一种花药或花粉培养获得单倍体植株的方法

摘要

本发明涉及一种花药或花粉培养获得单倍体植株的方法，本发明的方法是将花药直接接种于液体培养基中，进行花药漂浮培养。待花药自然开裂，使花粉(小孢子)自由散落于液体培养基中，当花药漂浮培养适当天数后，在无菌条件下去掉花药，进行游离花粉(小孢子)培养。同时对培养基中的成分进行改良。采用本发明的方法，克服了现有花药培养时药壁、花丝等体细胞脱分化起动的干扰，使染色体倍性相对稳定，同时，还克服了在现有花粉培养时需要挤压、过滤、离心等繁琐的操作过程。另外，采用本发明的方法，还明显提高了花粉(小孢子)胚状体的诱导和植株再生的频率。

说明书

技术领域：

本发明涉及植物细胞工程领域，更具体的涉及一种通过花药或花粉培养技术获得单倍体植株的方法。

背景技术：

目前，在用花药培养茄子单倍体植株的方法中，一般都使用固体培养基进行。在这种花药培养过程中，花药壁、花丝等体细胞非常容易脱分化起动，从而影响花粉(小孢子)的脱分化起动，致使二倍体细胞和单倍体细胞的两种愈伤组织或胚状体混在一起，很难区分哪一种是所需要的单倍体材料。由于花药培养多是经愈伤组织细胞再分化形成胚状体或不定芽再发育成植株，植株的染色体倍性很容易变异，所以不能保证是单倍体植株。Vaulx RD de etal在1982，Agronomie.2：10，983-988页上曾报道，100个花药得到25-35株再生植株，其中15-50％是二倍体的。Miyoshi K.在1996，Plant Cell Reports 15：6，391-395页上也曾经报道，100个花药一共获得12株，只有1株是单倍体的，7株是二倍体的，3株是三倍体的，1株是四倍体的。另外，固体培养时，花药只在培养基的一个固定位置，培养基中的营养成分得不到充分利用。

在利用花粉(小孢子)培养单倍体植株的方法中，大多使用液体培养基进行悬浮培养。其存在的问题是，制作小孢子悬浮液的过程十分繁琐，需要对花药进行挤压，把花粉(小孢子)挤出来，为了把花药残渣去掉，还要经不锈钢网过滤，为了去掉小的花药壁残渣还必须在离心机上经过三次离心，然后再加上预先配制好的培养基才能完成这一接种过程。由于操作步骤复杂，还增加了污染的机会。

另外，无论是花药培养还是花粉(小孢子)培养，其胚状体或愈伤组织的诱导频率都非常低，根据现有资料报道，花药培养时，其诱导频率在1-35％之间。例如：邓立平等，1991年在生物技术1：(5)30-34页上报道，茄子花药培养时，花粉愈伤组织的诱导频率在5.6-18％之间；北京市农科院蔬菜所1977年，在花药培养学术讨论会文集上报道.花粉胚状体的诱导频率在0.7-9.09％之间；Tokumo K etal.在1994，Scientific Reports of the Faculty of Agriculture，OkayamaUniversity No.84 13-16.上报道，花粉愈伤组织的诱导频率最高为28％，其胚状体的诱导频率只有5.1％。Rotino G.L.等1987年在Capsicum Newsletter No.689-90页上报道，9050个花药中产生531个胚状体，最好的是910个花药有306个胚状体形成，其诱导频率为33.6％。花粉培养时，其诱导频率就更少，只有0.1-12％。例如：Miyoshi k.1996，在Plant Cell Reports15：6，391-395页上曾报道100个花药共获得12株再生植株。这样低的诱导频率很难达到育种的要求，这不利于加速作物育种过程和优良品种的选育。

发明内容：

本发明提供一种通过花药和花粉培养获得单倍体植株的方法，采用该方法可以明显提高胚状体和植株的诱导频率。

本发明的方法是：

将花药直接接种于液体培养基中，进行花药漂浮培养，使花药自然开裂，花粉(本发明所称的花粉也包括小孢子)自由散落于液体培养基中，当花药漂浮培养适当天数后，在无菌条件下去掉花药，进行游离花粉培养。

在本发明的方法中，所述的液体培养基可以是本领域技术人员公知的MS(可参见Murashige T.and F.Skoog，于1962年在Physiol.Plant，15：473-497)或其他的液体培养基，优选的，液体培养基中含有麦芽糖，其优选浓度为3-15％。

在本发明的方法中，所述液体培养基中优选含有2，4-D与KT，其中2，4-D的优选浓度为0.05-0.5毫克/升，KT的优选浓度为0.5-5毫克/升，更优选的，两者的使用比例为1∶5-20。

在本发明的方法中，所述的液体培养基中优选还含有维生素C，它的使用浓度优选为0.5-50毫克/升。

在本发明的方法中，在花药漂浮培养10-25天后取出花药，进行游离花粉培养。

上述本发明的方法，可适用于茄子、辣椒、番茄、黄瓜等体细胞容易脱分化起动的植物的花药、花粉培养。

在本发明中，由于是将花药培养和花粉培养相结合，将花药直接漂浮于液体培养基中培养，并在培养过程中适时去掉花药壁，就克服了现有花药培养时药壁、花丝等体细胞的干扰，从而使染色体倍性相对稳定。因花粉游离于液体培养基中，可充分利用培养基中的养分。另一方面，本发明的方法还克服了花粉培养时需要挤压、过滤、离心等繁琐的操作过程，即减少劳动量又减少了污染的机会。而且，申请人还惊喜的发现，采用本发明的方法，明显提高了茄子花粉胚状体的诱导和植株再生的频率。例如在本发明的实施例中，25个花药就产生了70个胚状体，其诱导频率为280％，并已有52个胚状体发育成植株，植株成活率为74.3％。

下面给出采用本发明的方法培养茄子花药得到单倍体植株的实例，但并不限于本实施例。

实施例：茄子花药漂浮培养

从田间健康植株上取回花粉发育时期为单核中期至中晚期的茄子花蕾，去掉花萼，用70％酒精消毒几秒钟，再用5-10％次氯酸钠水溶液消毒7-8分钟，在超净台中，用无菌水冲洗3-4次，把水倒干后从花蕾中取出花药接种在EGA液体培养基中，使花药漂浮于液体表面。所述的液体培养基为：硝酸钾2150毫克/升，硝酸铵1240毫克/升，硫酸镁410毫克/升，氯化钙240毫克/升，磷酸二氢钾140毫克/升，硝酸钙50毫克/升，磷酸氢二钠40毫克/升，硫酸铵30毫克/升，氯化钾10毫克/升；硫酸锰22毫克/升，硫酸锌4.0毫克/升，硼酸3.0毫克/升，碘化钾0.7毫克/升，钼酸钠0.2毫克/升，硫酸铜0.02毫克/升，氯化钴0.02毫克/升；铁盐(由硫酸亚铁27.85毫克/升和乙胺四乙酸二钠37.25毫克/升组成)，肌醇50毫克/升，维生素B6 6毫克/升，维生素B1 0.5毫克/升，烟酸0.5毫克/升，甘氨酸0.1毫克/升，2，4-D0.2毫克/升、KT2毫克/升、麦芽糖5％、维生素C20毫克/升。然后，将接种好的材料置于25±1℃的培养室内进行培养。培养15天后，在超净台中取出花药，仍放回培养室中继续培养，再经过10-15天，可见花粉形成胚状体，统计结果表明，25个花药就产生了70个胚状体，其诱导频率为280％。然后，将胚状体移入使其进一步发育成植株的培养基上，1-2个星期就可获得茄子的单倍体完整植株。目前，已有52个胚状体发育成植株，植株成活率为74.3％。