重组哺乳动物细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原进行高效纯化。通过选用硫酸纤维素层析洗脱液，如磷酸盐缓冲液中的适当NaCl浓度，如至少为0.5mol/L，优选至少0.6mol/L，更优选至少0.7mol/L，可以使硫酸纤维素介质所吸附的乙型肝炎病毒表面抗原最大限度地从层析柱中洗脱下来，从而减少纯化工艺中乙型肝炎病毒表面抗原的损失。

本发明另一目的是将上述多步骤层析所用的装置用管道相连接，形成一种相对封闭的管道系统。在这种相对封闭的系统中实施对乙型肝炎病毒表面抗原的纯化，减少所述抗原在纯化过程中与环境如空气、操作等接触的机会，从而减少污染机会。

本发明还有一目的是将上述管道系统进一步与适当的细胞液处理装置以管道相连接，成为一个相对更完整的系统。此系统更便于规模化生产和控制，以减少生物制品(本文中指乙型肝炎病毒表面抗原)纯化过程中发生污染的机会。

本发明还有一个目的是提供一个比上述管道系统更全面的系统，它是在上述管道系统的基础上还包括，在管道中先进行重组表达乙型肝炎病毒表面抗原的CHO细胞的培养和培养液的收获，再与上述纯化系统连通；并任选包括，在上述管道纯化系统之后，将纯化所得产物与常规佐剂混合均匀，然后稀释分装为最终产品。

本发明还有一个目的是用上述添加了硫酸纤维素层析的多步骤层析方法纯化由重组CHO细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原，以便制备乙型肝炎疫苗。

本发明还有一个目的是将上述新型纯化方法与传统的佐剂吸附和稀释工艺结合来制备可用于接种的乙型肝炎疫苗最终使用剂型。

本发明的其它目的，进一步体现在下文对本发明的描述中。

                         附图说明

图1显示含有重组(CHO)乙型肝炎病毒表面抗原的溶液经MatrexCellufine Sulfate^TM层析后对Sepharose 4 FF^TM层析的紫外检测图谱。

图2显示含有重组(CHO)乙型肝炎病毒表面抗原的溶液的Butyl SSepharose^TM层析的紫外检测图谱。

图3显示经图2所述Butyl S Sepharose^TM层析后，进行Matrex CellufineSulfate^TM层析的紫外检测图谱。

图4显示经图3所述层析后，对Sepharose 4 FF^TM层析的紫外检测图谱。

图5显示经图4所述层析后，所得样品经HPLC检测的结果。

图6显示经图4所述层析后，所得样品的SDS-PAGE结果。

图7显示管道纯化系统装置图。图中表示泵，表示紫外检测仪，表示三通阀。

图8显示乙型肝炎病毒表面抗原纯化工艺流程图。

图9显示乙型肝炎疫苗制备工艺总流程图。

                            发明内容

本文中“硫酸纤维素”是指硫酸与纤维素通过化学偶联而产生的分子，由基本均一的这种分子形成的颗粒可填充在层析柱中，用于层析。例如，实施本发明时可购买Matrex Cellufine Sulfate^TM介质(本文中简称MCS，来自Millipore，USA)或任何与其在纯化乙型肝炎病毒表面抗原方面等效的商品介质或自制介质作为硫酸纤维素。

本文中“回收率”和“收率”可互换使用，它们指活性成分(如本文中的乙型肝炎病毒表面抗原)经过加工后，最终收获物中的含量相对于原料中含量的比值。

本文中“纯度”是指在加工过程中，每一步纯化所得产物中活性蛋白(如本文中的乙型肝炎病毒表面抗原)相对于总蛋白的比值。

用于生产乙型肝炎疫苗的乙型肝炎病毒表面抗原，来自于可表达乙型肝炎病毒表面抗原的重组哺乳动物细胞，例如重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。细胞经过在培养基中培养后，产生大量的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，并从细胞中分泌出来，形成了含有细胞和HBsAg的培养液。该培养液经过去除细胞后，得到含有HBsAg的溶液。该溶液需要进一步处理，去除杂质，以得到纯化的HBsAg，用于生产乙型肝炎疫苗。

根据本发明，一种纯化乙型肝炎病毒表面抗原的方法包括：对含有所述抗原的溶液进行疏水层析，硫酸纤维素层析，和凝胶过滤层析。所处理的乙型肝炎病毒表面抗原，可以是CHO细胞培养液经过去除细胞的处理之后的收集液，其中HBsAg浓度一般可达0.5-5μg/L。

对含有乙型肝炎病毒表面抗原的溶液进行疏水层析，可采用常规方法，主要是为了去除杂蛋白。可使用Butyl S Sepharose^TM介质(Pharmacia)或其任何等效介质。例如，采用李彬等(出处同上)介绍的疏水层析方法，首先将含有HBsAg的溶液用8-9％浓度的硫酸铵处理，再以10-30倍床体积(所谓床体积是实际使用的层析介质的总体积)加入，用不含硫酸铵的0.02-0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH6-8)洗脱。紫外检测结果(图2)显示，大部分杂蛋白(峰I)已先于HBsAg被洗出该层析柱，然后才是以HBsAg为主的成分(峰II)。

本文中所述层析都在常规层析装置如层析柱中进行。最常见的层析柱是圆柱形或近似于圆柱形的中空管，使用时一般使其直立。可根据具体生产规模选择所用层析柱的直径和长度(高度)。层析柱中填充的层析介质根据需要来进行选择。

对上述疏水层析得到的HBsAg的收集液进行硫酸纤维素层析，其中以硫酸纤维素为吸附介质，该硫酸纤维素介质优选是Millipore^的MatrexCellufine Sulfate^TM介质(简称MCS)。这种MCS是一种直径为44-105μm的球形纤维素，其中含有低密度的硫酸基团(硫含量不少于700μg/g干胶)。它可特异性亲和结合病毒颗粒、病毒包膜以及微生物抗原等，但对小牛血清和热原质没有亲和力。硫酸纤维素层析也可使用任何其它与MCS等效的介质，所述等效介质含有低密度的硫酸基团，并能特异性结合混合体系中的乙型肝炎病毒表面抗原。

本发明人很意外地发现，将MCS层析柱用于纯化乙型肝炎病毒表面抗原时，对洗脱缓冲液以及其pH范围没有特殊要求，最常规的磷酸盐缓冲液即可，但配以缓冲液中0.6mol/L的NaCl浓度，可获得意想不到的很好的纯化效果，如果将所述NaCl浓度控制在0.7mol/L或更高浓度时，纯化效果更是出乎意料的高。

在实施例中，本发明人将表达乙型肝炎表面抗原的重组CHO细胞(例如CHO-C₂₈)的培养液过滤除去细胞后，直接加入MCS层析柱。当用不同pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的0.02mol/L磷酸盐-0.7mol/L NaCl缓冲液进行洗脱时，发现在pH6.0-8.0范围内，HBsAg的硫酸纤维素层析行为没有明显变化(数据未显示)。当用含不同浓度NaCl(0.4mol/L，0.5mol/L，0.6mol/L，0.7mol/L)的磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱时，发现当NaCl浓度达到0.5mol/L时，洗脱效果已达到83％，当NaCl浓度达到0.6mol/L时，洗脱效果已达到96％，当所述浓度达到0.7mol/L时，HBsAg即已基本上被洗脱(实施例1和表1)。因此，比0.7mol/L更高浓度的NaCl也可将全部HBsAg洗脱下来。已知常温下配制的NaCl浓度一般可达到3mol/L，如果高压后5mol/L的NaCl浓度也是有可能的，且冷却后并不析出。因此，根据本发明，进行所述硫酸纤维素层析时，洗脱缓冲液中NaCl的浓度范围可为0.5-5mol/L，优选0.6-5mol/L，更优选0.7-5mol/L。如果不打算采用高压配制，则上述NaCl浓度范围可以是0.5-3mol/L，优选0.6-3mol/L，更优选0.7-3mol/L。

紫外检测结果(图3)显示，该步层析又洗出更多的杂质(见图3的峰I)，然后才回收HBsAg活性峰(图3，峰II)。

上述硫酸纤维素层析的HBsAg收集液，进行凝胶过滤层析。凝胶过滤层析最常见的介质是Pharmacia^的Sepharose 4 FF^TM介质，也可使用任何其它等效介质。凝胶过滤层析的方法采用常规方法，如参见李彬等，出处同上。

由硫酸纤维素层析得到的HBsAg收集液，也可以先经过超滤处理，然后对超滤的截留液进行凝胶过滤层析。

采用本发明的纯化工艺，所纯化的活性HBsAg的回收率高达70％以上。这是现有纯化工艺无法想象的高回收率。

根据本发明，纯化工艺流程中，含有乙型肝炎病毒表面抗原的溶液，可以先进行硫酸纤维素层析，然后再进行疏水层析。

根据本发明，一种制备乙型肝炎病毒疫苗的方法，包括将纯化的乙型肝炎病毒表面抗原与佐剂混合，制成乙型肝炎疫苗。根据需要，在与佐剂混合前，乙型肝炎病毒表面抗原可先进行过滤除菌，然后用氢氧化铝等适当佐剂吸附并稀释至适当浓度。

根据本发明，一种用于纯化乙型肝炎病毒表面抗原的系统，包括

-疏水层析装置，

-硫酸纤维素层析装置，

-凝胶过滤层析装置，

其中各装置之间用管道相连接，使得被处理的物料经由管道在各装置之间传送，以避免或减少纯化过程中的污染。

根据本发明，在上述系统中还包括细胞去除装置，用于从表达乙型肝炎病毒表面抗原的细胞的培养液中，去除细胞。这种管道化系统的一个优选实例可参见图7。

根据本发明，一种纯化乙型肝炎病毒表面抗原的方法，利用本发明的纯化系统来实现。该方法包括：

(1)将含有乙型肝炎病毒表面抗原的溶液，经管道送入疏水层析装置，进行层析；

(2)将富含乙型肝炎病毒表面抗原的疏水层析收集液，经管道送入硫酸纤维素层析装置，进行层析；

(3)将来自硫酸纤维素层析装置的乙型肝炎病毒表面抗原收集液，经管道送入超滤装置，进行超滤；

(4)将步骤(3)的超滤液经管道送入凝胶过滤层析装置，进行层析，得到纯化的乙型肝炎病毒表面抗原。

参照图7，对该方法一个实施方案作具体描述：

I.去除细胞

将细胞培养收集液，从收集罐(11)经管道(12)，泵至柱式过滤装置(13)。过滤去除细胞后的收集液贮在收集罐(14)中。然后该收集液经管道(17)泵至疏水层析柱(21)。根据需要，该收集液可在送至疏水层析柱(21)前进行超滤。可将该收集液经管道泵至超滤装置(15)进行超滤，废液被排入废液罐(16)，而超滤收集液则再经管道送回收集罐(14)，再送至疏水层析柱(21)。

II.疏水层析步骤

将来自收集罐(14)的已经去除了细胞的溶液在疏水层析柱(21)中按照常规方法进行层析，该层析的流出液经过监控仪而被管道(22)送至三通阀，三通阀在监控仪的操控下将HBsAg收集液通过管道引入收集罐(23)，废液则排入废液罐(24)。

III.硫酸纤维素层析步骤

来自上述收集罐(23)的收集液，经管道(25)泵送至硫酸纤维素层析柱(31)，按照选定的条件进行硫酸纤维素层析后，在紫外检测仪的操控下，经三通阀将HBsAg收集液经管道(32)引入收集罐(34)，废液则排入废液罐(33)；可根据需要将收集罐(34)中的收集液泵至超滤装置(35)，进行超滤，超滤后的溶液被管道送回收集罐(34)；

III.凝胶过滤层析步骤

将上述收集罐(34)收集的收集液，经管道(36)泵送至凝胶过滤层析柱(41)，在紫外检测仪监控下，经三通阀将HBsAg收集液经管道(45)引入收集罐(46)，废液则排入废液罐(44)。

图9显示了一种完整的疫苗制备工艺的流程图。根据该图，管道始于培养基的配制和过滤除菌，然后根据生产规模在管道中并联若干转瓶培养装置或生物反应器，在其中对能重组表达HBsAg的哺乳动物细胞(如CHO细胞)进行常规培养，再通过管道回收培养液，贮于收集罐中；将收集罐引出的液体经过滤装置除去细胞，再经超滤浓缩，然后实施上述纯化工艺；纯化产物经常规过滤除菌，佐剂吸附，分装为疫苗产品。

该工艺有以下优点：

(1)管道化生产易于符合GMP规范。因为管道化减少了污染的机会；而且，本文所用的MCS介质对热原质无亲和力，更省去除热原质的复杂工艺。

(2)管道化工艺简单，易于操作和控制，甚至自动控制，使工艺优化，批间稳定性以及产品质量得以提高。

(3)层析介质载样量高，且层析工艺易于线性放大，所以适合大规模生产。

                          具体实施方式

下面结合实施例说明本发明。

实施例1 MCS层析中不同盐浓度对洗脱效果的影响

取CHO-C₂₈培养液200ml，其中乙型肝炎表面抗原蛋白的含量为2.14μg/ml。采用柱式滤器(0.2μm，Pall)过滤上述培养液，去除细胞及残渣(陈万革等，出处同上)。取滤过液200ml上样至已用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡的Matrex Cellufine Sulfate^TM层析柱(Φ26mm×80mm，40ml，Millipore)中。用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)充分洗柱，再以含不同浓度的NaCl的磷酸盐缓冲液(pH7.0)进行洗脱。流速为5ml/min(300ml/h)。最后以含有3.0mol/L NaCl的0.02mol/L磷酸盐缓冲液彻底洗出所有被吸附的蛋白。分别测定各层析级分中乙型肝炎病毒表面抗原的活性(RIA试剂盒，北京生物制品研究所)。结果见表1。

          表1不同盐浓度对HBsAg洗脱效率的影响

       洗脱液中NaCl浓度(mol/L)   HBsAg洗脱率(％)^*

                 0.4                 74

                 0.5                 83

                 0.6                 96

                0.7                        100

^*被洗脱的HBsAg占所有流过层析柱的(包括被平衡液带出层析柱的和被洗脱的)HBsAg总量的百分比。

从表1可见，当洗脱液中NaCl浓度达到0.6mol/L时，洗脱效果已经比较理想；当所述NaCl浓度达到0.7mol/L时，便可将全部HBsAg洗脱下来。

实施例2 MCS层析柱的载样量分析

如实施例1所述获得CHO-C₂₈培养液并过滤除细胞。取不同体积的滤过液上样至已如上述预平衡的相同硫酸纤维素层析柱，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)充分洗柱。再以含0.7mol/L NaCl的0.02mol/L磷酸盐缓冲液洗脱。分别对上样流出液中(未吸附)的HBsAg和0.7mol/L NaCl的洗脱流出液中(上样时吸附)的HBsAg进行测定(RIA试剂盒，同上)。结果如表2。

         表2  Matrex Cellufine Sulfate^TM上样量的测定

上样体积(ml)    上样体积/床体积    吸附的HBsAg％

    400               10               99

    800               20               98

    1200              30               95

    1600              40               80

    2000              50               60

从表2可见，所用的硫酸纤维素层析柱能承受多达30倍床体积的上述CHO细胞培养液上样，即每毫升凝胶能吸附多达60μg的HBsAg。

实施例3 MCS层析+凝胶过滤层析

重复如实施例1所述的Matrex Cellufine Sulfate^TM层析，以含有0.7mol/LNaCl的0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱。收集洗脱流出液45ml。将其超滤(截留值100kDa，Millipore)浓缩至10ml，然后上样至已用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)预平衡的Sepharose 4 FF层析柱(Φ16mm×900mm，180ml，Pharmacia)中。用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)以50ml/h的流速洗柱。期间对流出液进行紫外监测(280nm)，结果见图1。如图1所示，峰II和峰III不能完全分开，表明杂蛋白仍然很多，其纯度达不到制备疫苗的要求。

实施例4疏水层析+MCS层析+凝胶过滤层析

如实施例1所述将CHO-C₂₈培养液过滤除细胞。取2L滤过液加8-9％浓度的硫酸铵处理后，上样至已用含9％硫酸铵的0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)预平衡的Butyl S Sepharose层析柱(Φ50mm×100mm，200ml，Pharmacia)中。用上述预平衡缓冲液充分洗柱后，以0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)按8ml/min的流速洗脱，紫外监控(280nm)，收集洗脱液。该层析过程见图2，其中峰I为杂蛋白，峰II为活性峰，显然这一步骤已去除绝大部分的杂蛋白。

将上述洗脱液如实施例3所述进行Matrex Cellufine Sulfate^TM层析(Φ26mm×80mm，40ml，Millipore)和Sepharose 4 FF层析(Φ16mm×900mm，180ml，Pharmacia)。其中Matrex Cellufine Sulfate^TM层析的紫外监测结果如图3所示，峰II为纯化的HBsAg，可见此步骤获得的HBsAg的纯度非常高；Sepharose 4 FF层析结果如图4所示，峰II为纯化的HBsAg，可见此步骤获得的HBsAg收率已经非常理想。收集洗脱液，用HPLC及还原条件的SDS-PAGE-银染法进行质量检测，结果见图5和6。

比较图1和图4可知，增加疏水层析步骤之后HBsAg的纯度比仅用硫酸纤维素层析和凝胶过滤层析的纯度高。HPLC分析显示纯度为98.2％(峰面积积分)。电泳结果显示确实为重组CHO表达的HBsAg的特定带型。

对CHO细胞培养液以及各步层析的收集液中HBsAg量进行如上所述的RIA测定。结果见下表3。

表3各步骤的HBsAg回收各步收集液     HBsAg浓度      体积       HBsAg总量    单步收率¹   总收率²细胞培养       2.14μg/ml     2000ml     4200mg        100％       100％疏水层析       26.67mg/ml     150ml      4000.5mg      95.25％     95.25％MCS层析        112.03mg/ml    45ml       5041.3mg      126.02％    120.03％超滤           314.28mg/ml    10ml       3142.8mg      62.34％     74.82％Sepharose4FF   38.65mg/ml     80ml       3091.9mg      98.38％     73.62％

¹为每一步层析之前和之后的样品中HBsAg总量的比值。

²为每一步层析之后的样品中HBsAg总量相对于原始细胞培养液中HBsAg总量的比值。

从表3可见，依次经过：疏水层析→硫酸纤维素层析→超滤→凝胶过滤层析之后，对乙型肝炎病毒表面抗原的纯化效率，即回收率可高达70％以上。