中草药中减肥降脂活性成分的筛选方法

摘要

本发明公开了中草药中减肥降脂活性成分的筛选方法,属于生物技术领域。本发明的筛选方法是将脂肪酸合成酶、脂酰辅酶A合成酶和小鼠及人前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化三项指标中的一种或几种相结合作为靶点,用于筛选减肥降脂天然活性成分。本发明的筛选方法靶点明确、机理清楚可靠,与最新的药物作用机制的多靶点综合作用理论相吻合,可以用来对具有减肥降脂作用的天然活性成分进行大规模快速筛选,用于开发减肥新药。

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及对中草药中减肥降脂活性成分进行分子水平和细胞水平的筛选方法。

背景技术：

肥胖是一个世界性的医学问题。已有大量证据表明肥胖和多种疾病密切相关，如高血压，高血脂，糖尿病，心脑血管疾病，乳腺癌，女性不孕症，少儿智力低下等。以BMI(Body Mass Index)男性大于27.8、女性大于27.3做为肥胖标准，我国目前18-74岁人口中肥胖人口总数约7000万，占人口总数的5.8％；美国同龄人口中肥胖人口总数约6800万，占人口总数的20％。我国每年用于减肥和肥胖相关疾病治疗的消费总额约100亿元人民币，而美国则为1000亿美元。目前我国肥胖人口比例增长迅速，少儿肥胖问题已显得越来越突出。

目前国际上减肥药物的开发主要依据两个原理：第一，抑制食欲，比如西布曲明(sibutramine)；第二，减少吸收，比如奥利斯他(orlistat)。二者也是目前中国市场上仅有的两个减肥药，前者商品名为曲美、可秀和奥曲轻；后者商品名为仙尼克。二者的副作用十分明显，西布曲明导致口干、心悸、乏力，奥利斯他导致油性便和脂溶性维生素缺乏。西方国家也一直在依据新的原理开发减肥药物，比如，发现黄嘌呤衍生物类物质可以通过加快体内氧化代谢而加大能量支出，大量临床试验证明咖啡因(caffeine)，麻黄素(ephedrine)单独使用或联合使用具有一定的减肥效果，但由于其可导致心率过速和心悸的副作用一直未获得临床许可；上世纪九十年代中期发现并克隆了小鼠ob基因的表达产物瘦素(leptin)，并证明其对于遗传型肥胖的大鼠具有一定的减肥作用，但遗传型肥胖的个体只占肥胖个体总数的5-10％，且此物质注射给药时导致严重局部红肿疼痛，因此也至今未获得临床许可。综上所述，现有减肥药物的主要不足之处是副作用大和临床有效率低下，而这两点不足都和药物靶点设计不够科学有关。

中草药是中国独具优势的药物资源，古今中医典籍中记载有大量的中草药减肥降脂的实例。但由于中草药活性成分不明确，药理机制不清楚等限制，使传统中草药不能走向世界，因此迄今我国还没有具有自主知识产权的减肥药物。2000年北京国际肥胖及减肥大会提出尽快开发出我国具有自主知识产权的减肥降脂新药的目标。

发明内容：

本发明的目的是提供一种用于减肥降脂药物设计和筛选中靶点清楚、机理明确的减肥药物筛选方法。

本发明的技术方案如下：

本发明的筛选方法是将脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase，FAS)(EC2.3.1.85)、脂酰辅酶A合成酶(Acyl-CoA Synthase，ACS)(EC 6.2.1.3)和小鼠、大鼠或人前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化三项指标中的一种或几种相结合作为靶点，用于筛选减肥降脂天然活性成分。

一、将脂肪酸合成酶作为靶点进行分子水平筛选的步骤是：

1.分离纯化大鼠体内脂肪酸合成酶：

摘取大鼠皮下、肾周围及睾丸周围脂肪，合并，剪碎。加入约3倍体积的0.25M蔗糖溶液，匀浆。匀浆液于100000×g离心60分钟，取上清液，为FAS粗提液。在此粗提液中边搅动边加入固体硫酸铵至25％饱和度，继续搅动10分钟，12000×g离心10分钟，弃去沉淀，在上清中再加入固体硫酸铵至40％饱和度，搅动15分钟，离心收集沉淀，溶于适量含1mM DTT，1mM EDTA，pH7.0的4mM磷酸钾缓冲液中，为纯化的FAS。以上操作均在0-4℃下进行。

2.制备中草药的水提取物或乙醇提取物：

A、水提取物制备方法为：

各单味中草药取饮片，预制、粉碎。加5倍体积蒸馏水，煮沸30分钟，8层白纱布过滤取清液；沉渣重新加入5倍体积蒸馏水，煮沸30分钟，8层白纱布过滤取清液。两次清液合并，冷冻干燥。将所得干粉溶于适量蒸馏水中，得到棕黄色或棕红色透明液体提取物，用减压蒸干法测定可溶性固形物含量，使各单味中草药的各次提取中稳定在30-100mg/ml。此提取物2-8℃下保存72小时以上有浑浊出现。

B、乙醇提取物制备方法为：

各单味中草药取饮片，预制、粉碎。无水乙醇回流3次，回流液合并，得到棕黄色或棕红色透明液体提取物，用减压蒸干法测定可溶性固形物含量，使各单味中草药的各次提取中稳定在20-40mg/ml。

3.建立脂肪酸合成酶测活体系，在测活体系中加入中草药提取物，进行脂肪酸合成酶活性抑制实验，计算抑制程度，确认中草药中是否含有抑制脂肪酸合成酶活性的成分。

建立脂肪酸合成酶测活体系：用分光光度法。测活体系总体积1.0ml，包括反应启动物丙二酰辅酶A0.05ml。用37℃下每分钟催化1.0μmol依赖于丙二酰辅酶A的NADPH氧化的酶量为FAS的一个活力单位，每毫克酶蛋白含有的活力单位数为FAS的比活力(u/mg)。

进行脂肪酸合成酶活性抑制实验：在测活体系中加入中草药水提取物或乙醇提取物，使其和酶作用5分钟后加入反应起始物。中草药提取液加入量为每毫升测活体系5μl中草药提取液，以5μl双蒸水或无水乙醇为对照。计算抑制程度，确认有抑制作用的活性成分。

二、将脂酰辅酶A合成酶作为靶点进行分子水平筛选的步骤是：

1.分离纯化大鼠肝组织脂酰辅酶A合成酶：

摘取大鼠肝脏约200g，切碎。加入约3倍体积的0.25M蔗糖溶液，匀浆。匀浆液于600×g离心10分钟，沉淀颗粒重新置于约3倍体积的0.25M蔗糖溶液中再次离心，两次离心上清液合并。用230000×g离心60分钟，取沉淀；将沉淀悬浮于适量混合液中(此混合液含有5mM Triton X-100，50mM pH7.4磷酸钾缓冲液，5mMβ-巯基乙醇和1mM EDTA，蛋白质浓度约4.5mg/ml)，静置1小时，230000×g离心60分钟，取上清液，为ACS粗提液。用约5倍体积的含2mMTriton X-100和5mMβ-巯基乙醇的溶液稀释ACS粗提液，将稀释液上Blue-Sepherose层析柱(CL-6B，2.6×18cm)用5倍体积的含10mM ATP和0.8M NaCl的Buffer A(100mM磷酸钠，25mM柠檬酸钾，pH7.0)洗柱，最后用含10mM ATP和0.8M NaCl的Buffer A洗脱，流速15ml/小时，每15ml收集。将含有最大酶活性的部分合并，为纯化的ACS。以上操作均在0-4℃下进行。

2.制备中草药水提取物或乙醇提取物：方法同将脂肪酸合成酶作为靶点进行分子水平筛选方法中的步骤。

3.建立脂酰辅酶A合成酶测活体系，在测活体系中加入中草药水提取物或乙醇提取物，进行脂酰辅酶A合成酶活性激活实验，计算激活程度，确认中草药中是否含有对脂酰辅酶A合成酶有激活作用的活性成分。

建立脂酰辅酶A合成酶测活体系：用同位素法。测活体系总体积1.0ml，包括反应启动物辅酶A 0.05ml。用35℃下每分钟生成1.0μmol C¹⁴-标记棕榈酸辅酶A的酶量代表ACS的一个活力单位，以每毫克酶蛋白含有的活力单位数代表ACS的比活力(u/mg)。

进行脂酰辅酶A合成酶活性激活实验：在测活体系中加入中草药水提取物或乙醇提取物，使其和酶作用5分钟后加入反应起始物。中草药提取液加入量为每毫升测活体系5μl中草药提取液，以5μl双蒸水或无水乙醇为对照。计算激活程度，确认中草药中是否含有对脂酰辅酶A合成酶有激活作用的活性成分。

三、将小鼠、大鼠或人前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化速度作为靶点进行细胞水平筛选的步骤是：

1.制备中草药水提取物或乙醇提取物：方法同将脂肪酸合成酶作为靶点进行分子水平筛选方法中的步骤。

2.进行小鼠、大鼠或人脂肪细胞分化抑制实验，检测细胞分化被抑制的程度，从而确认中草药中是否含有对细胞分化有抑制作用的活性成分。方法可以为：

将小鼠、大鼠或人前脂肪细胞以一定密度接种于96孔板中，用生长培养基常规培养。细胞汇合后换成分化培养基，并加入不同浓度的中草药提取液，以相同体积的双蒸水或无水乙醇为对照，培养6天，期间根据需要换液。用油红O染色法测定细胞中脂肪含量，结合细胞形态确定分化程度，检测细胞分化被抑制的程度，从而确认中草药中是否含有对细胞分化有抑制作用的活性成分。

本发明的优点和积极效果：本发明在国际上首次提出将脂肪酸合成酶(FattyAcid Synthase，FAS)(EC 2.3.1.85)、脂酰辅酶A合成酶(Acyl-CoA Synthase，ACS)(EC 6.2.1.3)和小鼠、大鼠或人前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化三项指标用作具有减肥降脂作用的天然活性成分的筛选靶点；该方法靶点明确、机理清楚可靠；该方法可以采用分子和细胞多靶点筛选体系，这与最新的药物作用机制的多靶点综合作用理论相吻合。本发明的筛选方法可以用来对具有减肥降脂作用的天然活性成分进行大规模快速筛选，用于开发减肥新药。

附图说明：

图1为大黄醇提取物对小鼠前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的抑制作用示意图。图中：

A为未分化的小鼠前脂肪细胞，A’为与A对应的经油红0染色的未分化的小鼠前脂肪细胞；B为正在分化的小鼠前脂肪细胞；B’为与B对应的经油红0染色的正在分化的小鼠前脂肪细胞；C为完全分化了的小鼠脂肪细胞C，C’为与C对应的经油红0染色的完全分化了的小鼠脂肪细胞。

实施例：

实施例中涉及到的实验方法的具体内容见发明内容部分，在此不再重复

1.取菊花200g，煎制，得菊花的水提取物，测得可溶性固形物含量约50mg/ml。提取纯化大鼠脂肪酸合成酶，测定此提取物对此酶活性的影响。结果表明：当上述可溶性固形物在测活体系中的浓度高于0.2mg/ml时，此酶的活性随着菊花提取物的浓度的升高而降低。证明菊花中含有对脂肪酸合成酶起抑制作用的活性成分。

2.取大黄200g，煎制，得大黄的水提取物，测得可溶性固形物含量约80mg/ml。提取纯化大鼠脂肪酸合成酶，测定此提取物对此酶活性的影响。结果表明：当上述可溶性固形物在测活体系中的浓度高于0.5mg/ml时，此酶的活性随着大黄提取物的浓度的升高而降低。证明大黄中含有对脂肪酸合成酶起抑制作用的活性成分。

3.取茵陈200g，煎制，得茵陈的水提取物，测得可溶性固形物含量约80mg/ml。提取纯化大鼠脂肪酸合成酶，测定此提取物对此酶活性的影响。结果表明：当上述可溶性固形物在测活体系中的浓度高于1.0mg/ml时，此酶的活性随着茵陈提取物的浓度的升高而降低。证明茵陈中含有对脂肪酸合成酶起抑制作用的活性成分。

4.取乌龙茶200g，煎制，得乌龙茶的水提取物，测得可溶性固形物含量约90mg/ml。提取纯化大鼠脂肪酸合成酶，测定此提取物对此酶活性的影响。结果表明：当上述可溶性固形物在测活体系中的浓度高于1.0mg/ml时，此酶的活性随着乌龙茶提取物的浓度的升高而降低。证明乌龙茶中含有对脂肪酸合成酶起抑制作用的活性成分。

5.取玉米须300g，煎制，得玉米须的水提取物，测得可溶性固形物含量约40mg/ml。提取纯化大鼠脂酰辅酶A合成酶，测定此提取物对此酶活性的影响。结果表明：当上述可溶性固形物在测活体系中的浓度高于0.5mg/ml时，此酶的活性显著升高。证明玉米须中含有对脂酰辅酶A合成酶起激活作用的活性成分。

6.取大黄500g，乙醇回流，得大黄的乙醇提取物，测得可溶性固形物含量约20mg/ml。96孔板培养小鼠前脂肪细胞，显微观察细胞形态和油红0染色法确定细胞分化程度。结果表明，在上述浓度范围内大黄醇提取物对小鼠前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化有明显的抑制作用。证明大黄中含有对前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化有明显的抑制作用作用的活性成分。大黄醇提取物对小鼠前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的抑制作用见图1，其中A和A’为未分化的小鼠前脂肪细胞，细胞为梭形，细胞内无脂肪积累；B和B’为正在分化的小鼠前脂肪细胞，但其分化受到大黄乙醇提取物的抑制，细胞形状开始改变但不明显，细胞内有较少的脂肪积累；C和C’是完全分化了的小鼠脂肪细胞，细胞形状完全变圆，细胞内有大量脂肪积累。A、B和C是没有处理的细胞，与其相对应的A’、B’和C’分别是经油红0染色的细胞。