大蹼铃蟾血管扩张因子及其制备方法和其基因

摘要

本发明涉及大蹼铃蟾血管扩张因子及其制备方法和其基因,属于生物医学领域。其血管扩张因子为从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽,分子量2985,等电点10.2,多肽氨基酸全序列一级结构为:NH

说明书

本发明涉及一种大蹼铃蟾(Bombina maxima)血管扩张因子及其制备方法和其基因，属生物医学领域。

各种血管扩张药物在临床上广泛用于治疗各种心血管系统疾病，如高血压，充血性心力衰竭、心肌缺血、血管痉挛等，而新近美国辉瑞制药公司发明生产的治疗阳痿药物“伟哥”也是一种微血管扩张药物。由于目前临床上所使用的血管扩张药物均具有不同程度的副作用和缺陷，因此，新的血管扩张物质的发现与研制是新型高效血管扩张药物开发的热点。

很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctis limnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。大蹼铃蟾主要分布于我国的云南、四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点。据文献报道，国外学者已从东方铃蟾(Bombina orientalis)中分离出一低分子量具胰蛋白酶抑制活性的多肽BSTI。从蟾蜍和林蛙皮肤中得到的降压肽类物质bufokinin和ranakinin有舒张血管和降血压的作用，已在治疗心血管疾病方面显示出诱人的应用前景；最近，一种两栖类核酸酶对HIV的选择性抑制作用更引起了人们对两栖类活性物质的注意。近十几年对170多种两栖类皮肤活性肽和类似物进行了筛选，证明有40多种活性肽有较好的药物开发前景。

发明人将本发明的大蹼铃蟾血管扩张因子全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的血管扩张因子编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。

本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种具有血管扩张作用(主要指微血管扩张)活性的大蹼铃蟾血管扩张因子及其制备方法和其基因。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

大蹼铃蟾血管扩张因子，为我们首次从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombinamaxima)皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2985，等电点10.2，多肽氨基酸全序列一级结构为：甘氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—精氨酸—赖氨酸—苯丙氨酸—亮氨酸—甘氨酸—甘氨酸—缬氨酸—赖氨酸—苏氨酸—苏氨酸—苯丙氨酸—精氨酸—半胱氨酸—苷氨酸—缬氨酸—赖氨酸—天冬氨酸—苯丙氨酸—丙氨酸—丝氨酸—赖氨酸—组氨酸—亮氨酸—酰胺化酪氨酸(NH₂-GIGRKFLGGVKTTFRCGVKDFASKHLY-NH₂)。

大蹼铃蟾血管扩张因子的制备方法，是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)，冷冻干燥后，经CM Sephadex C 25离子交换后，收取所得峰IV再经高效液相色谱(HPLC)反相C18柱分离纯化，取第二步HPLC反相C18柱层析分离出的峰(箭头所示)即可。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardmcnt mass spcctrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

大蹼铃蟾血管扩张因子作为制备血管扩张药物的应用。

血管扩张因子基因的克隆包括：大蹼铃蟾皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，在通过血管扩张因子N-端序列设计引物基础上，利用PCR方法筛选血管扩张因子基因。根据N-端序列所设计的扩增引物长度为18个核苷酸，其序列为5’GGTATCGGNAGAAAAATT3’，其中N-A、C、G、T，PCR另一扩增引物为位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码血管扩张因子的基因由647个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：ATCAAGATATCTGATAACCTATAACAATATCCTGAGATCCTGGTAAAGATGAATTTTAAGTACATAGTTGCAGTGTCCTTTTTAATAGCATCTGCATATGCACGAAGTGTAAAGAATGATGAACAGTCTCTGAGTCAGAGGGATGTTTTAGAAGAAGAATCACTGAGGGAAATCAGAGGTATAGGAAGAAAATTCCTAGGTGGTGTTAAAACAACTTTTAGATGTGGTGTCAAAGACTTTGCTTCTAAGCATCTGTATGGGAAAAGAACTGCTGAAGAACACGAAGTAATGAAAAGACTGGAAGCCATAATGCGTGATCTAGATTCCTTGGATCATCCAGAGGAAGCTTCTGAAAGGGAAACCAGAGGCTTTAATCAAGACGAGATTGCAAATCTTTTTACTAAAAAAGAGAAACGCATTTTGGGGCCAGTACTAGGTTTGGTTGGTAATGCACTTGGAGGTTTAATTAAAAAGATTGGATAATTATAAACAGTAAAACTTTGCTTTCATGAATCTTTGTAAAATGATGCTAATCAGATTACATATAATAAAGCATAATAAAATCCAAAAGCTATTAAACAAATGCATGATATCTACTCTGCTATTAAATAAAAATCATCTGAGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

其中编码根据权利要求1所述的成熟大蹼铃蟾血管扩张因子为第178-258位核苷酸，其氨基酸序列为：

                GIGRKFLGGVKTTFRCGVKDFASKHLY

大蹼铃蟾血管扩张因子基因作为基因工程制备血管扩张因子的应用。

下面用本发明的大蹼铃蟾血管扩张因子的药理实验结果来说明本发明的药效作用和有益效果：

1，小鼠体内扩张血管的作用：

采用体表循环观察实验方法测定血管扩张因子的扩张血管作用。实验用昆明种小白鼠，体重20克，分为实验组和对照组各15只，实验组腹腔注射0.1ml配制于生理盐水的纯化大蹼铃蟾血管扩张因子，注射剂量为200μg/kg，30分钟后，断颈处死动物，剥皮，观察皮肤血管状况，对照组采用生理盐水。结果表明，大蹼铃蟾血管扩张因子具有显著的血管扩张作用，与对照组相比，实验组小鼠皮肤充血、血管扩张严重，具明显差异，但无出血现象产生。

2，兔耳实验法观察血管扩张作用：

实验用白毛家兔，体重2公斤，分为实验组和对照组各6只，实验组耳静脉注射1ml配制于生理盐水的纯化大蹼铃蟾血管扩张因子，注射剂量为250μg/kg，30分钟后，观察兔耳静脉血管，对照组采用生理盐水。结果表明，大蹼铃蟾血管扩张因子具有显著的血管扩张作用，与对照组相比，实验组兔耳静脉充血、血管扩张严重，具明显差异，无出血现象产生。

从上述实验结果可得出本发明大蹼铃蟾血管扩张因子的有益效果在于：

动物体内实验表明纯化的大蹼铃蟾血管扩张因子有显著的血管扩张作用，所用实验动物包括小鼠和家兔。因此，本发明的大蹼铃蟾血管扩张因子是一种从中国特色药用生物资源中研制的具有显著血管扩张作用的生物活性多肽。

下面结合附图用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

图1为本发明大蹼铃蟾血管扩张因子的CM-Sephadex C-25离子交换层析图。

图2为本发明大蹼铃蟾血管扩张因子的HPLC反相C18柱层析图。

图3为本发明大蹼铃蟾血管扩张因子基因核苷酸序列。

图4为本发明成熟大蹼铃蟾血管扩张因子氨基酸序列。

实施例一：

1，制备大蹼铃蟾血管扩张因子：

活体大蹼铃蟾用水清洗干净，将大蹼铃蟾置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥、低温保存。

第一步：CM Sephadex C-25离子交换：按上述方法获得原材料大蹼铃蟾分泌物冻干粉溶解于0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0缓冲液，装于3.5KDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时；上样品于经0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0缓冲液平衡的CM Sephadex C-25(Pharmacia产品)阳离子交换柱(300mm长，26mm直径)，经两个柱体积同样缓冲液冲洗至穿透峰被完全洗脱，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集峰IV。

第二步，反相高压液相层析(RP-HPLC)：CM Sephadex C-25离子交换得到的活性成分峰IV以水(含0.1％三氟乙酸)：乙晴(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，收集HPLC反相C18柱层析峰(箭头标记)即为血管扩张因子。

2，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspcctromctry，FAB-MS)，以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体积比)为底物，Cs⁺作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。

3，纯化的大蹼铃蟾血管扩张因子用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

通过上述方法制备的大蹼铃蟾血管扩张因子，为我们首次从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2985，等电点10.2，多肽氨基酸全序列一级结构为：苷氨酸—异亮氨酸—苷氨酸—精氨酸—赖氨酸—苯丙氨酸—亮氨酸—甘氨酸—甘氨酸—缬氨酸—赖氨酸—苏氨酸—苏氨酸—苯丙氨酸—精氨酸—半胱氨酸—甘氨酸—缬氨酸—赖氨酸—天冬氨酸—苯丙氨酸—丙氨酸—丝氨酸—赖氨酸—组氨酸—亮氨酸—酰胺化酪氨酸(NH₂-GIGRKFLGGVKTTFRCGVKDFASKHLY-NH₂)。大蹼铃蟾血管扩张因子具有显著的体内扩张血管，特别是扩张微血管的作用，作为血管扩张物质在制备血管扩张药物中的应用。

实施例二：

1，大蹼铃蟾血管扩张因子基因克隆：

1)，大蹼铃蟾皮肤总RNA提取：活体大蹼铃蟾用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBC0BRL公司产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟，加入等体积酚/氯仿溶液，，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀，上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为大蹼铃蟾皮肤总RNA。

2)，大蹼铃蟾皮肤mRNA的纯化：采用美国PROMEGA公司的mRNA分离纯化试剂盒。取大蹼铃蟾皮肤总RNA500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加入3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的大蹼铃蟾皮肤mRNA。加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异戊醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

3)，大蹼铃蟾皮肤cDNA文库构建：采用美国GIBC0BRL公司SuperScript^TM质粒cDNA文库构建试剂盒，但方法操作有改进。cDNA第一链合成(mRNA反转录)，于1.5ml试管中加入2μl Not I引物和7μl mRNA，3μl DEPC水，70℃保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4μl 5X第一链合成缓冲液，2μl 0.1MDTT，1μl 10mM dNTP混合物，在加入1μl SuperScript II反转录酶，于37℃保温1小时后放入冰浴。cDNA第二链合成，在第一链合成试管中加入：95μl DEPC水，30μl 5X第二链合成缓冲液，3μl 10mM dNTP混合物，1μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl大肠杆菌DNA多聚酶I，1μl大肠杆菌RNA酶，反应总体积150μl，混匀后于16℃保温2小时；加入2μlT4 DNA多聚酶继续保温5分钟。DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm离心5分钟，取140μl上层溶液转移到干净试管中，加入70μl 7.5M乙酸铵，0.5ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。SalI adapter的连接，上述沉淀溶于25μlDEPC水中，加入10μl 5XT4 DNA连接酶缓冲液，10μl SalI adapter，5μl T4DNA连接酶，反应总体积50μl，于16℃保温16小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于41μlDEPC水中。Not I酶水解，于cDNA溶液中加入5μl React 3缓冲液，4μl Not I酶，反应体积50μl，于37℃保温2小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于100μlTEN缓冲液中。将cDNA样品过DNA分级分离柱(试剂盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的组份合并，体积为200μl，加入5ml酵母tRNA，100μl 7.5M乙酸铵，0.6ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μlTEN缓冲液中。合成的cDNA连接到pSPORT 1质粒，取10μl溶解于TEN缓冲液中的cDNA，加入4μl 5XT4 DNA连接酶缓冲液，1μl pSPORT 1质粒(Not I-Sal酶水解，50ng)，4μlDEPC水，1μl T4 DNA连接酶，反应体积20μl，室温3小时，可准备转化大肠杆菌HB101感受态细胞。感受态细胞的制备，挑取单个HB101菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于，50ml LB培养液中，37℃振荡2小时，待菌液540nm OD值为0.4时，4℃，2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1M CaCl₂悬浮，再2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以适量0.1M CaCl₂重悬，分装后置冰浴内备用。连接产物的转化：取上述连接产物5μl加入100μl感受态细胞冰浴60分钟，42℃热休克60秒，再置冰浴5分钟，加入无氨苄青霉素的SOC培养基0.9ml，37℃培养1小时，取200μl涂布于含氨苄青霉素的LB平皿(15cm直径)，37℃培养16小时，每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加10％甘油冻存。构建的cDNA含4×10⁴个单独克隆。

4)，大蹼铃蟾血管扩张因子基因克隆筛选：利用PCR筛选法筛选大蹼铃蟾血管扩张因子基因，所用正向引物P1，根据大蹼铃蟾血管扩张因子N-端6个氨基酸序列的可能的编码核苷酸所设计，长度为18个核苷酸，其序列为5’GGTATCGGNAGAAAAATT3’，其中N＝A、C、G、T；和位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。PCR反应在如下条件下进行：94℃1分钟，45℃1分钟和72℃1分钟，30个循环。首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板(Costar)上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μl)，37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。

6〕，大蹼铃蟾血管扩张因子基因序列测定和结果：提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国Applied Biosystems373A全自动核昔酸序列测定仪，测序引物为SP6和T7启动子，SP6启动子序列：5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’，T7启动子序列：5’TAATACGACTCACTATAGGGA3’。基因测序结果自5’端至3’端(见图3)。图3所示大蹼铃蟾血管扩张因子基因核苷酸的序列表为：序列长度，647个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：大蹼铃蟾皮肤，序列特征1：其中编码权利要求1的成熟血管扩张因子为第178-258位核苷酸，其氨基酸序列见图4，序列特征2：序列分析表明第418-477位核苷酸可编码另一功能蛋白(氨基酸序列为：ILGPVLGLVGNALGGLIKKI)。

大蹼铃蟾血管扩张因子基因作为基因工程制备血管扩张因子的应用。