一种荧光试剂2－(N－咔唑基)－乙基氯甲酸酯

摘要

一种荧光试剂2－(N－咔唑基)－乙基氯甲酸酯,其结构式为见右式，本发明的荧光试剂,其荧光强度较大,衍生化速度快,要求的实验条件不苛刻,并且在检测过程中溶剂组成引起的背景干扰较低。

说明书

本发明涉及荧光试剂，特别提供了一种新的作为荧光试剂的化合物——2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯。

由于咔唑基的特殊结构性质，在已有的报道中，研究主要集中在对其量子性质的讨论方面。如π-电子的跃迁，溶剂性质对咔唑衍生物荧光性质的影响等。已被研究过荧光性质的咔唑衍生物结构见附表1。另一方面，咔唑与金属离子络合、与丙烯酸等共聚也可以得到具有特殊光学和电学性质的物质。以咔唑的简单衍生物如咔唑-N-乙酰氯等作为荧光衍生化试剂的研究也有报道。

本发明的目的在于提供一种荧光试剂2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯，其荧光强度较大，衍生化速度快，要求的实验条件不苛刻，并且在检测过程中溶剂组成引起的背景干扰较低。

本发明提供了一种荧光试剂2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯，其结构式为：

本发明还提供了上述荧光试剂2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯的制备方法，其特征在于按下述过程进行：

以路易斯碱为催化剂，在二甲基亚砜溶剂中，咔唑与碳酸亚乙酯反应得2-(N-咔唑基)-乙醇，催化剂的用量为咔唑重量的0.01～0.05％，咔唑与碳酸亚乙酯的摩尔比为1∶1.25～1.4，反应温度85-115℃，反应时间4-6小时；

在0-5℃反应温度下，2-(N-咔唑基)-乙醇在二氯甲烷溶液中与光气作用，搅拌反应15-20小时得目标产物2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯。

上述产物经重结晶纯化得2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯纯品，可用于表征和进一步衍生化反应实验。

反应方程式如下：

本发明通过量子化学模拟计算的方法，找出适合特定要求的荧光试剂结构2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯。以咔唑为母体采用适宜的反应条件，合成得到目标产物。由于在2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯分子中存在N原子介入的大π键，同时乙基氯甲酸酯基的协同效应，使其激发和发射波长显著红移，分子的摩尔吸光度增大，水溶性增强。也由于氯甲酸酯的适宜反应性和稳定性，使其更适宜于作为荧光衍生化试剂，用于非荧光样品的荧光检测，以较大的提高样品的检测灵敏度。

另外，本发明衍生化速度较文献相关的荧光试剂大大缩短，试剂具有较高的活性，对于几种实验样品，衍生化反应完成所需时间小于1min。对作为高效液相色谱衍生化试剂而言，与AQC等荧光衍生化试剂相比，前后洗脱组分的检测灵敏度差别很小，试剂的荧光量子效率较高。且试剂及衍生化产物的稳定性较好，可以满足多种目的的需要。

总之，本发明新型荧光试剂荧光强度较大，衍生化速度快，要求的实验条件不苛刻，由于激发和发射波长的显著红移，使检测过程中溶剂组成引起的背景干扰降低。下面通过实施例详述本发明。

附图1为2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯的质谱；

附图2为2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯的氢谱；

附图3为2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯的核磁共振谱图。

实施例

以0.02g的KOH为催化剂，在100ml的二甲基亚砜溶剂中，20g的咔唑与25g的碳酸亚乙酯反应，反应温度100℃，反应时间5小时，获得12g的2-(N-咔唑基)-乙醇，在0-5℃反应温度下，将2-(N-咔唑基)-乙醇溶于二氯甲烷溶液中，充光气至饱和，搅拌反应20小时得目标产物2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯。上述产物经重结晶纯化得9g的2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯纯品，可用于表征和进一步衍生化反应实验。2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯的质谱见附图1，2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯的氢谱见附图2，2-(N-咔唑基)-乙基氯甲酸酯的核磁共振谱见附图3。

1.衍生物的稳定性

室温下在硼酸缓冲液中(pH8.5～9.0)将甘氨酸与2-(9-咔唑基)-乙基氯甲酸酯进行衍生化，所得衍生物溶液的pH调至中性(pH＝7.0)，25℃避光保存衍生物稳定1周。衍生物在15％乙腈溶液中对其荧光光谱进行了测定，结果表明试剂本身与其衍生物的激发和发射波长基本相似，很可能是由于试剂分子中的活性基团与发色团处于相对独立的位置，换句话说，衍生物的形成并没有改变试剂分子发色团的共轭状况。不同流动相组成对衍生物荧光发射强度的影响见下表：

      溶剂    (乙腈/水)    最大波长   激发     发射  相对荧光强度      100     90/00     80/20     70/30     60/40     50/50     40/60     30/70     20/80     10/90  293，335  368  293，335  367  293，335  367  293，335  365  293，335  365  293，335  364  293，335  364  293，335  364  293，335  364  293，335  364     1.15     1.14     1.06     1.05     1.04     1.03     1.00     0.92     0.88     0.81

2.非水溶剂温度对荧光强度的影响

物质发射的荧光温度往往受到所处溶剂温度等环境因素的影响，这些影响往往又有专一性和规律性，利用其中规律可进行一些特殊测定，如利用荧光探针测定溶液温度具有极高灵敏度，也可测量微波辐射下的温度，可检测微小体系(如细胞)内的温度等。本实验在正丁醇的非水溶剂中对2-(9-咔唑基)-乙醇的荧光强度随温度变化的规律进行研究，结果发现荧光强度在10～75℃的范围内lnIem与1/T成良好的线性关系。根据Arrhenius方程式：所得该发光分子的发射稳定能为9.4KJ·mol^-1。3.不同温度在不同溶剂中的荧光强度

    溶剂    强度      强度      强度    强度     强度           (15℃)    (30℃)    (45℃)  (60℃)   (75℃)    甲醇    100        91        83      75       70    乙醇    100        91        82      73       69    丙醇    100        92        84      77       72  正丁醇    100        91        82      73       70  正戊醇    100        90        81      72       68