DNA序列及其编码的乳房特异性乳腺癌蛋白

摘要

本发明公开的是一种纯化和分离的DNA序列及其编码的乳房特异性蛋白质即乳房珠蛋白。同时还公开了一种基于乳腺癌细胞超量表达和分泌乳房珠蛋白来检测乳腺癌的方法。该方法检测和/或定量乳房珠蛋白或编码乳房珠蛋白的mRNA的存在。

说明书

发明背景(1)方面领域

本发明主要涉及乳腺癌病理领域，更具体地说，涉及一段cDNA序列及其编码的用于检测和治疗乳腺癌的乳房特异性蛋白。(2)相关技术的说明

乳腺癌是最常见的致死性癌症之一。虽然，早期诊断和治疗能降低该疾病的发病率和死亡率，但是乳房X照相术的阳性预测值据估计仅为25％(Hall等，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med)327：319-328，1992，在此参考)。所以，最好有一种方法能够在用乳房X照相术检测前检测出癌症，而遗传或生物化学标记可能能够提供这类补充和提高乳房X照相术阳性预测值的方法。(Hayes，HematolOncol Clin N Am 8：485，1994，在此参考)。

乳腺癌的发展伴随着许多遗传改变(参见Porter Jordan，Hematol Oncol Clin NAm 8：73，1994，在此参考)。这类改变包括染色体总体改变和遗传标记的丢失(Devilee等，《生物化学和生物生理学学报》(Biochim Biophys Acta)1198：113，1994；Callahan等，《细胞生物化学杂志增刊》(J Cell Biochem Suppl)17：167，1993，在此参考)。乳腺瘤形成的发展也被证明会导致已鉴定的表达生长因子及其受体(Zajchowski等，《癌症研究》(Cancer Res)48：7041，1988，在此参考)、结构蛋白(Trask等，《美国科学院院报》(Proc Natl Acad Sci)87：2319，1990，在此参考)、第二信使蛋白(Ohuchi等，《癌症研究》26：2511，1986，在此参考)和转录因子(Harris，《癌症研究进展》(Adv Cancer Res)59：69：1992，在此参考)的基因表达上的质变和量变。这些基因表达上的改变可能潜在地构成发展乳腺癌标记的基础，尽管在病人的活组织检验样品中，对这些基因的改变在乳腺癌病理方面的确切作用还知之不详。

除了提供乳腺癌的遗传或生物化学标记用于早期诊断之外，最好能有一种肿瘤标记能够对预后进行评价，即用于选择和评价治疗的方法和用于导向治疗的方法。虽然已经鉴定出了许多组织标记，但是都不够敏感或缺乏肿瘤特异性，因而不适用于诊断或筛选一般性人群(同上)。所以，一直以来都需要有一种乳腺癌标记例如基因及其表达蛋白，能够特异性和选择性地检测出病人体内乳腺癌的出现和病理发展。

利用改动过的差异显示聚合酶链反应技术来分离乳腺癌的差异表达序列标记分离出几个序列片段，与正常组织对照相比，它们独特地在瘤形成性乳腺上皮组织中表达(Watson和Fleming，《癌症研究》54：4598-4602，1994，在此参考)。这类序列标记中之一被发现并被鉴定为DEST002，由此发现和分离出了新的全长cDNA及其编码的现在被称为乳房珠蛋白(mammaglobin)的蛋白质。该cDNA和蛋白质都是新的。本发明综述

所以，本发明主要涉及鉴定新的在乳腺癌中表达增加的基因的鉴定，和由这些基因的mRNA分离cDNA。所以，申请人已经成功地发现了一段新的cDNA及其编码的乳房特异性分泌蛋白即乳房珠蛋白。cDNA是纯化及分离形式的，经鉴定为SEQ ID NO：1，其编码的蛋白，乳房珠蛋白是纯化及分离形式的，经鉴定为SEQ ID NO：2。

在原发性乳腺癌肿瘤的I期，乳房珠蛋白超量表达27％。这表明乳房珠蛋白基因的失调多发于乳腺癌的早期。所以，乳房珠蛋白及其cDNA的发现为发展用于检测和治疗人和其它哺乳动物乳房瘤形成性疾病的新方法和新组合物提供了基础。

所以，本发明还涉及用于检测样品中乳房瘤形成性细胞存在的新方法。在实施方式之一中，编码乳房珠蛋白的cDNA或所述cDNA的衍生物被用于检测样品中乳房珠蛋白mRNA的存在。该方法包括以下步骤：(a)提供包含SEQ ID NO：1序列或其衍生物的聚核苷酸，(b)在一定条件下将核苷酸序列与样品一起孵育，使得该序列能够与来自乳房瘤形成性细胞的mRNA杂交，和(c)检测DNA-RNA杂交复合物的存在。

本发明的另一方面内容提供了用于检测样品中乳房瘤形成性细胞存在的试剂盒。该试剂盒包含包装于容器中一段含有SEQ ID NO：1序列或其衍生物的聚核苷酸。

在本发明另一实施方式中，乳房珠蛋白或其衍生物被用于检测样品中由乳房珠蛋白mRNA逆转录而成的cDNA的存在。该方法包括以下步骤：(a)在取自病人的样品中用逆转录法由mRNA生成cDNA，(b)提供两段寡聚物作为聚合酶链反应的引物，它们位于编码乳房珠蛋白的cDNA的两侧或位于其中，和(c)利用聚合酶链反应扩增编码乳房珠蛋白的cDNA。两段寡聚物包含SEQ ID NO：3和SEQID NO：4。

本发明另一实施方式提供了用于检测样品中乳房瘤形成性细胞存在的试剂盒。该试剂盒包含包装于容器中的作为聚合酶链反应的引物的两段寡聚物，它们位于编码乳房珠蛋白的cDNA的两侧或位于其中。两段寡聚物包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

在本发明的另一实施方式中，用蛋白质即乳房珠蛋白的特异性抗体在样品中检测由肿瘤细胞表达的乳房珠蛋白的存在。这种特异性抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。

所以，在本发明的优点中值得注意的是提供了能够作为乳腺癌细胞标记的一段核苷酸序列及其编码的氨基酸序列；提供了早期检测乳房瘤形成性细胞存在的方法；提供了能够对乳房X照相术进行补充并提高阳性预测值的检测乳腺癌的方法；和提供了能够评价预后的方法；和提供了导向治疗的标记。附图说明

图1显示利用cDNA末端快速扩增(RACE)聚合酶链反应技术(PCR)分离全长乳房珠蛋白cDNA的方法，然后亚克隆到载体pGEM7Z和pCEV27中。

图2显示人cDNA序列SEQ ID NO：1(核苷酸编号在上方)及其编码的乳房特异性蛋白即乳房珠蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO：2(氨基酸编号在下方)，实线表示用RACE PCR方法分离得到的403bp片段(SEQ ID NO：5)，空心线表示206bp的DEST002序列(SEQ ID NO：6)。

图3显示乳房特异性蛋白即乳房珠蛋白(hMAM)(SEQ ID NO：2)与大鼠前列腺甾体结合蛋白亚基C3(rPSE3)(SEQ ID NO：7)和人克拉拉细胞10KD蛋白质(hCC10)(SEQ ID NO：8)进行的比较，相同的氨基酸以粗体字母和双线标出，结构类似的氨基酸以单线标出；

图4显示(A)编码乳房特异性蛋白即乳房珠蛋白(hMAM)的人cDNA序列与乳房瘤形成性组织、正常乳房组织和其它成人组织表达的mRNA杂交的Northern印迹测定；和(B)来自乳房瘤形成性组织、正常乳房组织和其它成人组织的RT/PCR扩增的组织样品的分析；

图5显示乳房特异性cDNA序列在体外兔网织红细胞裂解物分析系统中的翻译；

图6显示利用编码乳房珠蛋白的cDNA在肿瘤2410，在来自其它8位病人中3位的肿瘤中(以粗体表示)，以及在较少的进行比较的两例正常乳房组织中(以斜体表示)检测mRNA的Northern印迹杂交分析，以及在肿瘤组织和病人的正常组织中的乳房珠蛋白的表达；

图7显示在用于产生多克隆抗体的肽不存在(-)和存在(+)下，来自MDA-MB-415乳房肿瘤细胞的条件培养基(S)和细胞裂解物(C)的16个C末端氨基酸(SEQ IDNO：14)的多克隆抗体的Western印迹分析；

图8显示人乳房肿瘤细胞的细胞裂解物的Western印迹分析，即用16个C末端氨基酸(SEQ ID NO：14)的多克隆抗体和山羊抗兔抗体检测乳房珠蛋白，并利用酶联化学发光进行目测；

图9以彩色显示来自病人样品的乳腺癌细胞的石蜡固定切片，切片用以辣根过氧化物酶标记的16个C末端氨基酸(SEQ ID NO：14)的多克隆抗体和山羊抗兔抗体和底物DAB进行免疫组织化学染色，表达乳房蛋白的细胞被染成棕色；

图9A以黑白显示来自病人样品的乳腺癌细胞的石蜡固定切片，切片用以辣根过氧化物酶标记的16个C末端氨基酸(SEQ ID NO：14)的多克隆抗体和山羊抗兔抗体和底物DAB进行免疫组织化学染色，表达乳房蛋白的细胞被染成棕色。优选实施方式的说明

本发明内容之一是基于对经鉴定为SEQ ID NO：1的cDNA的鉴定与测序，它编码经鉴定为SEQ ID NO：2(图2)的乳房特异性分泌蛋白即乳房珠蛋白。如后文所述，乳房珠蛋白的全长cDNA由肿瘤细胞的mRNA逆转录分离得到，利用PCR技术扩增，然后亚克隆在表达载体中。此外，对该cDNA编码的蛋白质即乳房珠蛋白进行了鉴定与描述。

利用被称为DEST002的匿名序列标记证明了至今尚不了解但在本文中被称为乳房珠蛋白的相应基因产物在乳腺癌肿瘤细胞系MDA-MB-415中特别丰富。为了分离全长的乳房珠蛋白cDNA，逆转录该细胞系的mRNA并利用RACE PCR技术进行克隆(Edwards等，《核酸研究》(Nucleic Acid Research)19：5227-32，1991，在此参考)。该技术是基于将寡聚脱氧核苷酸与单链cDNA的3’末端连接的策略。图1图示了用于分离乳房珠蛋白cDNA的这一方法。由利用该技术分离的403bp片段的序列信息(SEQ ID NO：5)(图2)，结合在我们以往的研究中由相应的DEST序列获得的序列信息(DEST002，SEQ ID NO：6)(Waston和Fleming，同上)，推导出了全长503bp的cDNA序列(SEQ ID NO：1)。图2表示了全长乳房珠蛋白cDNA及其编码的多肽。在503bp的cDNA内有一个279bp可读框，它编码一个预计分子量为10.5kD的93个氨基酸的多肽(图2)。该可读框的起首19个氨基酸还预示着一段疏水肽信号序列。该可读框的起首甲硫氨酸包含一段近乎全同的Kozak共有序列(Kozak，《细胞》(Cell)22：7-8，1980，在此参考)。该序列的60bp上游不包含其它框内甲硫氨酸或翻译终点。cDNA的3’端非翻译序列共163bp并包含一个聚腺苷酸化信号即AATAAA，位于原DEST002序列起始位点上游12bp。以上数据表明分离出的是全长乳房珠蛋白cDNA。

利用BLAST算法在基因库(Genbank)中查找与乳房珠蛋白cDNA相似的DNA序列没有发现明显的同源DNA序列。这样，可以认为乳房珠蛋白cDNA是一段新的、至今尚未为人所知的序列。

在其它多肽中查找与乳房珠蛋白相关的序列发现在乳房珠蛋白和其它多肽间存在氨基酸序列同源性。乳房珠蛋白与大鼠前列腺甾体结合蛋白(前列腺蛋白)亚基C3(rPSC3)(图3)(SEQ ID NO：7)具有42％的氨基酸一致性(包括保守性取代则为58％)。大鼠前列腺甾体结合蛋白是大鼠前列腺中的一种主要分泌蛋白，是由两个不同的二聚体亚基：C3/C1和C3/C2(Parker等，Ann N Y Acad Sci 348：115-124；Parker等，《甾体生物化学杂志》(J Steroid Biochem)20：67-71，1984，在此参考)构成的四聚体蛋白。C1、C2和C3基因都编码约6kD的分泌蛋白，并将此认为是基因复制的结果，但虽然C1和C2具有很高的同源性，它们与C3却大不相同。所以，乳房珠蛋白与C1和C2蛋白不具有序列同源性。

如上所述，前列腺甾体结合蛋白(前列腺蛋白)是大鼠前列腺中的一种主要分泌蛋白，而且其表达受雄激素甾体调控(Parker等，Ann N Y Acad Sci 438：115-124；Parker等，《甾体生物化学杂志》(J Steroid Biochem)20：67-71，1984，在此参考)。据报道，有另一种蛋白即人雌二醇氮芥结合蛋白(hEMBP)在人前列腺、人乳腺癌和人恶性黑素瘤中表达(Bjork等，《癌症研究》(Cancer Res.)42：1935-1942，1982；Bjork等，《抗癌研究》(Anticancer Res)11：1173-82，1991，在此参考)。人雌二醇氮芥结合蛋白与大鼠的雌二醇氮芥结合蛋白在免疫化学上相似，后者据估计与大鼠甾体结合蛋白即前列腺蛋白相同。如上所述，乳房珠蛋白表现出与前列腺蛋白C3亚基具有42％的氨基酸序列一致性和包括保守性取代的58％同源性。所以，乳房珠蛋白可能在一定程度上与hEMBP相关。但是，虽然在前列腺中同时检测到了前列腺蛋白和hEMBP，但该组织中完全没有乳房珠蛋白mRNA。因此，乳房珠蛋白即不是与hEMBP相同的蛋白也不是其亚基，而且，由于还没有确定hEMBP的序列，甚至还不知道乳房珠蛋白与hEMBP的某些片段或亚基是否具有任何相似性。

虽然最近的报道证明与SV40 T抗原融合的rPSC3启动子在转基因鼠中即造成前列腺癌又造成乳腺癌(Maroulakou等，《美国科学院院报》91：11236-11240，1994；Sandmoller等，《癌基因》(Oncogene)9：2805-2815，1994，在此参考)，但该蛋白的确切生物学功能尚不清楚。此外，虽然假定了大鼠的前列腺甾体结合蛋白与人EMBP之间的关联，但是还没有对与rPSC3对应的人多肽或人基因进行过鉴定。所以，乳房珠蛋白及编码乳房珠蛋白的cDNA代表着迄今未知的新序列。

人工将BLAST分值较低的其它序列与乳房珠蛋白和rPSC3序列对齐，我们发现了与人克拉拉细胞10kD蛋白(hCC10)(SEQ ID NO：8)(Peri等，《临床研究杂志》(J Clin.Invest)92：2099-2109，1993，在此参考)(图3)，以及与兔和小鼠子宫珠蛋白的同源性(Miele等，《内分泌综述》(Endocrine Rev)8：474-90，1987；Cato和Beato，《抗癌研究》5：65-72，1985；Miele等，《(内分泌学研究杂志》(J.Endocrinol.Invest.)17：679-692，1994，在此参考)。根据种的不同，这些同源性为26％全同或包括保守性取代的40％同源性。尤其是，许多氨基酸在各种蛋白质中完全保守，其中包括已知在子宫珠蛋白亚基间二硫键形成中起一定作用的Cys-3和Cys-69(见后文)。这些同源性表明乳房珠蛋白是由上皮细胞分泌的一个蛋白质小家族中的一个新成员(Miele等，1994，同上)。

hCC10基因是兔和小鼠子宫珠蛋白基因的人同源基因(Peri等，《临床研究杂志》92：2099-2109，1993，在此参考)。子宫珠蛋白最早被认为是特征性存在于兔子宫中的一种分泌蛋白，但此后被发现存在于包括肺、乳房和前列腺在内的其它上皮器官中。与大鼠前列腺蛋白不同，子宫珠蛋白是一种同二聚体蛋白，通过保守性残基Cys-2和Cys-69处的二硫键偶合而成(Miele等，1994，同上)。虽然子宫珠蛋白基因的转录是由甾体类激素调控的，但是蛋白质本身与孕酮或其它甾体类激素结合的能力还不确定，而且其确切的生物功能也是未知的(Miele等，1994，同上)。

乳房珠蛋白的表达仅限于在乳腺中。这与以下结果即rPSC3在大鼠前列腺中表达(Parker等，Ann N Y Acad Sci 438：115-1124，1984)，和hCC10/子宫珠蛋白在包括肺、子宫、前列腺和乳房在内的许多组织中表达(Miele等，1987，同上；Cato和Beato，同上；Miele等，1994，同上)相对照。由于乳房珠蛋白与以上蛋白质之间的序列同源性，我们确定其表达方式是组织特异性的。500bp的乳房珠蛋白信使在肿瘤样品2410(原序列标记即从该组织中分离)中很容易被检测到，但在正常的人乳腺组织中则少得多(图4)。在无限繁殖的乳腺上皮细胞系B5-589中不能检测到乳房珠蛋白信使。在有子宫珠蛋白表达的人子宫和肺这两个位置也检测不到乳房珠蛋白的表达。

利用RT/PCR扩增在肿瘤2410和正常乳腺组织中都检测到了乳房珠蛋白mRNA，而在其它15种受检组织中则没有，其中包括通常表达rPSC3和子宫珠蛋白的组织(肺、子宫、前列腺)、激素应答性和甾体生成性组织(卵巢、睾丸、胎盘)和其它分泌性上皮器官(结肠)(图4B)。所以，乳房珠蛋白mRNA的表达具有相对乳房组织特异性。

根据这一方面的研究，乳房珠蛋白是一种相对乳房特异性蛋白质。另外两种已知在乳腺癌中超量表达的基因是erb-B和细胞周期蛋白D(Jardines等，《病理生物学》(Pathobiology)61：268-282，1994；Keyomars和Pardee，《美国科学院院报》90：1112-1116，1993，在此参考)。与erb-B和细胞周期蛋白D的超量表达不同，乳房珠蛋白的超量表达可能反映一种更特殊的乳房上皮细胞的改变而不是一般性的生长能力或有丝分裂速度的提高。因此，乳房珠蛋白基因失控的发生可能更特异性的表明肿瘤的治疗脆弱性或临床病程。

在一步RT/PCR检测的灵敏度水平上，在正常淋巴结或外周淋巴细胞中不能检测到乳房珠蛋白的表达。这表明外周淋巴结中的乳房珠蛋白转录产物分析可用于检测隐含的乳腺癌转移，这与其它上皮特异性基因一样(Schoenfeld等，《癌症研究》54：2986-90，在此参考)。

为了证明乳房珠蛋白cDNA编码一种可翻译蛋白，在一体外翻译系统中使用cDNA克隆。图5显示得自用乳房珠蛋白cNDA处理的兔网织红细胞裂解物的蛋白质产物。用乳房珠蛋白cNDA生成了一种约6kD的蛋白质。表观分子量低于概念上翻译可读框的预计值，但是这一结果在兔和人的子宫珠蛋白翻译产物中也经常发现。

虽然我们在一种肿瘤样品(即2410)中发现了乳房珠蛋白的超量表达，但对这种超量表达在其它乳腺癌中的出现频率还不清楚。所以，我们用乳房珠蛋白cDNA探针进行的Northern印迹杂交对一组15种不同组织学类型的I期原发乳腺癌进行了检查。由于环境影响可能造成表达的潜在改变，我们又试图将肿瘤样品与相应病人的正常乳房组织样品直接对照，但是这在许多病例中无法做到。如图6所示，在正常乳房组织和肿瘤2410中再次检测到了500bp的乳房珠蛋白mRNA。还在其它三中肿瘤中检测到了乳房珠蛋白，其中两种在相应病人的正常组织中表达很少或不表达。总体上，被检的15个肿瘤中有4个(27％)超量表达乳房珠蛋白mRNA。以上数据表明乳房珠蛋白的超量表达并不仅限于单一肿瘤样品，实际上它在原发乳腺癌中相当常见。而且，所有被检肿瘤都是I期的这一事实表明这种失调在乳腺癌的发展进程中出现得较早。

因为申请人认为乳房珠蛋白很可能是一种分泌蛋白，所以预计可以在其肿瘤超量表达该基因产物的病人血清中检测其存在。因此，乳房珠蛋白很可能临床用作前列腺特异性抗原(PSA)和其它实体肿瘤标记，用于治疗患有乳腺癌的病人(“诊断病理学中的肿瘤标记”《临床实验室医学》(Tumor markers in diagnosic pathology，Clin Lab Med10：1-250，1990，在此参考)。

我们通过在每一种原发乳腺癌中检测乳房珠蛋白的表达来确定在一般性乳腺癌肿瘤人群中以乳房珠蛋白的高发性作为肿瘤标记。虽然该研究中检查的样品数量较小，但是27％的被检肿瘤超量表达乳房珠蛋白mRNA。该百分比可以与其它遗传改变例如erb-B扩增和p53突变的高发性相比(Slamon等，《科学》(Sci.)244：707-712，1989；Thor等，J Nat’l Cancer Inst 84：845-855，1992，在此参考)。而且，因为我们将分析限定在I期肿瘤，所以乳房珠蛋白的超量表达实际上比报道的这一肿瘤亚组中的其它遗传改变更多见(Alllerd等，J Nat’l Cancer Inst85：200-206，1993，在此参考)。

确定以乳房珠蛋白作为乳腺癌标记提供了本发明另一方面内容的基础，这一方面的内容涉及检测病人体内乳腺癌存在的方法。“检测”在本文中有关检测乳腺癌疾病的内容中倾向于包括确定病人体内乳腺癌的存在，将乳腺癌与其它疾病相区别，估计预后即疾病的可能结果和恢复的前景，对疾病状态或疾病复发的监测，确定适合病人的优选治疗方案和导向抗肿瘤治疗。

检测乳腺癌的方法包括聚核苷酸与来自乳腺癌细胞的mRNA杂交。聚核苷酸包含SEQ ID NO：1或其衍生物。衍生一核苷酸序列指在以下方面衍生后的序列与被衍生的原序列基本相同，即衍生后的序列与被衍生的原序列具有充分的序列互补性由此能够在原序列与来自乳腺癌细胞的mRNA杂交的相同严紧性条件下与来自乳腺癌细胞的mRNA杂交。

衍生核苷酸序列不一定由核苷酸序列进行物理衍生，而可以利用包括例如化学合成或DNA复制或逆转录或转录在内的任意方法产生。

为了在检测乳腺癌的检测系统中检测编码乳房珠蛋白的mRNA的存在，需由病人获取一份样品。样品可以是组织活检样品或血液、血浆、血清等样品。可以处理样品以抽提其中包含的核酸。对得到的核酸进行凝胶电泳或其它大小分离技术。

检测包括将核酸尤其是样品的mRNA与作为形成杂合双链的探针的DNA序列接触。“探针”指这样的结构即其中包含的一段聚核苷酸序列，因为探针序列与靶区域内一段序列的互补性而与靶序列形成杂合结构。

通常使用标记过的探针来检测形成的双链。或者，探针可以是非标记的，而直接或间接地与标记过的配体特异性结合后成为可检测的。用于标记探针和配体的合适标记和方法是本领域已知的，其中包括例如可用已知方法(例如缺口平移或激酶法)加入的放射性标记、生物素、荧光基团、化学发光基团(例如dioxetanes，尤其是引发后的dioxetanes)、酶、抗体等。

在使用编码乳房珠蛋白或其衍生物的cDNA为探针时，为了防止假阳性可以使用高严紧性条件。在使用衍生自乳房珠蛋白的序列时可以使用低严紧性条件。杂交的严紧性取决于杂交和洗涤过程中许多因素，其中包括温度、离子强度、时间和甲酰胺的浓度。以上因素在例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，第2版，1989)中有所论述。

为了提高在编码乳房珠蛋白的mRNA样品中的检测灵敏度，可以使用逆转录/聚合酶链反应(RT/PCR)技术来扩增转录自编码乳房珠蛋白的mRNA的cDNA。RT/PCR方法在本领域是众所周知的(参见例如Watson和Fleming，同上)。

可以如下进行RT/PCR。用例如异硫氰酸胍法分离总细胞RNA并逆转录总RNA。逆转录法涉及利用逆转录酶和一段3’未端引物以RNA为模板合成DNA。通常，引物包含寡聚(dT)序列。然后用PCR和乳房珠蛋白特异性引物扩增由此生成的cDNA(Belyavsky等，《核酸研究》17：2919-2932，1989；Krug和Berger，《酶学方法》(Methods in Enzymology)，Academic Press，N.Y.第152卷，pp.316-325，1987，在此参考)。

用两段与待扩增DNA序列两侧互补的寡核苷酸引物进行聚合酶链反应。上游和下游引物一般长20至30碱基对，并与两侧区域杂交以复制核苷酸序列。在脱氧核苷三磷酸或核苷酸类似物存在下由DNA聚合酶催化聚合反应，生成双链DNA分子。然后利用任意一种变性方法例如物理法、化学法或酶法来分开双链。一般使用物理方法即通常将核酸加热至约80℃至105℃保温约1至10分钟。按要求的循环次数重复该过程。

选择与扩增cDNA链基本互补的引物。所以，引物不必完全反映模板的序列，但必需具有足够的互补性与扩增链选择性杂交。

扩增后，用溴乙锭染色来检测PCR产物(Sambrook等，1989，同上)。

在本发明另一实施方式中，乳房珠蛋白cDNA序列或其衍生物可用于在乳腺癌病人的样品中鉴定任意一种乳房珠蛋白基因的改变(即基因重排、基因扩增或基因缺失)。由此提供了一种方法，没有完整mRNA的病人样品也可以籍此检查基因结构的改变。

在本技术用途之一中，乳房珠蛋白或其衍生物与分离自病人的肿瘤、正常组织或淋巴细胞并经一种或多种限制性内切酶消化的基因组DNA杂交。该测定法利用本领域熟知的Southern印迹检测病人或病人的乳房肿瘤是否具有缺失的、重排的或扩增的乳房珠蛋白基因。检测以上改变可以为预测预后和为病人的治疗方法提供重要信息。

在本技术用途之二中，可以在聚合酶链反应中使用一对或多对寡核苷酸引物来扩增来自病人样品的乳房珠蛋白基因片段。对生成的PCR产物的分析显示是否乳房珠蛋白的某一特定片段被缺失或重排。这类信息对预后和病人的治疗是有用的。

本发明还提供了在取自病人的样品中检测存在多肽、乳房珠蛋白的方法。本领域已知的任意蛋白质检测方法均可使用。这些方法包括但不限于免疫扩散法、免疫电泳法、免疫化学法、配体结合测定、免疫组织化学技术、凝集和互补测定(例如参见《基础及临床免疫》(Basic and Clinical Immunology)Sites和Terr编辑，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.pp.217-262，1991，在此参考)。较好的是配体结合免疫测定法，其中包括令抗体与乳房珠蛋白的一个或多个表位反应，并竞争性替代标记过的乳房珠蛋白或其衍生物。

乳房珠蛋白衍生物在本文中指包含氨基酸或改性氨基酸的多肽，该多肽衍生物与乳房珠蛋白交叉反应。交叉反应指抗体与诱导其产生的抗原之外的抗原反应。

各种竞争性和非竞争性蛋白质结合免疫测定法是本领域熟知的。用于此类测定的抗体可以是非标记的，例如在凝集测试中，或者是在多种测定法中所用的标记过的。可使用的标记包括用在放射性免疫测定(RIA)、酶法免疫测定例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光免疫测定等中的放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂、酶的底物或辅因子、酶抑制剂、粒子、染料等。

可利用本领域已知的许多方法中的任何一种产生乳房珠蛋白或其表位之一的多克隆或单克隆抗体来用于免疫测定。表位指多肽的抗原决定簇。表位可以包含该表位独有的呈一定的空间构象的3个氨基酸。一个表位通常具有至少5个这样的氨基酸。检测氨基酸的空间构象的方法是本领域已知的，其中包括例如x光晶体学和2二维核磁共振。

制备某蛋白质的抗体的方法之一是选择和制备该蛋白质全部或部分的氨基酸序列，化学合成该序列并将其注射入合适动物体内，通常是兔或鼠。

制备乳房珠蛋白或其表位的方法包括但不限于化学合成、重组DNA技术或从生物样品中分离。例如，可以利用经典Merrifeld法即固相肽合成法(Merrifeld，《美国化学协会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)85：2149，1963，在此参考)或快速自动多重肽合成系统(DuPont Company，Wilmington，DE)上的FMOC方法(Caprino和Han，《有机化学杂志》(J Org Chem)37：3404，1972，在此参考)来进行肽的化学合成。

将抗原注射入膝后淋巴结来免疫兔，然后以两周为间隔腹膜内注射抗原来加强免疫，由此制备多克隆抗体。放出动物的血，一般用ELISA，以纯化的乳房珠蛋白进行血清分析。单克隆抗体可以按照Milstein和Kohler的方法来制备，即免疫过的鼠的脾脏细胞与连续复制的肿瘤细胞例如骨髓瘤细胞或淋巴瘤细胞融合(Milstein和Kohler，《自然》(Nature)256：495-497，1975；Gulfre和Milstein，《酶学方法：免疫化学技术》73：1-46，Langone和Banatis编，Academic Press，1981，在此参考)。然后将由此形成的杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆，用ELISA或RIA检测上清液中抗体的产生。

抗体识别和特异性结合由肿瘤细胞表达的靶抗原的独特能力提供了一种治疗癌症的方法(参见LoBuglio和Saleh，《美国医学科学杂志》(Am J MedSci)304：214-224，1992；Bagshawe，《药学发展》(Adv Phamacol)24：99-121，1993，在此参考)。所以，本发明的另一方面内容提供了一种在动物体内预防和治疗乳腺癌的方法，它以已被发现在乳腺癌细胞中超量表达的乳房珠蛋白的抗体的使用为基础。单克隆或多克隆的乳房珠蛋白的特异性抗体可由本领域已知方法中的任意一种来制备。例如可以用杂交瘤技术来制备鼠或人单克隆抗体。或者，可以给动物使用乳房珠蛋白或其免疫活性片段、或抗独特型抗体或其片段，以引发产生能够识别乳房珠蛋白表达细胞的抗体。

由此产生的抗体或其片段用一种或多种瘤细胞裂解物质例如放射性核素、毒素或细胞毒性药物标记，并给怀疑患有乳腺癌的病人使用。标记过的抗体与由乳腺癌细胞超量表达的乳房珠蛋白结合导致癌细胞的死亡。

本领域已知的多种瘤细胞裂解性物质中的任何一种都可以用于产生这样的标记过的抗体。例如，可以将植物和细菌毒素与抗体偶合来制备免疫毒素。这类毒素包括例如蓖麻毒蛋白、白喉毒素和假单孢菌属外毒素A。还可以制备化学治疗药物与抗体连接的药物-抗体结合物。适合这类用途的化学治疗药物包括例如tomoxifen、阿霉素、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、长春花生物碱和丝裂霉素。此外，可以制备放射性核素与抗体稳定连接的放射性免疫结合物。适用于制备放射性免疫结合物的放射性核素包括例如，β发射体例如¹³¹I、¹⁸⁸Re、¹⁸⁶Re、⁶⁷Cu、⁹⁰Y和⁴⁷Sc；α发射体例如²¹¹At、²¹²Bi和²¹²Pb；俄歇电子发射体例如¹²⁵I和⁷⁷Br；和可裂变核素例如¹⁰B。

在后文实施例部分描述了本发明较好的实施方式。根据在此公开的内容对说明书进行研究或实施本发明后，本发明权利要求范围内的其它实施方式对本领域技术人员来说是显而易见的。应该仅将说明书和实施例看作是说明性的，而本发明的范围和精神则由实施例后的权利要求来限定。

在后文实施例中，细胞系由美国典型培养物保藏中心提供，培养在以10％胎牛血清补充的Dulbecco极限必需培养基中。组织活检样品由人类合作组织网(Human Cooperative Tissue Network)(LiVolsi等，《癌症》71：1391-1394，1993，在此参考)提供。实施例1

该实施例说明乳房珠蛋白cDNA的分离。

用标准异氰酸胍法(Belyavsky等，同上)分离细胞系MDA-MB415的总细胞RNA。用Amplifinder试剂盒(Clonetech)并按照制造商的程序将该RNA用于RACEPCR过程。

以标准反应方式合成第一链cDNA，在20μl的反应体积中包含1μgRNA，10μM特异性乳房珠蛋白引物D2R(5’-ATA AGA AAG AGA AGG TGT GG-3’)(SEQ IDNO：4)，4μl的5×RT缓冲液(250mM TrisCl pH8.3，375mM Kcl，15mM MgCl₂)，2μl100mM DTT，1μl 10Mm dNTP和200单位Superscript^TM II逆转录酶(Gibco/BRL)。反应在45℃进行1小时，在95℃保温5分钟来终止反应。RNA用400μM NaOH在65℃水解30分钟，然后用400μM乙酸中和。然后在反应中加入3体积6M NaI和10μl处理过的玻璃珠。玻璃珠用80％乙醇洗涤3次，将核酸从玻璃珠上洗脱到45μl水中。然后沉淀核酸，再重悬在10μl水中。用T4 RNA连接酶在27℃反应20小时，将纯化后的第一链cDNA与制造商提供的锚定寡核苷酸(SEQ ID NO：9，5’-CAC GAA TTC ACT ATC GAT TCT GGA ACC TTC AGA GG-3’)连接。取连接反应物的十分之一进行PCR扩增，在50μl反应体积中包含1μM制造商的锚定引物(SEQ ID NO：10，5’-CTG GTT CGG CCC ACC TCT GAA GGT TCC AGA ATCGAT AG-3’)，1μM乳房珠蛋白特异性引物D2Rb(SEQ ID NO：11，5’-AAT CCGTAG TTG GTT TCT CAC C-3’)，200μM dNTP，5单位Vent^TM DNA聚合酶和1×聚合酶缓冲液(10mM KCl，20mM TrisCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100)。反应在94℃温育2分钟，然后在94℃温育45秒，50℃1分钟，72℃90秒，共40轮循环。

两段下游乳房珠蛋白特异性嵌套寡核苷酸是D2R(SEQ ID NO：4)和D2Rb(SEQID NO：11)。使用的上游乳房珠蛋白特异性调控寡核苷酸也是按照制造商的建议，即D2F(5’-CTT TCT GCA AGA CCT TTG GC-3’)(SEQ ID NO：12)。全部PCR扩增反应都用Vent^TM DNA聚合酶(New England Biolabs)进行。扩增后的RACE产物用EcorI消化，然后连接到质粒载体pGEM7Z(Promega)的EcoRI和SmaI位置。

全部测序都用Taq DNA聚合酶热循环测序试剂盒按照制造商(Promega)的程序进行。所用程序大致如下所述。

用10pmol ³²P-γ ATP(3,000Ci/mmol和10mCi/ml)末端标记10pmol序列特异性寡核苷酸，反应用T4聚核苷酸激酶在10μl体积中在37℃反应30分钟。在17μl制造商提供的测序缓冲液中进行聚合反应，其中包含100ng质粒模板，1.5pmol标记过的测序引物，和5单位测序级Taq聚合酶。将该反应物分在一组4支反应试管中，其中含有制造商提供的脱氧核苷酸和双脱氧-A，C，G或T的混合物。将这一组4支试管在95℃温育2分钟，94℃45秒，45℃30秒，然后在72℃1分钟，如此循环30次。反应完全后，在每一试管中加入80％甲酰胺/溴酚蓝染料3μl。样品在70℃加热2分钟后上样在6％丙烯酰胺/7.5M脲测序凝胶上，在60W恒压电泳2至4小时。干燥凝胶，然后与Kodak XAR5 X光胶片接触2至24小时。

由此得到的序列是图2中实线表示的403bp片段(SEQ ID NO：5)。在以往的工作中分离了DEST002标记序列(Watson和Fleming，同上)。该序列是图2中空心线所示的206bp片段(SEQ ID NO：6)。将这两段序列的信息合并，推导出了全长503bp的乳房珠蛋白的cDNA(图2)。实施例2

该实施例证明乳房珠蛋白的表达仅限于乳腺肿瘤细胞，以及少量表达在正常乳腺细胞中。

用标准异氰酸胍法分离总细胞RNA样品，并用无RNA酶的DNA酶(Promega)处理。为了进行PT/PCR，用寡聚dT₂₁(SEQ ID NO：13)和Superscript II逆转录酶(Gibco/BRL)按照制造商的程序逆转录1μg所述总RNA。

200ng dT₂₁(SEQ ID NO：13)和1μg总RNA在10μl体积中在65℃温育5分钟。样品在冰中冷却，并在其中加入4μl 5×RT缓冲液(250mM TrisCl pH8.3，375mMKCI，15mM MgCl₂)，2μ10mM DTT，1μl 10mM dNTP和200单位Superscript^TMII逆转录酶(Gibco/BRL)。反应在45℃进行1小时，然后在95℃温育5分钟终止反应。

每份RT反应物取十分之一进行PCR分析，使用乳房珠蛋白特异性引物D2R(5’-ATA AGA AAG AGA AGG TGT GG-3’)(SEQ ID NO：4)和d2102(5’-CAGCGG CTT CTT TGA TCC TTG-3’)(SEQ ID NO：3)，在标准反应条件下循环40次：94℃×30秒/55℃×1分钟/72℃×1分钟。

为了进行Northern分析，用全长乳房珠蛋白cDNA探针按照已有技术(Watson和Fleming，同上)分析20μg总RNA。用溴乙锭染色估计每份RNA样品的完整性和均等载量。

如图4A所示，在肿瘤样品2410中(原DEST即由该组织中分离得到)很容易检测到500bp的乳房珠蛋白信使，在正常人乳房组织中少得多，在无限繁殖的乳腺上皮细胞系B5-589中或人肺、胎盘、子宫和卵巢中则没有(图4A)。在用RT/PCR分析扩增后，在15份受检组织中仍然没有发现乳房珠蛋白的表达(图4B)。在这些反应物中检测到了甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(GAPDH)信使(图4B)和EGF受体信使(未显示)，这表明无表达并不是由于RNA的降解或其它次要原因。所以，乳房珠蛋白mRNA的表达具有相对的乳房组织特异性。实施例3

该实施例证明乳房珠蛋白cDNA编码一段可翻译核苷酸序列，该序列可产生具有正确预计的分子量的蛋白质产物。使用TNT^TM兔网织红细胞翻译试剂盒，用T7 RNA聚合酶(Promega)和³⁵S-甲硫氨酸(＞1000Ci/mmol；10mCi/ml，Amersham)按照制造商的程序进行体外翻译。

在25μl TNT^TM兔网织红细胞裂解物中加入2μl制造商制备的反应缓冲液、T7RNA聚合酶、20μM除甲硫氨酸之外的氨基酸混合物、40μCi³⁵S-甲硫氨酸(1000Ci/mmol和10mCi/ml)、40单位核糖核酸酶抑制剂、1μg乳房珠蛋白/pGEM7质粒和用足量DEPC处理过的水，使得最终反应体积达50μl。该反应混合物在30℃温育60分钟。取5μl该反应混合物加入20μl SDS凝胶缓冲液中，煮沸2分钟，然后上样在17.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上。

用乳房珠蛋白cDNA处理的兔网织红细胞产生一种60kD的蛋白质，而不用cDNA处理的则不产生任何蛋白质产物。实施例4

该实施例证明乳房珠蛋白在原发乳腺癌中超量表达的高发性。

为了确定乳房珠蛋白在乳腺癌中超量表达的频率，我们以乳房珠蛋白cDNA为探针利用Northern印迹杂交检查了一组15种不同组织学类型的I期乳腺癌。还比较了来自两个病人的对应的正常乳房组织样品(图6)。500bp的乳房珠蛋白mRNA被发现存在于正常乳房组织和肿瘤2410和其它3种肿瘤中，其中2种在病人的对应正常乳房组织只有极少量的表达或不表达(BO15对BO16；BO22对BO23)(图6)。总之，15种被检肿瘤中4种(27％)超量表达乳房珠蛋白mRNA。以上数据表明乳房珠蛋白的超量表达并不仅限于一种肿瘤样品，实际上它在原发乳房肿瘤中相当常见。而且，全部被检肿瘤都是I期的这一事实表明在乳房肿瘤形成过程中，这种失调发生得相当早。实施例5

以下实施例说明用多克隆抗体来检测乳房珠蛋白。

将对应于根据乳房珠蛋白cDNA推导的16个C末端氨基酸(Glu-Val-Phe-Met-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asp-Ser-Ser-Leu-Cys-Asp-Leu-Phe，SEQ ID NO：14)的肽与匙孔血蓝蛋白偶合，然后用Freund佐剂给兔注射，由此制备多克隆抗体。接种后的兔以3周为间期进行增强免疫，然后在第12周被放血，并测定其血清检测乳房珠蛋白的能力。由乳腺癌细胞系MDA-MB-415和MCF-7收获无血清条件培养基(24小时的集合)。MDA-MB-415已经确定为超量表达乳房珠蛋白信使的细胞系，而MCF-7已经确定为不产生可检知乳房珠蛋白的细胞系。将条件培养基在还原条件下上样在在12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶上，然后印迹到Nytran滤膜上，以所述的C末端肽的抗体作为该检测中的第一抗体，按照标准Western印迹法进行分析。在第一抗体结合之后，洗涤印迹，加入第二抗体(山羊抗兔)。利用酶联化学发光(ECL Western印迹检测试剂，Amersham，Arlington Heights，IL)目测乳房珠蛋白-抗体复合物。MDA-MB-415细胞系的条件培养基显示一条表观分子量为20kD的乳房珠蛋白条带，在MCF-7细胞系的条件培养基则没有发现这一条带。所以，MDA-MB-415细胞分泌乳房珠蛋白而MCF-7细胞则不分泌。

为了进一步证明该蛋白的特异性，用C末端肽的抗体利用Western印迹法，在有和没有用于产生抗体的竞争性肽存在下对MDA-MB-415细胞系的条件培养基和细胞裂解物进行分析。如前文所述目测乳房珠蛋白-抗体复合物。如图7所示，没有竞争肽时(-)，条件培养基具有代表乳房珠蛋白的20kD条带。细胞裂解物(C)在14kD、20kD和更高分子量处有多条条带。14kD的条带可能代表未加工形式的乳房珠蛋白。乳房珠蛋白的cDNA具有一致的N糖基化位置，所以观察到的20kD分泌蛋白代表该蛋白的部分加工形式。在有竞争肽存在下(+)进行Western印迹时，没有目测到乳房珠蛋白的分泌形式和胞内形式，这表明这些蛋白质包含合成抗体针对的肽。

该C末端肽的抗体还在原发乳房肿瘤样品的细胞裂解物中检测到了类似的条带(图8)。此外，该抗体还通过免疫组织化学染色石蜡固定的病人乳腺癌切片表现出与乳房肿瘤细胞的反应性(图9)。免疫组织化学染色是用以辣根过氧化物酶标记的该抗体和山羊抗兔抗体，以四盐酸3，3’-二氨基苯(DAB)为底物进行的。表达乳房珠蛋白的细胞被染成棕色。

根据以上结果，我们认为乳房珠蛋白是一种分泌蛋白，刚合成的乳房珠蛋白是前体蛋白，在分泌前，翻译后修饰作用提高了其必要的表观分子量；可以在人乳房肿瘤样品中检测到乳房珠蛋白。在利用乳房珠蛋白为乳腺癌标记进行的癌症诊断中，在评价乳房肿瘤的恶化中，在检测自身骨髓/干细胞是否被肿瘤细胞污染中，在乳腺癌疫苗中，在利用抗体介导复合物定向地治疗性干扰乳腺癌肿瘤细胞中，进行乳房珠蛋白的检测是可行的。

综上所述，可以看到本发明具有许多优点，而且还获得了其它的优良效果。

由于在本发明范围之内，以上方法和组合物可以有多种修改形式，所以说明书和附图中所以内容都只是说明性的，而不是某种限定。

               序列表(1)一般信息：  (i)申请人：WASHINGTON UNIVERSITY  (ii)发明名称：DNA序列及其编码的乳房特异性乳腺癌蛋白  (iii)序列数目：14  (iv)通信地址：

   (A)收信人：HOWELL & HAFERKAMP，L.C.

   (B)街道：7733 FORSYTH BOULEVARD，SUITE 1400

   (C)城市：ST.LOUIS

   (D)州：MISSOURI

   (E)国家：USA

   (F)邮编：63105-1817  (v)计算机可读形式：

   (A)记录介质类型：软盘

   (B)计算机：IBM PC兼容型

   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

   (D)软件：Patentln Release#1.0，Version#1.25  (vi)本申请资料：

   (A)申请号：

   (B)申请日：

   (C)分类：  (viii)律师/代理人信息：

   (A)姓名：HOLLAND，DONALD R.

   (B)登记号：35，197

   (C)参考/案卷号：964796  (ix)通讯信息：

   (A)电话：(314)727-5188

   (B)传真：(314)727-6092(2)SEQ ID NO：1的信息：  (i)序列特征：

   (A)长度：503碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：mRNA的cDNA  (iii)假设：否  (iv)反义：否  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GACAGCGGCT TCCTTGATCC TTGCCACCCG CGACTGAACA CCGACAGCAG CAGCCTCACC               60ATGAAGTTGC TGATGGTCCT CATGCTGGCG GCCCTCTCCC AGCACTGCTA CGCAGGCTCT              120GGCTGCCCCT TATTGGAGAA TGTGATTTCC AAGACAATCA ATCCACAAGT GTCTAAGACT              180 GAATACAAAG AACTTCTTCA AGAGTTCATA GACGACAATG CCACTACAAA TGCCATAGAT              240GAATTGAAGG AATGTTTTCT TAACCAAACG GATGAAACTC TGAGCAATGT TGAGGTGTTT              300ATGCAATTAA TATATGACAG CAGTCTTTGT GATTTATTTT AACTTTCTGC AAGACCTTTG    360GCTCACAGAA CTGCAGGGTA TGGTGAGAAA CCAACTACGG ATTGCTGCAA ACCACACCTT    420CTCTTTCTTA TGTCTTTTTA CTACAAACTA CAAGACAATT GTTGAAACCT GCTATACATG    480TTTATTTTAA TAAATTGATG GCA    503

(2)SEQ ID NO：2的信息：  (i)序列特征：

   (A)长度：93氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：蛋白质  (iii)假设：否  (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Met Lys Leu Leu Met Val Leu Met Leu Ala Ala Leu Ser Gln His Cys

1               5                   10                  15

Tyr Ala Gly Ser Gly Cys Pro Leu Leu Glu Asn Val Ile Ser Lys Thr

            20                  25                   30

Ile Asn Pro Gln Val Ser Lys Thr Glu Tyr Lys Glu Leu Leu Gln Glu

         35                  40                   45Phe Ile Asp Asp Asn Ala Thr Thr Asn Ala Ile Asp Glu Leu Lys Glu

     50                  55                  60

Cys Phe Leu Asn Gln Thr Asp Glu Thr Leu Ser Asn Val Glu Val Phe

65                  70                   75                 80

Met Gln Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phe

                85                  90(2)SEQ ID NO：3的信息：  (i)序列特征：

   (A)长度：21碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：cDNA  (iii)假设：否  (iv)反义：否  (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CAGCGGCTTC CTTGATCCTT G                                   21(2)SEQ ID NO：4的信息：  (i)序列特征：

   (A)长度：20碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：cDNA  (iii)假设：否  (iv)反义：否  (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：ATAAGAAAGA GAAGGTGTGG                             20(2)SEQ ID NO：5的信息：  (i)序列特征：

   (A)长度：403碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：cDNA to mRNA  (iii)假设：否  (iv)反义：否  (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：GACAGCGGCT TCCTTGATCC TTGCCACCCG CGACTGAACA CCGACAGCAG CAGCCTCACC    60ATGAAGTTGC TGATGGTCCT CATGCTGGCG GCCCTCTCCC AGCACTGCTA CGCAGGCTCT   120GGCTGCCCCT TATTGGAGAA TGTGATTTCC AAGACAATCA ATCCACAAGT GTCTAAGACT    180GAATACAAAG AACTTCTTCA AGAGTTCATA GACGACAATG CCACTACAAA TGCCATAGAT    240GAATTGAAGG AATGTTTTCT TAACCAAACG GATGAAACTC TGAGCAATGT TGAGGTGTTT    300ATGCAATTAA TATATGACAG CAGTCTTTGT GATTTATTTT AACTTTCTGC AAGACCTTTG    360GCTCACAGAA CTGCAGGGTA TGGTGAGAAA CCAACTACGG ATT                      403(2)SEQ ID NO：6的信息：  (i)序列特征：

   (A)长度：206碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：mRNA的cDNA  (iii)假设：否  (iv)反义：否  (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：TTTATGCAAT TAATATATGA CAGCAGTCTT TGTGATTTAT TTTAACTTTC TGCAAGACCT     60TTGGCTCACA GAACTGCAGG GTATGGTGAG AAACCAACTA CGGATTGCTG CAAACCACAC    120CTTCTCTTTC TTATGTCTTT TTACTACAAA CTACAAGACA ATTGTTGAAA CCTGCTATAC    180ATGTTTATTT TAATAAATTG ATGGCA206(2)SEQ ID NO：7的信息：  (i)序列特征：

   (A)长度：95氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：蛋白质  (iii)假设：否  (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

Met Lvs Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Val Thr Ile Pro Ile Cys Cys

1               5                   10                  15

Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Cys Ser Ile Leu Asp Glu Val Ile Arg Gly

            20                  25                  30

Thr Ile Asn Ser Thr Val Thr Leu His Asp Tyr Met Lys Leu Val Lys

        35                  40                  45

Pro Tyr Val Gln Asp His Phe Thr Glu Lys Ala Val Lys Gln Phe Lys

    50                  55                  60

Gln Cys Phe Leu Asp Gln Thr Asp Lys Thr Leu GIu Asn Val Gly Val

65                  70                  75                  80

Met Met Glu Ala Ile Phe Asn Ser Glu Ser Cys Gln Gln Pro Ser

                85                  90                  95(2)SEQ ID NO：8的信息：  (i)序列特征：

   (A)长度：91氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：蛋白质  (iii)假设：否  (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

Met Lys Leu Ala Val Thr Leu Thr Leu Val Thr Leu Ala Leu Cys Cys

1                   5                   10                  15

Ser Ser Ala Ser Ala Glu Ile Cys Pro Ser Phe Gln Arg Val Ile Glu

                20                  25               30

Thr Leu Leu Met Asp Thr Pro Ser Ser Tyr Glu Ala Ala Met Glu Leu

        35                  40                  45

Phe Ser Pro Asp Gln Asp Met Arg Glu Ala Gly Ala Gln Leu Lys Lys

    50                  55                  60

Leu Val Asp Thr Leu Pro Gln Lys Pro Arg Glu Ser Ile Ile Lys Leu

65                  70                  75                     80

Met Glu Lys Ile Ala Gln Ser Ser Leu Cys Asn

                85                  90(2)SEQ ID NO：9的信息：  (i)序列特征：

   (A)长度：35碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：cDNA  (iii)假设：否  (iv)反义：否  (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG                    35(2)SEQ ID NO：10的信息：  (i)序列特征：

   (A)长度：38碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：cDNA  (iii)假设：否  (iv)反义：否  (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG                 38(2)SEQ ID NO：11的信息：  (i)序列特征：

   (A)长度：22碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：cDNA  (iii)假设：否  (iv)反义：否  (xi)序列描述：SEQ ID NO：11：AATCCGTAGT TGGTTTCTCA CC                 22(2)SEQ ID NO：12的信息：  (i)序列特征：

   (A)长度：20碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：cDNA  (iii)假设：否  (iv)反义：否  (xi)序列描述：SEQ ID NO：12：CTTTCTGCAA GACCTTTGGC                    20(2)SEQ ID NO：13的信息：  (i)序列特征：

   (A)长度：21碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：cDNA to mRNA  (iii)假设：否  (iv)反义：否  (xi)序列描述：SEQ ID NO：13：TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT T                 21(2)SEQ ID NO：14的信息：  (i)序列特征：

   (A)长度：16氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：肽(iii)假设：否  (xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Glu Val Phe Met Gln Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phe1               5                   10                  15