硅酸盐细菌及含有硅酸盐细菌的肥料

摘要

本发明一种硅酸盐细菌,该菌是土壤芽胞杆菌(Bacillus edaphicus)的NBT菌株,保藏号为CCTCCNo.M200040。菌体为长杆状(1.0－1.5×3－5μm),两端钝圆,幼龄时周生鞭毛,革兰氏反应阴性(可变),菌体外有肥厚的荚膜,菌体内往往有1－2个颗粒体。老培养物能形成芽胞,芽胞椭圆形,位于孢囊中部,孢囊不膨大。能水解淀粉,明胶液化,使牛奶胨化,使石蕊褪色。具有高效分解释放矿物和土壤中钾、磷,固定空气中的氮素,产生多种生理活性物质的能力。以该细菌为有效成分的生物钾肥,可改善作物钾素营养,提高作物产量和品质,改良土壤。

说明书

本发明涉及一种硅酸盐细菌及其基因，具体地说本发明涉及能高效分解矿物钾的芽胞杆菌，以及以该硅酸盐细菌为有效成分的生物肥料。

植物生长需要大量的氮、磷和钾。随着化学氮、磷肥用量的增加，秸秆还田不足，雨水冲刷造成的损失，耕作层土壤氮肥过剩而钾肥不足已成为农业生产上的一个重要问题。土壤养分失去平衡，缺钾地区不断扩大，土壤钾素不足已构成我国农作物产量提高、品质改善的限制因素。因此农业生产上施用矿质钾肥日益增多。但我国钾矿资源缺乏，虽每年进口约200万吨钾肥，仍不能满足农业生产对钾肥的需求，且需花费2.6亿美元外汇。另外，矿质钾肥被作物吸收利用率不高，容易淋失，造成浪费和污染环境。故以多种形式补充土壤中的钾素，科学合理施用钾肥已成为农业生产上的主要技术措施之一。其中，寻求一条既能缓解钾肥供需矛盾，又着眼于农业生态环境保护，且能达到农业高产、优质、高效的生物学途径显得更为迫切。

本发明的目的是提供一株能高效分解矿物钾的细菌及其基因，从而能开发出一种新型的生物钾肥，能把土壤中不溶或难溶的钾、磷转化为植物可以直接吸收的速效钾和有效磷；具有固定空气中的氮素和提高化肥利用率的能力；在土壤中能产生多种生理活性物质，促进植物生长；能改善土壤结构，消除土壤板结；具有增强作物抗旱、抗寒和抵御病虫害的能力以及补充硅、锌等微量元素的作用。

下面叙述本发明的主要内容：

本发明所提供的硅酸盐细菌NBT菌株是1986年9月从中国江苏省南京市黄棕壤中分离而得，其于2000年12月13日在武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No.M200040。该菌株具有下述性质：

1.菌落形态特征

该菌株在玻璃粉培养基和蔗糖无氮培养基上生长良好，单个菌落呈半玻璃珠状，边缘整齐，表面湿润光滑，有光泽，隆起，无色透明。菌苔浓稠富有弹性，接种针挑动时可牵拉出较长丝。在肉汤培养基上生长很微弱，菌落小，半透明，易挑起。

2.菌体形态特征

菌体为长杆状(1.0-1.5×3-5μm)，两端钝圆，幼龄时周生鞭毛，革兰氏反应阴性(可变)。营养体在60℃经15分钟处理，存活率为80-90％。菌体外有肥厚的荚膜，菌体内往往有1-2个颗粒体。老培养物能形成芽胞，芽胞椭圆形，位于孢囊中部，孢囊不膨大。芽胞在100℃经15分钟处理，存活率为80-85％。

3.主要生理生化特征

主要生理生化特征见表1。该菌株能很好的利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、腐殖酸等作为碳源，能水解淀粉，不利用纤维素和羧甲基纤维素；在利用各种碳源时产酸不产气，一般培养后基质的pH值降低0.4-1.8。能在无氮培养基上生长良好，形成丰满的玻璃珠状菌落；在有氮培养基上的菌落较小。对有机氮源不能很好利用，在肉汤蛋白胨培养基上生长很微弱，不形成荚膜；能利用大多数氨基酸(见表1)中的氮，也能利用盐酸硫胺、VB₁₂中的氮，不利用6-BA(6-苄氨基嘌呤)中的氮。能使牛奶胨化，使石蕊褪色。NaCl浓度高于1.0％时生长受抑制。代时为4.08小时。

4.遗传学特征

该菌株的G+C mol％为53.7-55％，16S rRNA基因部分序列并已向Genbank提交，登录号为AF320074，菌株的16S rRNA基因序列为：1、  CCGCGGCGTG CCTAATACAT GCAAGTCGAG CGGAGCACTTCGGTGCTTAA GCGGCGGACG61   GGTGAGTAAC ACGTAGGCAA CCTGCCTGTA AGATCGGGATAACTACCGGA AACGGTAGCA121  AGACCGGATA GCTGGTTTCG GTGCATGCCG GAATCATGAAACACGGGGCA ACCTGTGGCT181   TACGGATGGG CCTGCGGCGCATTAGCTAGT TGGCGGGGTA ACGGCCCACC AAGGCGACGA241   TGCGTAGCCG ACCTGAGAGG GTGATCGGCC ACACTGGGACTGAGACACGG CCCAGACTCC301   TACGGGAGGC AGCAGTAGGG AATCTTGCGC AATGGGCGCAAGCCTGACGG AGCAACGCCG361   CGTGAGTGAT GAAGGTTTTC GGATCGTAAA GCCTGTTGCCAGGGAAGAAC GTCGTGGAGA421   GTAACTGCTC TGCGAATGAC GGTACCTGAG AAGAAAGCCCCGGCTAACTA CGTGCCAGCA481   CCGCGGTAAT ACGTAGGGGG CAAGCGTTGT CCGGAATTATTGGGCGTAAA GCGCGCCAGC541   GGTCTTTTAA GTCTGGTGTT TAAGCCCGGG GCTCAACCCGGTTCGCACCG GAAACTGGAA601   GACTTGAGTG CAGGAGAGGA AAGCGGAATT CCACGTTTAGCGGTGAAATG CGTTAAAATG661   TGGAGGAACA CCAATGGCGA AGGCGGCTTT CTGGACTGTAACTGACGCTG AGGCGCGAAA721   GCGTGGGGAG CAAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCACGCCGTAAACG ATGAGTGCTA781   GGTGTTAGGG GTTTCGATAC CCTTGGTGCC GAAGTAAACACAATAAGCAC TCCGCCTGGG841   GAGTACGCTC GCAAGAGTAA ACGCAAAGGA ATTGACGGGGACCCGCACAA GCAGTGGAGT901   ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGTCTTGACATCC CTCTGAAAGC961   CCTAGAGATA GGGTCCTCCT TCGGGACAGA GGTGACAGGTGGTGCATGGT TGTCGTCTGC1021  TCATGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGCAACCCTTGAC TTTAGTTGCC1081  AGCATTGAGT TGGGCACTCT AGAGTGACTG CCGGTGACAAACCGGAGGAA GGTGGGGATG1141  ACGTCAAATC ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACACGTACTACAAT GGCCGGTACA1201  ACGGGAAGCG AAGTCGCGAG ATGGAGCGAA TCCTTAGAAGCCGGTCTCAG TTCGGATTGC1261  AGGCTGCAAC TCGCCTGCAT GAAGTCGGAA TTGCTAGTAATCGCGGATCA GCATGCCCGC1321  AGAAATCGTT CCCGGGTCTT GTACACACCG CCCGTCACACCACGAGATTT ACAACACCCG1381  AAGCCGGTGG GGTAACCCGC AAGGGGGCCA GCCGTCGAAGGTGGGTAGAT TATTTNNNTT1441 NAAGGGNATA

根据中国科学院微生物所的《一般细菌常用鉴定方法》、《Bergey’sManual of Systematic Bacteriology》和试验的结果，本发明所述的硅酸盐细菌NBT菌株属于土壤芽胞杆菌(Bacillus edaphicus)类群，但又与土壤芽胞杆菌有明显的区别，其主要不同点在于该菌株有鞭毛、能水解淀粉、产生吲哚、液化明胶、使石蕊胨化褪色、VP反应呈弱阳性。发明人初步将其定名为Bacillus edaphicus subsp.。

通过常规的微生物发酵方法，可以培养本发明所述的硅酸盐细菌NBT菌株，并制得以本发明所述的硅酸盐细菌NBT菌株为有效成分的生物钾肥。初始生长pH为5.5-9.0，最适生长pH为7.0-7.5，最适培养温度为25-32℃，兼性好气，可用一般发酵工业中的通用发酵罐进行培养。在制造以本发明所述的硅酸盐细菌NBT菌株为有效成分的生物钾肥时，可同样使用该技术领域中已知菌肥所通用的肥料基质和载体，并能配制成颗粒剂、粉剂等任意的剂型。同时，在各种制剂中一般可添加一些有益于微生物繁殖及植物生长的营养液。

本发明的制剂还可以与其它肥料物质、土壤改良剂、杀菌剂、除草剂、杀虫剂配合使用，但不能和代森锰锌、福美双、乐果、甲基1605等农药混用。

本发明所述的硅酸盐细菌NBT菌株及制得的以本发明所述的硅酸盐细菌NBT菌株为有效成分的生物钾肥与现有技术相比有如下优点。

1.固氮和分解矿物释放钾、磷和其它微量元素

本发明所述的硅酸盐细菌NBT菌株有固氮酶活性，在无氮培养液中培养后菌液中的氨态氮含量可达0.40-0.55mg/ml。

该菌株能在以磷矿石为唯一磷源的固体平板培养基上生长，在含磷矿石的解磷培养液中培养28小时后，用钼蓝比色法测定该菌的解磷能力为1.50-2.85mg/kg。

该菌株在摇瓶条件下表现出较强的分解硅酸盐矿物的能力。以钾长石为底物，培养120小时后，可以从钾长石中释放出钾151.0-207.9mg/L，比对照增加209.4-326.02％；以土壤矿物为底物，可释放出钾77.0-105.7mg/L，比对照增加49.2-104.84％。而且，当环境中的钾离子浓度在100-200mg/L时该菌的解钾效率最大。

该菌株破坏硅酸盐矿物的同时还释放出硅、铝等元素。以钾长石为底物，接菌处理比接灭活菌处理对照上清液中的SiO₂、Al₂O₃分别增加122-125％、20.0-21.8％；以土壤矿物为底物，接菌处理比接灭活菌处理对照上清液中的SiO₂、Al₂O₃分别增加155-126.7％、18.0-19.2％。

2.保钾

该菌株能对环境中的游离态钾起到一定的吸持保蓄作用，吸持的钾占总解钾量的92.2-94.3％，使钾的流失减少35.5-56.5％。

3.分泌有机酸、氨基酸、植物激素类物质

该菌株能合成草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸等有机酸，含量范围分别为66.38-217.43mg/L、59.26-113.31mg/L、77.96-291.94mg/L和33.36-108.89mg/L。

该菌株能合成16种氨基酸，分别为天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和精氨酸。谷氨酸含量最高，达0.156-3.479mg/L，其次是丙氨酸(0.135-2.237mg/L)和甘氨酸(0.265-0.412mg/L)等，天门冬氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸等氨基酸主要在发酵前期合成，苏氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和精氨酸等几种氨基酸在发酵后期浓度逐渐增加，而甘氨酸的浓度在发酵过程中变化不大。

该菌株能产生并分泌植物激素，主要为生长素(IAA)、赤霉素A₃(GA₃)和细胞分裂素(玉米素核苷ZR、异戊烯基腺嘌呤IPA)，含量分别为0.54-3.77nmol/ml、0.19-2.97nmol/ml、0.91-2.62nmol/ml、5.49-31.15nmol/ml，IAA、GA₃是在该菌生长的稳定期后期产生的，ZR、IPA则是在对数生长期产生。

4.对农药抵抗

无论在大田农药施用浓度和残留浓度范围内的丁草胺、绿黄隆、三唑酮粉、多菌灵、马拉硫磷等农药对该菌株没有抑制作用；乐果、甲基1605在大田施用浓度下对该菌株有一定的抑制作用，而在残留浓度下无抑制作用；同时，该菌株对敌敌畏、三唑酮粉、多菌灵、丁草胺等农药的药效没有明显影响。

以下叙述本发明的实施例。

实施例1  液体制剂

将斜面菌种接种于有氮培养基中，培养18小时后接入种子罐。种子罐为0.5吨，投料量为0.4吨，培养基成分为蔗糖2.0kg，(NH₄)₂SO₄0.25kg，KH₂PO₄0.7kg，MgSO₄0.17kg，NaCl0.07kg，CaCO₃0.4kg，酵母膏0.2kg。种子罐须先用蒸汽灭菌并冷却至28-30℃，接种量为5％，种子罐培养温度控制在28-32℃，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1∶0.8，培养20小时后将种子液接入生产罐。生产罐为7吨，投料量为4.5吨，培养基成分为蔗糖8kg，淀粉18kg，(NH₄)₂SO₄4.5kg，KH₂PO₄9.0kg，MgSO₄2.3kg，NaCl0.9kg，CaCO₃4.5kg，酵母膏0.9kg。生产罐预先用蒸汽灭菌并冷却至28-30℃，培养温度控制在28-32℃，搅拌速度为250转/分，无菌空气通入量为1∶0.8。培养结束后培养液中菌体数量达到10亿/ml以上。培养液即可为制剂。

实施例2  粉剂

将实施例1所得的培养液用草炭吸附，培养液与草炭之比为1∶3.5，搅拌混合、粉碎，即得制剂。

实施例3  对棉花的增产试验

在密度、氮磷肥用量、载培管理措施相同的前提下，设不施钾(CK)，施钾(K₂O)150.0、262.5、375.0kg/hm²以及实施例1所得的硅酸盐菌剂与灭活硅酸盐菌剂各3000ml/hm²等6个处理，小区面积20平方米，随机区组设计，每个处理重复4次。土壤类型为潴育型水稻土，有机质15.1g/kg，全钾21g/kg，速效钾122.4mg/kg，，pH8.0。栽培方式为移栽地膜棉；行距127cm，株距33cm，植株密度4.68万/hm²；肥料运筹为：5月10日施碳铵(折氮93.75kg/hm²)和过磷酸钙600 kg/hm²作定植肥，7月11日施第1次花铃肥(碳铵，折氮112.5kg/hm²)，7月31日施2次花铃肥(用量同第1次)，盖顶肥未施用，常规管理。结果如表2，可知施硅酸盐菌剂3000ml/hm²，皮棉产量可达841.9kg，比不施钾增产9.05％，差异达极显著水平。

实施例4  对辣椒的促生作用

设对照，KCl，实施例1所得的制剂、灭活实施例1所得制剂4个处理，3个重复。每钵加土3kg，土壤类型为黄棕壤，有机质11.56g/kg，全氮1.14g/kg，全钾12.81g/kg，速效钾51.20mg/kg，pH6.6。每钵施入0.98g尿素，0.92g过磷酸钙，再按各处理要求分别加0.1g KCl，实施例1所得的制剂3ml或灭活菌剂。拌匀后移栽辣椒三叶期苗，每钵加去离子水900mL。按常规管理，注意补充水分和病虫害防治，同时测定原始对照土样的本底值。结果如表3，施硅酸盐菌剂后，植株速效钾含量高于对照和灭活菌剂的处理，说明该制剂将部分钾矿物转化为有效钾供植株吸收利用。从植株长势看，施菌剂的株高高于对照。

实施例5  对水稻的抗病增产效果

供试土壤为砂壤土，肥力中等，前茬都为三麦，供试面积2.9亩。供试品种为杂交粳稻，秧龄45天，移栽10天后以实施例2所得的粉剂0.5公斤撒施，栽前亩施尿素10公斤，过磷酸钙40公斤做基肥，后有追碳铵50公斤，定点定期考察，单收单打。试验结果见表4。施用该制剂后，水稻纹枯病、稻瘟病发病率降低，增产8.5％。

实施例6  对大白菜用地土壤肥力的培育

将实施例2制得的粉剂与40％有机肥、适量化学N、P、K肥同时施用，作为基肥，以25％叶菜类有机无机复混肥等作对照。供试土壤为黄泥土，小区面积为47.5cm²。供试品种为大白菜改良青杂三号，育苗移栽，收获后对种植前后的土样进行测定，结果见表5。该制剂与有机、无机肥混用后，可以使土壤在种植前后保持稳定的氮磷钾肥力，有效磷、钾甚至还分别增加9-14、16-35mg/kg土。

实施例7  提高苞菜品质

将实施例2制得的粉剂与40％有机肥、适量化学N、P、K肥同时施用，作为基肥，以25％叶菜类无机复混肥等作对照。供试土壤为马肝土，小区面积为22.4m²。供试品种为苞菜中甘11号，育苗移栽，第一次采收后对鲜样进行品质分析，结果见表6。该制剂与有机、无机肥混用后，苞菜硝酸盐含量降低18.6％，可溶性糖和维生素C分别增加0.19％、22.7％。

实施例8  对钾具有保蓄作用

取菜园土45kg，设不灭菌土壤和灭菌土壤两组，每组设不加菌(加无菌去离子水)、加实施例1所得的硅酸盐菌剂和加灭活实施例1所得硅酸盐菌剂各20ml三个处理。在无菌条件下水、菌、土混匀装柱(柱高50cm，内径5cm)，每柱装土1.5kg，接菌处理的柱子在28℃恒温室中培养7天。然后分别用200ml 0.1M KCl溶液滴注于土柱上，同时收集滤液，用原子吸收分光光度计测定滤液中的钾浓度。结果如下表7。可知，加菌剂处理流失的钾比对照减少48.1-56.5％。

实施例9  可与农药混用共施

选择2种杀虫剂(敌敌畏、马拉硫磷)、2种杀菌剂(多菌灵、三唑酮)及1种除草剂(丁草胺)为实验对象。将0.1ml实施例1所得的硅酸盐菌剂分别加入到上述5种农药40ml中，菌药混合，28℃振荡培养30小时。对于杀虫剂以菜青虫为作用对象，采用点滴法，将上述不同处理的混合液分别等量滴于虫体上，随时观察虫体活动情况；对于杀菌剂，分别用水稻纹枯病菌和小麦赤锈病菌为作用对象，将不同处理的混合液分别加到PDA平板上(每皿0.3ml)，然后接上供试病原菌，28℃培养3天后观察；对于除草剂，以稗草为作用对象，将稗草种子放入垫有滤纸的平皿中，加去离子水催芽，待萌芽后，分别加入不同处理的混合液0.3ml，室温下观察稗草生长情况。结果见表8，该菌剂均未对供试农药的药效产生明显的影响。由此可知，供试农药与该菌剂混用，既不会抑制其中的菌剂活性，又不会使其中的农药药效受到影响，可以达到降低劳动强度的目的。

表1  该菌株的生理生化特征和在不同碳源、氮源下的生长情况生理生化性状         结果        碳源       生长      氮源    生长

                                        情况              情况过氧化氢酶反应        +         D(+)-蔗糖    ++-     甘氨酸     +革兰氏染色反应^*      -         D(+)-葡萄糖  +++-    L-丝氨酸   +甘油产二羟丙酮        -         D(+)-果糖    ++-     L-缬氨酸   +卵磷脂水解            -         D(+)-阿拉伯  ++-     L-赖氨酸   +

                            糖产生吲哚              +         D(+)-乳糖    +-      L-天冬氨酸 +M.R                   -         D(+)-麦芽糖  ++-     L-亮氨酸   +V.P(pH)               +         D(+)-木糖    ++-     L-异亮氨酸 +

                 (6.2)硝酸盐还原            -         D(+)-山梨糖  +-      L-苯丙氨酸 +酪素水解              -         D(+)-甘露醇  +-      精氨酸     +厌氧硝酸盐产气        -         淀粉水解     +       DL-甲硫氨  +

                                                 酸明胶液化              +         纤维素       -       L-酪氨酸   +酪氨酸水解            -         羧甲基纤维   -       L-脯氨酸   +

                            素1％NaCl               -         腐殖酸       +       L-苏氨酸   +肉汤培养基生长  -            半乳糖    +    L-丙氨酸   +

                         鼠李糖    +    盐酸硫胺   +

                                        维生素B₁₂ +

                                        6-苄氨基嘌 -

                                        呤

^*革兰氏染色反应为18小时幼龄菌的反应。+-：产酸不产气。+：阳性，生长。-：阴性，不生长。

表2硅酸盐菌剂对棉花的增产效果处理                      皮棉产量/kg·hm^-2KCl 375kg/hm²              917.6(aA)KCl 262.5kg/hm²            857.3(bB)菌剂3000ml/hm²             841.9(bB)KCl  150kg/hm²             801.3(cC)灭活菌剂3000ml/hm²         786.3(dC)对照CK                      772.1(dC)

               注：a，b，c，d(p＜0.05)A，B，C(p＜0.01)

        表3  盆栽辣椒植株及收获后土壤中的钾(K)含量处理             土壤全钾/g  土壤速效钾  株高   植株钾/mg

             ·kg^-1    /mg·kg^-1    /cm   ·kg^-1对照              14.33       62.7        18.6   19.7灭活硅酸          14.18       56.4        21.4   19.1盐菌剂硅酸盐菌          14.06       71.5        28.9   24.7剂表4对水稻的抗病增产效果处理  基  有  分  纹  稻  穗  穗  结  千  理  实  增

  本  效  蘖  枯  瘟  粒  实  实  粒  论  产  产

  苗  穗  穗  病  病  数  粒  率  重  产  公  率

  万/ 万/ 成  发  发      数      克  公  斤/ ％

  亩  亩  率  病  病                  斤/ 亩

          ％  率  率                  亩硅酸  3.6 15. 52. 5.7 3.8 130 108 83. 37. 594盐粉  2   66  1           .87 .9  21  3   .25剂对照  3.5 15. 51. 9.4 6.2 125 100 79. 36. 547

  9   17  3           .6  .2  73  2   .5比对      0.4 +0. -   -   +5. +7. +3. +1. +4      8.5照增      9   7   3.7 2.6 24  74  47  1   6.8减

          表5  大白菜用地土样分析结果

菌硅酸盐菌剂40％有机肥 7248 1.98 0.154 81 +9 179  +16菌硅酸盐菌剂适量化学P、K肥40％有机肥 423048 1.96 0.153 86 +14 198  +35对昭等N，含40％有机肥 16.61g尿素+48kg鸡粪 1.87 0.155 52 -20 94  -59

                     表6  苞菜品质分析表

处理处理内容 施用量  NO₃-Nmg/kg比较可溶性糖％比较维生素Cmg/100g  比较25％无N、P、K＝25％，不含有机肥 120  553 0 7.15 0 44.4 0菌一硅酸盐菌剂40％有机肥 7248  530 -23 7.15 0 52.6 +12.2菌二硅酸盐菌剂适量化学P、K肥40％有机肥 423048  450 -103 7.34 +0.19 46.9 +2.5

                表7  硅酸盐菌剂的保钾作用处理                       滤液中的   占加入钾的    加菌剂处理流失的

                         钾(g)     量(％)        钾比对照减少量

                                                       (％)菜园土                       0.28        12.8               -菜园土+灭活硅酸盐菌          0.27        34.6               -剂菜园土+硅酸盐菌剂            0.14        17.9               48.1灭菌菜园土                   0.24        30.7               -灭菌菜园土+灭活硅酸          0.23        29.5               -盐菌剂灭活菜园土+硅酸盐菌          0.10        15.4               56.5剂

             表8  硅酸盐菌剂对农药药效的影响处理                菜青虫     赤锈病菌  纹枯病    稗草

                                     菌80％敌敌畏乳剂         +80％敌敌畏乳剂+菌液    +65％马拉硫磷乳剂       +65％马拉硫磷乳剂+菌液  +20％三唑酮                        +20％三唑酮+菌液                   +50％多菌灵                                 +50％多菌灵+菌液                            +60％丁草胺乳剂                                     +60％丁草胺乳剂+菌液                                +0.1ml菌剂              -          -        -       -注：各种药剂均40ml。菌液0.1ml。