家蚕生产基因工程生白细胞药物的方法

摘要

本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产多肽类药物的技术领域,利用家蚕幼虫、蛹及蛾作为生物反应器,通过基因工程技术获得带有人的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM－CSF)基因的重组杆状病毒,使hGM－CSF基因在蚕体中高效表达,经过纯化、滤去病毒、－20℃冷冻干燥后,以家蚕血液和蛹或蛾为填充料配成口服药物的方法和技术。首次实现rhGM－CSF的口服药物的发明。该方法原料易得,生产成本低,疗效明显,实施价值重大。

说明书

本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产多肽类药物技术领域。

细胞集落刺激因子是一群对造血细胞的存活、繁殖和分化所必需的糖蛋白，hGM-CSF(human granulocyte macrophage colony stimulating factor)是其中的主要一种，它刺激颗粒细胞和集落细胞的生长。在临床上对艾滋病、先天性骨髓衰竭、白血病、骨髓移植等患者的恢复均有治疗和辅助治疗的效果。hGM-CSF更能有力地支持癌症患者进行强力化疗，促进骨髓从因化疗导致的抑制状态中迅速恢复。由于hGM-CSF在医学上的广泛用途，自80年代中期以来对hGM-CSF进行克隆化基因进行表达，以期获得大量的rhGM-CSF用以制备药物，成为世界各国关注的热点。据检索，1985年Wong等采用猴COS细胞系统进行了表达(Science 228:810-815)，虽然其产量比人体正常T细胞表达要高约30倍，但表达量仅约1毫克/L倍基左右。Miyajia(1986,EMBO-J 5:1193)和Shaw(1988 DNA 7(2):117)等使用酵母分泌表达系统分泌表达了人和鼠的GM-CSF，表达的GM-CSF存在有酵母特异的碳水化合物分枝，且表达量亦不高。大肠杆菌融合表达系统是目前国内外大多数研究机构和企业采用的工艺并已有产品问世，但是采用该工艺的关键限制因素在于形成包涵体，蛋白质变性和复性以及后处理工艺的繁琐操作，使其生产成本高，且药物仅限于注射剂。

本发明的目的是提供一种用家蚕幼虫、蛹、蛾为生物反应器，高效表达rhGM-CSF，所获得的重组hGM-CSF以蚕及蛹作为主要药用填料，制成口服药物，在鼠、猕猴体中的实验证明其有明确药效。本发明降低了生产成本，蚕幼虫和蛹表达rhGM-CSF适合大规模生产rhGM-CSF并制成口服药物。打破了活性蛋白质不能被肠道吸收产生作用的传统理论。

本发明所述的家蚕生产rhGM-CSF口服药物的方法是通过将hGM-CSF基因进行点突变，在其两端加上一个与载体相配的酶切位点，使之与家蚕杆状病毒载体连接后与野生型家蚕杆状病毒在家蚕细胞中重组，通过空斑筛选，获得重组的带有hGM-CSF基因的家蚕杆状病毒，通过人工接种家蚕幼虫、蛹、蛾，使之发病并经5-7天饲养后，收集家蚕幼虫体液和蛹体或，蛾，经匀浆、过滤离心分离去杂质后，冷冻干燥，在无菌条件下装入胶囊实现的。

下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容：

1、为了从pCK-hGM-CSF(为本发明申请人构建保存)中克隆出hGM-CSF，在基因5′端起始密码子上游和3′端终止密码子下游设计了如下PCR引物，并经PCR扩增获得突变的hGM-CSF基因。引物1:5′-TCTCTAGAGGATGTGGCTGGCTGCAG-3′,引物2:5′-GTTTCTGGATCTTGTTTCAT-3＇。

PCR参数设计如下：变性92℃,1min；复性50℃,1min；延伸72℃,1min,35个循环。试验所用的PCR Kit购自德国宝灵曼公司，操作方法如下：(1)一个小离心管中(0.5ml)，混合以下成分：10x缓冲液                     10μl4种dNTPs混合液(每种1.25mM)    16μl引物1(2μl)                   30pmoles引物2(2μl)                   30pmoles模板DNA(0.1-0.2μg)加双蒸水至100μl(2)将反应混合物，放置于94℃水浴变性模板DNA 5分钟。(3)加0.5μl Taq DNA聚合酶。(4)加100μl石蜡油于反应试管中，防止样品水份的蒸发。(5)将反应放入PCR仪中，按上述PCR参数条件设计35个循环。(6)反应完成后，从反应液中取10μl走电泳以鉴定扩增片段。

因在pCD-hGM-CSF质粒中基因的5′端和3′端均缺少可直接利用的酶切位点，加上hGM-CSF基因两端的非编码区序列也不符合杆状病毒载体高表达的要求，必须删除。设计用的PCR引物既引入合适的酶切位点，同时也删去了不必要的片段，达到了改建的目的。

2、用XhoⅠ从pCD-hGM-CSF中切出1.4kb片段，以此为模板进行上述PCR反应，扩增出长度为510bp的片段。反应产物用XbaⅠ酶切后，克隆进pUC18(宝灵曼公司产品)的XbaⅠ位点，经连接后，转化大肠杆菌TG1(Promega公司产品)菌株，用PstⅠ鉴定重组子，切出约510bp片段，表明克隆方向正确，获得重组子pU-CSF，对pU-CSF进行序列分析，表明PCR改建已达到目的，经序列分析(操作方法详见分子克隆第13章，科学出版社，1995)，该质粒的hGM-CSF结构基因的序列与原始序列完全相同。

转化是将外源DNA分子引入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法，它是微生物遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

本实验以E.coli TG1菌株为受体细胞，用CaCl₂处理使受体菌处于感受状态。

本实验用的pUC18质粒。它带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr和lacZ基因)。可能过Amp抗性和α互补两种特征来筛选转化子。

(1)试剂

①E.coli TG1菌株

②pUC18质粒DNA：宝灵曼公司产品。

③LB培养基：固体和液体培养基。

④氨苄青霉素母液：100mg/ml。

⑤含Amp的LB固体培养基：100μg/ml。

⑥含X-gal和IPTG的筛选培养基；

X-gal储液：48mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺，配制成48mg/ml储液，包黑纸，存于-20℃备用。

IPTG储液：96mg IPTG溶于1ml的灭菌重蒸水中，配成96mg/ml液，储存于-20℃备用。

在100ml LB固体培养基中50℃时加50μl X-gal储液和50μl IPTG储液，混匀，37℃放置4-7小时，使液体完全被吸收。4℃保存备用。

X-gal是5-溴-4氯-3-吲噌-β-α-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)，它经半乳糖苷酶(β-galactosidase)水解后生成的吲噌衍生物而显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside)，为非生理的诱导物，它可以诱导LacZ的表达。    

⑦75mM CaCl₂溶液

(2)受体菌的培养

从LB平板上挑取新的活化后的E.coli TG1单菌落，接种于5ml LB液体培养基中37℃下振荡培养12小时左右，取1ml培养液转入5或100ml LB中，37℃振荡培养2-3小时至对数生长期OD₆₀₀c=0.5左右。

(3)感受态细胞的制备

①将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟。

②置于4℃,5000rpm离心10分钟，倒尽上清。

③用预冷的75mM的CaCl₂溶液少许轻轻悬乳细胞，加一半菌液体积的CaCl₂，冰上放置30分钟。

④4℃,3000rpm离心10分钟，弃去上清。

⑤加入200μl(5ml体积培养)或1ml(100ml体积培养)预冷的75mM的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置4小时，即成感受态细胞悬液。

⑥将以上感受态细胞按200μl分装成小份，放冰上。新鲜的感受态细胞在4-24小时之内可直接用于转化。

3、用BamHⅠ和HindⅡ在37℃水浴温度作用下从质粒pU-CSF中切出长约510bp的hGM-CSF结构基因片段，该片段与pBM030(Maeda,Nature,1995)通过T4连接酶连接，插入家蚕重组病毒转移载体pBM030 BglⅡ和EcoRⅤ位点，连接后的产物转化TG1后筛选重组子，用XbaⅠ和PstⅠ鉴定插入方向，凡被XbaⅠ切出约510bp片段并经电泳结果证明的说明GM-CSF基因的转录方向和多角体蛋白基因启动子一致，由此获得GM-CSF基因的表达型转移质粒pBM-CSF。详细操作步骤见分子克隆(科学出版社，1995)。

4、将重组转移质粒pBM-CSF DNA与野生型Bm NPV DNA共转染家蚕培养细胞Bm-N(本实验室保存株)，经多轮的Occ-空斑筛选和纯化，得到了含有hGM-CSF基因的重组病毒Bm NPV(CSF)。按Summers等的方法(Texas Agricultural Experimentstation,use 1987)，具体操作步骤如下：

把1μg野生家蚕核型多角体病毒(BmNPV)粒子DNA和2μg质粒pBM-CSF DNA的混合物与Bm-N细胞放在一起转染。转染之后3-4天很多细胞将出现多角体，位于细胞核中，病毒(ECV)滴度为10⁷pfu/ml。感染细胞用250-400倍的倒置显微镜可以观察到。

重组病毒占整个病毒量的0.1％-5％。重组病毒筛选和纯化通常需要2-3轮空斑纯化。在转染后3-4天。收集培养细胞，细胞离心后(1000-2000rpm/5min)将含病毒的培养基置4℃保存。用新鲜的培养基对病毒进行系列稀释，稀释成2ml的10^-7、10^-6和10^-5系列，每个稀释浓度(1ml/皿)接种二块琼脂糖培养皿，培养3-4天后，可以用低倍解剖显微镜观察到空斑。把平板倒置在一个黑色背景下。在一个角的边缘放置一个强的光源照亮平皿。感染2-3天后可见到噬菌斑，5天后空斑充满整个平板。

筛选重组病毒采用光学检测无包被病毒空斑、病毒空斑滤膜原位杂交技术(详见分子克隆，科学出版社，1995)。

鉴定出若干个重组病毒空斑之后，用一个1000μl的移液管或无菌巴氏移液管从琼脂上取出这些空斑，并将琼脂块转移到1ml的培养基中。从一个斑中可以获得大约10000pfu的病毒粒子。在培养基中稀释样品至10-100pfu/ml(10^-1-10^-3稀释)。用1ml的各种稀释浓度接种二份相同的平皿，然后用琼脂糖铺胶。4-5天后琼脂糖平皿上将出现空斑。通常，重组体即无包被病毒出现的百分率很高。如上所述，用解剖显微镜来观察和选择那些折射比较小的空斑，用倒置组织培养显微镜(250-400倍)进一步仔细地观察这些空斑，在筛选之前，一开始先观察由野生型BmNPV病毒形成的空斑来熟悉在感染细胞中出现的病毒多角体包被，无包被病毒(重组体)空斑在感染细胞中不会含有任何多角体，从细胞形态学上又可以明显地区别于周围未经野生病毒感染细胞。如仍然不能充分地筛选出重组病毒空斑，可以辅助以斑点杂交法(详见分子克隆，科学出版社，1995)来进行筛选。

重组病毒空斑一旦被鉴定出来，把平皿放在解剖镜下观察，找出一个分离比较好的空斑(至少离野生型斑几个毫米)，用一个100-200μl移液枪枪头吸起空斑，并直接悬浮到一个25cm²装有5ml 1×10⁶个细胞的培养基的瓶中，经3-4天培养后为接种的重组病毒所感染。病毒滴度大约为10⁸pfu/ml，用倒置显微镜非常仔细的检查这些细胞是否带有病毒多角体，如果有多角体存在，这种病毒要重新进行进一步纯化。我们通常用一个1.5ml螺旋盖的冷藏管保存1ml无细胞的感染培养基于-80℃，作为永久保存材料。剩下的培养基可以保存于4℃，这样就获得了重组病毒。

5、用重组病毒Bm NPV(CSF)感染Bm-N细胞，27℃培养48小时后，取上清，用碱变性法制备模板，经PCR法扩增出510bp左右长度的片段与从质粒pUC-CSF中扩增的片段大小完全一致(方法同上)。由此表明重组病毒包含了完整的hGM-CSF基因。

6、为了确证Bm NPV(CSF)的表达产物是否属于分泌型的，将BmNPV(CSF)感染Bm-N细胞，27℃培养84小时，在细胞开始裂解前，收获细胞和上清液，分别进行hGM-CSF的生物活性检测，在细胞和上清液中均检测到很高的GM-CSF活性。

7、用ELISA法测定感染Bm NPV(CSF)家蚕幼虫血液和蛹体上清，感染72小时后hGM-CSF开始表达，以后血液和蛹上清中的hGM-CSF含量直线上升，至感染后108小时表达量达到高峰。

8、用重组病毒接种家蚕五龄起蚕，在感染后5-7天采取蚕体液和蛹体，经高速离心(12000rpm,30分钟)，取上清经超速离心(35000rpm,30分钟)，收集上清，过分子筛柱，收集活性峰后，过MonoQ柱，收集活性峰，经过超滤浓缩获纯品。

本发明所构建的重组病毒Bm NPV(CSF)在蚕体中表达的hGM-CSF经过ELISA检测和生物活性测定，每毫升人工饲料家蚕的血淋巴的表达量2.7×10⁵单位/ml，桑叶饲育的达8×10⁵单位/ml蚕血液，纯品活性为2×10⁷单位/mg，纯度90％以上。

蛹体中的表达产物进行体外TF-1依赖性细胞测活，活力平均为2×10⁷/蛹，蚕蛹中的表达产物蛋白印迹的结果为分子量为25kD左右，与天然的hGM-CSF分子量相近，糖基化程度也与天然的相似。

9、将感染重组病毒后的幼虫血液和蛹经过过滤后，经低温干燥后，在无菌条件下按GMP标准制备成口服胶囊(BG-Ⅰ)和口服液(BG-Ⅱ)。

10、将制成的口服胶囊(BG-Ⅰ)和口服液(BG-Ⅱ)进行小鼠口服升白效果试验，结果如表1-3所示：

说明：ICI小鼠，体重16-18g,4周龄，每次150只，♀♂各半，每天活杀5只，白细胞计数后取平均值。化疗剂量：300mg/Kg，注射生白能剂量：5μg/kg/D，口服BGⅡ:40万单位/D。

11、口服胶囊(BG-Ⅰ)进行猕猴口服升白效果，如图所示，结果均表明该药的升白效果明确。化疗剂量：50mg/kg，生白能剂量：10μg/kg/D,BG-Ⅱ:150万单位/kg/D。

表1化疗后注射生白能和口服BGⅡ效果对比实验

                         化疗剂量：300mg/kg

                         注射生白能剂量：5μg/kg/D

                         口服BGⅡ:40万单位/D

处理/日期11.7 11.8 11.9 11.10 11.11 11.12 11.13 11.1411.15化疗注射生白能♂136 110 120 230 40 101 160 260 261化疗注射生白能♀160 99 101 200 45 80 130 300 256化疗喂BGⅡ♂139 167 124 258 43 98 167 263 254化疗喂BGⅡ♀161 100 103 189 36 49 120 363 248化疗对照♂139  93  95 124 120 28 132 271 192化疗对照♀161 100  87 107 85 65 64 114 154正常对照♂122 126 138 143140136 126 142 138正常对照♀160 152 160 148138140 136 141 138

表2不同处理后给药的生白效果

处理/日期11.21 11.22 11.23 11.24 11.25 11.26 11.27 11.28 11.29♂化疗喂BGⅡ   85    74    48  56 179 182 545 301.7 298♀化疗喂BGⅡ   78    87    32  24  88 202 495 224 343♂化疗对照   87   118    43  84  53  28 459 510 519♀化疗对照   45    59    65  70 101  65 483 326 299♂不化疗喂BGⅡ  132   314   239 335 289 209 341 312 291♀不化疗喂BGⅡ  122   282   225 226 213 343 468 520 423正常对照♂  142   148   138 143 140 136 126 142 138正常对照♀  160   152   160 148 138 140 136 141 138

试验结果表明效果明确(见下表)

    表3正常小鼠给药24小时后白细胞增长情况

    BG-Ⅰ    BG-Ⅱ对照(清水)正常对照♂    286    283    141    130♀    321    340    145    140