编码GAGE肿瘤排斥抗原的分离的截短的核酸分子

摘要

本文公开了一个肿瘤排斥抗原前体新家族以及编码它们的核酸分子。这些肿瘤排斥抗原前体被称为GAGE肿瘤排斥抗原前体,而编码它们的核酸分子被称为GAGE编码分子。本文描述了这些编码序列、肿瘤排斥抗原以及它们的前体分子的各种诊断和治疗用途。本文也描述了肿瘤排斥抗原。

说明书

相关申请

此申请是共同未决(copending)申请08/370,648(1995年1月10日提交)的部分继续申请，而后者是共同未决专利申请08/250,162(1994年5月27日提交)的部分继续申请，08/250,162号申请又是专利申请08/096,039(1993年7月22日提交)的部分继续申请。所有这些申请本文一并参考。发明所属技术领域

本发明涉及编码肿瘤排斥抗原前体的核酸分子。更具体地说，本发明涉及一些基因，这些基因的肿瘤排斥抗原前体被特别加工成为至少一种HLA-Cw6分子呈递的肿瘤排斥抗原。所说的这些基因似乎与其它已知肿瘤排斥抗原前体编码序列无关。本发明也涉及HLA-Cw6分子呈递的肽及其用途。HLA-A29分子呈递的肽及其用途也是本发明的一部分。背景和现有技术

哺乳动物的免疫系统对外源和异己材料的识别和反应过程是一个复杂的过程。此系统的一个重要方面是T淋巴细胞，或“T细胞”反应。这种反应要求T细胞识别细胞表面分子和肽的复合物并和其相互作用，这种细胞表面分子被称为人白细胞抗原(“HLA”)或主要组织相容性复合物(MHCs)。这些肽衍生于呈递HLA/MHC分子的细胞加工的更大的分子。关于这一点上参见Male等，现代免疫学(J.P. Lipincott公司，1987)，特别是第6-10章。T细胞和HLA/肽复合物的相互作用是受限制的，其要求有对HLA分子和肽特定组合体特异性的T细胞。如果特异性T细胞不存在，即使它的配体(partner)复合物存在，也没有T细胞反应。同样地，如果特异性复合物不存在，但T细胞存在，也不会发生反应。这种机制和免疫系统对外源物质的反应、自身免疫病理学以及细胞异常反应有关。许多工作集中在把蛋白质加工成HLA结合肽的机制上。关于这一点上，参见Barinaga等，科学257：880(1992)；Fremont等，科学257：919(1992)；Matsumura等，科学257：927(1992)；Latron等，科学257：964(1992)。也参见Engelhard，免疫学年度综述12：181-207(1994)。

癌症中也涉及T细胞识别细胞异常的机制。例如，在PCT申请PCT/US92/04354(1992年5月22日申请，1992年11月年26日公布，本文一并参考)中，公开了一个加工成肽的基因家族，接下来这种肽在细胞表面表达，通过特异性CTLs胞溶性T-淋巴细胞或下文的“CTLs”导致肿瘤细胞的溶解(lysis)。据说这种基因编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，并且由它们衍生的肽称为“肿瘤排斥抗原”或“TRAs”。有关这个基因家族的其它信息参见Traversari等，免疫遗传学35：145(1992)；van der Bruggen等，科学254：1643(1991)。也可参见美国专利申请807,043(1991年12月12日申请)，现为美国专利5,342,774。

在美国专利申请938,334(现为美国专利5/405,940，其公开内容本文一并参考)中，解释了MAGE-I编码肿瘤排斥抗原前体，其被加工成HLA-A1分子呈递的九肽(nonapeptides)。由这些参考文献可知，如果给定特定肽对特定HLA分子的特异性，人们可以期待结合到一种HLA分子而非其它HLA分子的特定肽。由于不同的个体具有不同的HLA表型，所以这一点是重要的。因此，尽管对特异HLA分子的配体的特定肽的鉴定具有诊断和治疗用途，但是其只和具有这种特定HLA表型的个体相关。由于细胞异常不仅限于一种特定的HLA表型，而定向疗法则要求这些异常细胞表型的一些未知信息，所以此领域的工作有必要继续进行。

在美国专利申请008,446(1993年1月22日申请，本文一并参考)中，公开了这样一个事实，即MAGE-I表达产物被加工成第二种TRA。HLA-C克隆10分子呈递这一第二种TRA。本文公开的内容表明一个给定的TRAP可以产生很多TRAs。

由美国专利申请994,928(1992年12月12日申请，本文一并参考)可知，酪氨酸酶，其是正常细胞(如黑素细胞)产生的分子，在肿瘤细胞中加工产生HLA-A2呈递的肽。

在美国专利申请08/032,978(1993年3月18日申请，全文参考)中，指出非衍生于酪氨酸酶的第二种TRA由HLA-A2分子呈递。这种TRA衍生于一种TRAP，但由非MAGE基因编码。此公开内容表明特定的HLA分子可呈递来源于不同源的TRAs。

在美国专利申请08/079,110(1993年6月17日申请，本文一并参考)中，描述了一种无关的肿瘤排斥抗原前体，即所谓的“BAGE”前体。这种BAGE前体与MAGE家族无关。

上述引用的论文、专利和专利申请所描述的工作在很大程度是针对MAGE家族基因和无关的BAGE基因的。然而还没有发现由细胞表达的另外的肿瘤排斥抗原前体。把这些肿瘤排斥抗原前体称为“GAGE”肿瘤排斥抗原前体。它们对MAGE基因家族或BAGE基因都不显示同源性。这样，本发明涉及编码这种TRAPs的基因和这种肿瘤排斥抗原前体本身以及二者的用途。

这样，本发明的另一个特征是具有6至16个氨基酸任意长度的并包含下列序列的肽：

Xaa_(1,2) Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr       (SEQ ID NO：23)其中的Xaa是任意氨基酸，Xaa_(1，2)意思是1个或2个氨基酸可以是色氨酸残基的N-末端。这些肽结合HLA-A29分子和/或被加工成和HLA-A29分子结合的肽。

在以下的说明中进一步详细地描述本发明。附图简要描述

图1显示了采用CTL克隆76/6的溶解研究。

图2显示了用各种转染子和对照获得的的肿瘤坏死因子(“TNF”)释放测定。

图3比较了由克隆CTL76/6的胞溶性T-淋巴细胞诱导的溶解。试验了包括SEQ ID NO：4的各种长度的肽。

图4显示了本文讨论的六个GAGE基因的cDNA的序列对比。图中，相同区用框圈起。也标明了翻译起始位点和终止密码子。箭头表明实施例描述的用于聚合酶链式反应的引物。

图5显示了GAGE家族成员的推导的氨基酸序列的序列对比。相同区由框示出，并标明SEQ ID NO：4的抗原肽。

图6显示了由每个GAGE cDNA与HLA-Cw6 cDNA一道转染进COS细胞获得的结果。24小时后加入CTL76/6样品，并在24小时后测量TNF的释放。

图7比较了HLA-A29 cDNA、MAGE、BAGE或GAGE序列(如图所示)转染的COS-7细胞对CTL 22/23的刺激作用。对照值由MZ2-MEL.43给出并以COS细胞为刺激器。

图8显示了由用包括SEQ ID NO：22在内的各种肽以及由其衍生的各种肽进行的⁵¹Cr释放研究获得的结果。优选实施方案的详细描述实施例1

由患者MZ2的黑素瘤细胞利用标准的方法建立一种黑素瘤细胞系MZ2-M3L。这种细胞系如在PCT申请PCT/US92/04354(1992年5月22日申请，1992年11月26日公布，这里全文参考)中已描述。细胞系建立后，照射其样品以使之不具有增殖能力。然后利用这些照射过的细胞分离对其特异性的胞溶性T细胞克隆(“CTLs”)。

从患者MZ2提取外周血单核细胞(“PBMCs”)的样品，并使之和照射过的黑素瘤细胞接触。观察混合物中黑素瘤细胞的溶解，其表明对黑素瘤细胞呈递的HLA分子和肽的复合物特异的CTLs存在于样品中。

所用的溶解测定方法是按照Herin等，国际癌症杂志39：390-396(1987)(其公开内容本文一并参考)的铬释放测定方法。但是本文描述了这种测定方法。体外培养靶黑素瘤细胞，然后以10⁷个细胞/ml在添加10mM HEPES和30％FCS的DMEM中悬浮，在30℃下和200uCi/ml Na(⁵¹Cr)O₄一道培养30分钟。标记的细胞以添加有10mM Hepes的DMEM洗涤三次，然后将其悬浮在添加有10mM Hepes和10％FCS的DMEM中，然后将含有10³个细胞的100μl等分试样分布在96孔的微量板上。加入在同样培养基中的PBLs的样品，并进行双份测定。把平板在100g下离心4分钟，37℃ 8％ CO₂中培养4小时。

平板再一次离心，收集上清液的100μl等分试样并计数。⁵¹Cr释放的百分数按下式计算：    其中的ER是观察到的实验⁵¹Cr释放，SR是由在200μl培养基中单独培养10³个标记细胞测量的自发释放，而MR是最大释放，通过向靶细胞加入100μl 0.3％的Triton X-100得到的。

显示高CTL活性的那些单核血液样品通过有限稀释而扩增和克隆，利用相同的方法，再一次筛选。这样就分离了克隆MZ2-CTL 76/6。这种克隆下文称为“76/6”。

用同样的方法检测靶K562细胞以及黑素瘤细胞系。图1显示这一CTL克隆识别和溶解黑素瘤细胞系，即MZ2-MEL而不识别和溶解K562。以上述同样的方法检测这一克隆对其它黑素瘤细胞系和自身EBV-转化的B细胞的作用。图1显示由Epstein Barr病毒(“EBV”)转化的自身的B细胞没有溶解，而MZZ-MEL 3.0细胞被CTL克隆76/6溶解，不表达抗原F的变体细胞系MZZ-MEL.4F没有溶解。因此，此克隆看来对这种抗原是特异性的。

上述所示的结果还不能确定哪种HLA分子呈递TRA。溶解的细胞系，即MZ2-MEL，已知表达HLA-A1、HLA-A29、HLA-B37、HLA-B44、HLA-Cw6和HLA-C克隆10。在本文没有报道但遵循此实施例的方案的实验中，检测了已丧失HLA分子A29、B44和C克隆10表达的MZ2-MEL的一个亚系，该亚系被溶解。这表明呈递分子应该是A1、B37或Cw6之一。实施例2

进行进一步研究以确定在与靶细胞接触时，76/6是否也产生肿瘤坏死因子(“TNF”)。所利用的方法是Traversari等在免疫遗传学：145-152(1992)中所描述的，其公开内容本文一并参考。简言之，CTL系的样品与兴趣靶细胞样品在培养基中结合。24小时后，从培养物中取上清液，然后在TNF敏感性WEHI细胞上检测。上述及在引用的文献中所讨论的MZ2-MEL细胞系的亚系MZ2-MEL.43具有极强烈的反应，且用于下列的实验中。实施例3

实施例2结果表明MZ2-MEL.43呈递感兴趣的靶抗原。因此，将其用作总mRNA的来源以制备cDNA文库。

从细胞系中分离总mRNA。利用寡-dT结合试剂盒，遵照公知的技术分离mRNA。获得mRNA后，利用含有NotI位点的寡dT引物通过反转录将其转录成cDNA，接下来合成第二条链。然后把cDNA连接到BstXI衔接头上，以NotI消化，通过Sephacryl S-500 HR柱分级分离各片段，然后不定向地将其克隆到pcDNAI/Amp的BstXI和NotI位点。将重组质粒电穿孔到DH5α大肠杆菌细菌中。将总共1500个集合体(pool)、每个集合体100个重组细菌接种在微孔中。因为几乎所有细菌都含有一个插入物，所以每个集合体含有大约100种cDNA。

对每一个集合体进行扩增至饱和并由碱裂解和醋酸钾沉淀法而不使用酚提取法提取质粒DNA。实施例4

如实施例3所述制备该文库后，用cDNA转染真核细胞。这里所述的转染以双份进行。将COS-7样品含在补加10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagles培养基(“″DMEM”)中以15,000个细胞/孔接种在组织培养平板底部的微孔内。将细胞37℃过夜培养，除去培养基，然后以50μl/孔更换含有10％ Nu血清、400μg/mlDEAE-葡聚糖、100μM氯喹，另外加入100ng质粒的DMEM培养基。如上所述，溶解研究不能确定哪一种HLA分子呈递抗原，因此利用可能呈递抗原的每种HLA分子(A1，B37，Cw6)的cDNA独立地共转染细胞。具体地，利用与转染该文库相同的方案，用28ng克隆到pCD-SαR中的编码HLA-A1的基因、50ng克隆到pcDNA I/Amp中的HLA-B37的cDNA或75ng克隆到pcDNA-I-Amp中的HLA-Cw6的cDNA共转染。

转染在双孔中进行，只有500份HLA-Cw6转染子可以在单孔中检测。37℃培养4小时后，除去培养基，用含有10％ DMSO的50μl PBS替换。两分钟后除去培养基并用补加10％ FCS的200μl DMEM替换。

培养基如此更换后，将COS细胞在37℃培养24-48小时。然后弃掉培养基，并加入存在于100μl含有10％浓集(pooled)人血清并补加20-30U/ml重组IL-2的Iscove’培养基中的CTL克隆76/6的1000-3000个细胞。24小时后除去上清液，在WEHI细胞上以Traversari等在免疫遗传学35：145-152(1992)(其公开内容本文一并参考)所述的分析方法测定TNF含量。

以HLA-A1转染的1500个集合体和以HLA-B37转染的1500个集合体刺激TNF的释放，浓度分别达到15-20pg/ml或2-6pg/ml。大多数HLA-Cw6转染子产生3-20pg/ml释放，只有一个集合体产生超过60pg/ml的释放。选择这个集合体用于进一步的工作。实施例5

克隆所选择的集合体的细菌，并检测600个克隆。从中提取质粒DNA，并以上述相同的方式将其转染到COS细胞的新样品中，为了确定CTL克隆76/6的刺激作用，再次检测细胞。发现94个阳性克隆，对其中之一(称为cDNA克隆2D6)进一步检测。在比较实验中，COS细胞用cDNA克隆2D6和HLA-Cw6 cDNA、单独使用HLA-Cw6 cDNA克隆、或单独使用cDNA 2D6转染。也使用了对照细胞系MZ2-MELF和MZ2-MEL F⁺。通过在WEHI细胞中检测TNF(如上述)而测量进入CTL上清液的TNF释放量。在将细胞和MTT一道培养后，通过光密度测量存活的WEHI细胞数量。图2显示用HLA-Cw6和cDNA-2D6转染的COS细胞以及细胞系MZ2-MEL F⁺刺激CTL克隆76/6释放TNF，表明HLA-Cw6呈递本发明的TRA。实施例6

按照本领域公知的技术对cDNA 2D6测序。序列检索表明质粒插入物和已知基因或蛋白质不显示同源性。SEQ ID NO：1显示这一已鉴定基因(后文称为“GAGE”)的cDNA核苷酸信息。一个推定的开放读框位于这个分子的51-467位碱基。此序列的前两个碱基来源于携带这个cDNA序列的载体，所以不是cDNA的自身部分。实施例7

如实施例6所述cDNA测序后，进行实验以确定是否正常组织的细胞表达此基因。为此，如下所示在组织和肿瘤细胞系中进行Northern印迹。印迹实验利用SEQ ID NO：1完整系列的cDNA。然后利用PCT确认结果。

            表1.基因GAGE的表达

            正常组织

            PHA激活的T细胞        -

            CTL克隆82/30          -

            肝脏                  -

            肌肉                  -

            肺脏                  -

            脑                    -

            肾                    -

            胎盘                  -

            心脏                  -

            皮肤                  -

            精巢                  +

            肿瘤细胞系

            黑素瘤                7/16

            肺癌                  1/6

            肉瘤                  0/1

            甲状腺髓质癌          0/1

            肿瘤样品

            黑素瘤                1/1实施例8

通过使用聚合酶链反应(“PCR”)和上面描述的GAGE基因信息对正常组织和肿瘤进行详尽分析。

利用本领域的识别技术，从特定的样品中提取总RNA，其用于制备cDNA。制备cDNA的方案涉及合并4μl反转录酶缓冲液5x、每种dNTP 1μl(10mM)、2μl二硫苏糖醇(100mM)、2μldT-15引物(20μm)、0.5μl RNasin(40单位/μl)、1μl MOMLV反转录酶(200单位/μl)，然后加入6.5μl模板RNA(1μg/3.25μl水或2μg总模板RNA)，混合物的总体积为20μl。将其混合并在42℃温育60分钟，之后在冰上冷却。然后加入总量80μl的水，最终体积达到100μl。混合物在用于PCR之前，保存于-20℃。

为了完成PCR，分别使用如下引物：

5’-AGA CGC TAC GTA GAG-3’(有义)和

5’-CCA TCA GGA CCA TCT-3’(反义)其分别为SEQ ID NO：2和3。试剂包含30.5μl水、5μl PCR缓冲液10x、每种dNTP 1μl(10uM)、每种引物2.5μl(20uM)和0.5μl聚合酶Dynazyme(2单位/μl)，总体积是45μl。加入总共5μl的cDNA(相当于100ng总RNA)。合并混合物并加一滴矿物油。将混合物转移到热循环仪部件(block)上，预热到94℃，并进行30个循环的扩增，每个循环包括下列各步：

第一变性：      94℃，4分钟

变性：          94℃，1分钟

退火：          55℃，2分钟

延伸：          72℃，3分钟

最后的延伸：    72℃，15分钟循环完成后，用10μl等分试样在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，以溴化乙锭染色。

用如上所示的引物扩增的cDNA产生238个碱基对的片段。污染的基因组DNA(如果存在)没有扩增。

所得结果列于下文表2中。所得结果确认表达GAGE唯一的正常组织是精巢，而大量的肿瘤，包括黑素瘤、肺、乳腺、喉、咽、肉瘤、睾丸的精原细胞瘤、膀胱和结肠的肿瘤表达此基因。这样，这些肿瘤任何一种都可用于GAGE基因表达分析。

            表2.基因GAGE表达的RT-PCR分析

            正常组织

            心脏            -

            脑              -

            肝              -

            肺              -

            肾              -

            脾              -

            淋巴细胞        -

            骨髓            -

            皮肤            -

            痣              -

            黑素细胞        -

            成纤维细胞      -

            前列腺          -

            精巢            +

            卵巢            -

            乳腺            -

            肾上腺          -

            肌肉            -

            胎盘            -

            脐带            -

        肿瘤

                        细胞系       肿瘤样品

       黑素瘤           40/63        46/146(32％)

       肺癌

         表皮样癌                    10/41(24％)

         腺癌                        4/18

         小细胞肺癌     6/23         0/2

       乳腺癌                        15/146(10％)

       头颈部肿瘤

         喉                           6/15(40％)

         咽                           3/13

       肉瘤             1/4           6/18(33％)

       睾丸精原细胞瘤                 6/6(100％)

       膀胱癌                         5/37(14％)

       前列腺癌                       2/20

       结肠癌           5/13          0/38

       肾癌             0/6           0/45

       白血病           3/6           0/19实施例9

前面实施例所涉及的核酸分子的鉴别导致针对由HLA-Cw6分子呈递的和衍生于GAGE基因的肿瘤排斥抗原的鉴定的进一步的工作。

将在表达载体pcDNA/Amp中的完整GAGE cDNA以限制性核酸内切酶NotI和SpHI消化，然后按供给者说明(Erase-a-base System，Promega)用核酸外切酶III消化。这种处理在3’末端产生一系列的渐进缺失。

把缺失产物重新连接到pcDNAI/AMp，用公知的方法将其电穿孔进入大肠杆菌菌株DH5alpha’IQ，以氨苄青霉素(50mg/ml)选择转化子。

从每一重组克隆中提取质粒DNA，并将其和编码HLA-Cw6的载体一道转染COS-7细胞，所用的方案遵循以上描述的方案。

以TNF释放测定法检测该转染子，这样使得能分离阳性和阴性克隆。所有阴性克隆显示整个GAGE序列的缺失。最小的阳性克隆包含SEQ ID NO：1的前170个核苷酸。上述的序列分析注意到开放读框始于第51个核苷酸。这样，此片段包含编码GAGE TRAP前40个氨基酸的序列。实施例10

进行另外的实验以更精确地限定编码TRA肽的区域，使用聚合酶链反应(“PCR”)扩增完成此任务。

合成两个引物，第一个是22聚体，其和质粒载体pcDNAI/Amp内的定位于BamHI位点上游的序列互补。第二个引物是29-mer，其在3’末端包含SEQ ID NO：1的102-119位核苷酸，在5’末端有一个包含XbaI限制位点的11个核苷酸的延伸物。

扩增后，PCR产物由BamHI和XbaI消化，并克隆到质粒pcDNA-3的BamHI-XbaI位点上。按照实施例4用重组克隆与编码HLA-Cw6的cDNA共转染COS-7细胞，并利用CTL76/6按如上所述进行TNF释放分析。

观察到了TNF释放，表明“小基因”被加工成TRA。小基因，即SEQ ID NO：1的1-119位核苷酸，其编码区为51-119位核苷酸并编码SEQ ID NO：1 cDNA的头23个氨基酸。这些信息作为下列实验的基础。实施例11

以SEQ ID NO：1的头23个氨基酸为基础合成两条肽，它们是：Met Ser Trp Arg Gly Arg Ser Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg(SEQ ID NO：12)，和Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Glu Pro Pro Glu Met Ile(SEQ IDNO：13)

将每条肽脉冲到预先用HLA-Cw6 cDNA转染的COS-7细胞中，并和CTL 76/6合并以确定是否诱导了TNF释放。将肽(20μg/ml)加入到24小时前用HLA-Cw6cDNA转染的COS-细胞中，37℃下培养90分钟后，弃掉培养基，并加入在含有25单位/ml IL-2的100μl培养基中的3000个CTLs。18小时后，通过测定对WEHI-164-13细胞的毒性来检测上清液的TNF含量。发现第二条肽(SEQ ID NO：13)能诱导多于30pg/ml的TNF，而发现第一条肽(SEQ ID NO：12)诱导少于10pg/ml的TNF。利用第二条肽进行进一步的实验。实施例12

以SEQ ID NO：13为基础合成及检测了各种肽，其中一些如下所示。为了进行这些检测，将⁵¹Cr标记的LB33-EBV细胞(其是HLA-Cw6阳性)和下列肽之一一道培养：

Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr

                (SEQ ID NO：4)

Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr

                (SEQ ID NO：5)

Thr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val

                (SEQ ID NO：6)

Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val

                (SEQ ID NO：7)

Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Glu

                (SEQ ID NO：8)

Met Ser Trp Arg Gly Arg Ser Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg

                (SEQ ID NO：12)肽浓度变化如图3所示，CTL：LB33-EBV之比(“效应器∶靶比值”)是10∶1。37℃培养4小时测定⁵¹Cr释放，阳性(”F+’，MZ2-MEL.3.1)和阴性(“F”；MZ2-MEL.2.2.5)对照细胞的溶解水平如图3所示。

令人十分惊奇地是，发现SEQ ID NO：4的八聚物是最好的肽，且似乎是肿瘤排斥抗原。这是第一次报道八聚物由人类MHC分子呈递。有一些小鼠系统的先例，如Engelhard报道(上述，199)，其针对H-2K^b和H-2K^k分子。九聚物SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6也诱导CTL溶解，尽管比SEQ ID NO：4八聚物程度轻。

检测了第二个CTL(CTL 82/31)，但在结果中未报道。已知此CTL溶解呈递MZ2-F的细胞。在用SEQ ID NO：4肽脉冲后，其也溶解HLA-Cw6阳性细胞。实施例13

为了查明上述的GAGE DNA是否是唯一的，将由MZ2-MEL.43的RNA制备的cDNA文库(用于克隆GAGE的相同文库)和来源于GAGE cDNA的探针杂交。探针是SEQ ID NO：1位置20-328之308个碱基对的PCR片段。得到20个阳性cDNA。对其中6个进行完全测序，它们与GAGE序列高度相关，但稍有不同。6个克隆有2个彼此相同，但其余的彼此不同。这样，鉴定了5个和GAGE不同但和其高度相关的新序列。将它们称为GAGE-2，3，4，5和6(图4)并分别如SEQ IDNO：14-18所示。其它14个克隆在5’末端进行部分测序，它们的序列对应于此6个GAGE cDNAs之一。

这些cDNA和GAGE-I间的主要区别是在SEQ ID NO：1的GAGE序列的379至521位置上缺少143个碱基的一段序列。除了GAGE-3(其5’末端的头112个碱基和其它的GAGE完全不同)，其余序列只在19个不同的位置错配。GAGE-3 cDNA的此区含有一个长的重复和一个发夹结构。

对应于肿瘤排斥抗原前体的推定的GAGE-I蛋白质比其它5种蛋白质长大约20个氨基酸，这些其它蛋白质的最后七种残基也不同于GAGE-I的同源残基(图5)。其余蛋白质序列显示仅仅10个错配。这些错配之一是在SEQ ID NO：4的抗原肽相对应的区域。在GAGE-3，4，5，6中此肽序列被修饰，因此现在第2位由W代替了R。实施例14

为评估第2位的变化是否影响肽的抗原性，6个GAGE的cDNA各自和HLA-Cw6的cDNA一起转染COS细胞，由上文所述的CTL76/6测定其对转染子的识别。只有GAGE-1和GAGE-2转染的细胞被识别，表明在此实验中GAGE-3，4，5和6编码的修饰肽不是抗原性的。分析上文所述的14个其它克隆的5’末端序列，表明他们中的7个包含编码抗原肽的序列，因此可能对应于GAGE-1或GAGE-2。实施例15

以上所用的检验在肿瘤样品中GAGE表达的PCR引物，不能区别GAGE-1或2和其它的四个不编码抗原MZ2F的GAGE cDNA。制备一套新的特异性地扩增GAGE-1和2而非GAGE-3，4，5的引物。这些引物是：

VDE44 5’-GAC CAA GAC GCTACG-3’(SEQID NO：9)

VDE24 5’-CCA TCAGGA CCA TCT-3’(SEQID NO：10)如上所述，这些引物在下列温度条件下用于使用聚合酶的RT-PCR反应：

94℃40分钟

30个循环

         94℃ 1分钟

         56℃ 2分钟

         72℃ 3分钟

72℃ 15分钟

表3给出了分析结果。

表3肿瘤样品和肿瘤细胞系的GAGE基因表达组织类型               GAGE阳性肿瘤数

              所有GAGE基因^*   GAGE-1和2^**肿瘤样品黑素瘤

      原位    5/39             5/39(13％)

      转移    47/132           36/131(27％)肉瘤              6/20             6/20(30％)肺癌NSCLC         14/65            12/64(19％)头颈扁平细胞癌    13/55            10/54(19％)前列腺癌          2/20             2/20乳房癌            18/162           14/162(9％)膀胱癌

 表面的       1/20             1/20

 浸润的       5/26             3/26睾丸精原细胞瘤    6/6              5/6结肠直肠癌        0/43白血病和淋巴瘤    0/25肾癌              0/46肿瘤细胞系黑素瘤            45/74            40/74(54％)肉瘤              1/4              1/4肺癌

 SCLC         7/24             7/24(29％)

 NSCLC        1/2              1/2间皮瘤            5/19             5/19(26％)头颈扁平细胞癌    0/2乳房癌            1/4              0/4膀胱癌            0/3结肠癌            5/13             5/13白血病            3/6              1/6淋巴瘤            0/6肾癌              0/6

^*用VDE-18和VDE-24引物对总RNA经RT-PCR检测GAGE的表达，检测到所有的GAGE基因。对来源于MZ2-MEL的DNA上用这些引物分析没有观察到PCR产物。

^**用VDE-44和VDE-24引物对总RNA经RT-PCR检测GAGE-1和GAGE-2的表达，其将GAGE-1及2与其它四个GAGE基因区别开。对来源于MZ2-MEL的DNA用这些引物分析没有观察到PCR产物。

在进一步工作中，设计扩增所有GAGE基因的新的引物，以确定在正常组织中没有它们之中的任何一个表达，这些引物是：

VDE43 5’-GCG GCC CGA GCA GTT CA-3’(SEQ ID NO：11)

VDE24 5’-CCA TCA GGA CCA TCT TCA-3’(SEQ ID NO：10)

如利用VDE44和VDE24引物进行PCR一样使用这些引物，结果列于表4中。这些结果确认除了精巢以外，正常的组织都是阴性的。

 表4在正常成人和胎组织中GAGE基因的表达成人组织                                     GAGE表达肾上腺                                       -良性痣                                       -骨髓                                         -脑                                           -乳腺                                         -小脑                                         -结肠                                         -心脏                                         -肾                                           -肝                                           -肺                                           -黑素细胞                                     -肌肉                                         -卵巢                                         -前列腺                                       -皮肤                                         -脾细胞                                       -胃                                           -精巢                                         +胸腺细胞                                     -膀胱                                         -子宫                                         -胎盘                                         -脐带                                         -胎组织*成纤维细胞                                   -脑                                           -肝                                           -脾                                           -胸腺                                         -精巢                                         +

^*通过利用VDE-44和VDE-24引物对总RNA经RT-PCR扩增检测GAGE的表达，检测到所有的GAGE基因(图7)。用“-”表示没有PCR产物，用“+”表示存在PCR产物，在来源于MZ2-MEL的DNA上分析这些引物，没有观察到PCR产物。

^*胎组织来源于20周以上的胎儿。实施例16

在此处没有描述的工作中，已经确定胞溶性T细胞克隆CTL(Van der Eyndeet等，Int.J.Cancer44：634-640(1989)，本文一并参考)不能识别黑素瘤细胞MZ2-MEL.3.1。Van der Bruggen等已报道(欧洲免疫学杂志24：2134-2140(1994)此黑素瘤细胞系已经丧失MHC分子HLA-A29、HLA-B24和HLA-Cw^*1601的表达。开展研究以确定用MHC分子之一转染是否会使该黑素瘤细胞系对CTL 22/23敏感。HLA-A29是第一个试验的分子。为此，利用市售的提取试剂盒，按照厂商的说明，从HLA-A29细胞系MZ2-MEL.43提取了多聚腺苷酸RNA。然后，利用标准方法将mRNA转化成cDNA，大小分级分离，然后单向插入到质粒pcDNA-I/Amp的BstI和NotI位点。将质粒电穿孔进入大肠杆菌菌株DH5α5’IQ，然后用氨苄青霉素(50ug/ml)筛选。细菌铺板到硝基纤维素滤膜上并复制。制备滤膜，然后在6xSSC/0.1％SDS/lx Denhardt溶液中于40℃过夜杂交，利用³²P标记探针：5’-ACTCCATGAGGTATTTC-3’(SEQ ID NO：19)此探针是在大多数HLA序列的起始密码子周围的一个序列。

在室温条件下洗涤滤膜两次，每次在6xSSC中清洗5分钟，然后在43℃在6xSSC中洗涤两次。然后用如下探针筛选的阳性序列，所述探针为5’-TTTCACCACATCCGTGT-3’(SEQ ID NO：20)此探针已用³²P标记，这个序列对HLA-A29是特异的，由参考有关免疫感兴趣序列和蛋白质的Kabat数据库(本文一并参考)确定。此数据库可在NCBI(美国)或者在Solte网((国际互联网)网址：WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV.)得到。在室温条件下洗涤滤膜两次，每次在6xSSC中清洗5分钟，然后42℃在6xSSC中洗涤两次(每次5分钟)。实施例17

阳性HLA-A29克隆分离后，将其利用DEAE-葡聚糖氯喹法(如上文所述)转染到COS-7中。简言之，利用含有HLA-A29的50ng质粒pcDNA-I/Amp和100ng cDNA处理1.5×10⁴个COS-7细胞，所述cDNA包含上文所述的GAGE序列任何一种，或在质粒pcDNAα-I或pcDSR-α中的现有技术MAGE或BAGE序列之一。然后，在37℃培养转染子24小时。

通过CTLs，利用上文实施例4叙述的方法检验转染子刺激TNF产生的能力。

图7描述了研究的结果，表明利用GAGE-3，4，5或6之一和HLA-A29作为转染子得到高水平的TNF产生。相反地，GAGE-1和2不能刺激CTL克隆22/23，因此得出这样结论：GAGE-3，4，5和6被加工为由HLA-A29分子呈递的一个抗原或一些抗原，且能由CTL22/23识别。实施例18

GAGE-3、4、5和6被加工成HLA-A29+细胞呈递的肽，而GAGE-1和2却不能，这个事实表明检验到GAGE-3、4、5和6共有的推定的氨基酸序列在GAGE-1和2中没有。鉴别了以下这个序列：Arg Ser Thr Tyr Tyr Trp Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Gln (SEQ ID NO：21)合成此肽，冷冻干燥，然后溶解在1体积DMSO，9体积10mM醋酸水溶液中。这种方法用于下面所讨论的其它的合成肽。

按照上面所描述的方法，在⁵¹Cr释放实验中检验肽(SEQID NO：21)。

发现这个肽确实引起溶解。制备依次的缺失，同样利用⁵¹Cr溶解测定法检验他们引起溶解的能力。在图9中描述了这部分工作。发现引起溶解的最短的肽是：Tyr Tyr Trp Pro Arg Pro Arg Arg Tyr (SEQ ID NO：22)，这是GAGE-3至GAGE--6所共有的。具体地，GAGE-3的10-18位氨基酸、GAGE-4，5，6的9-17位氨基酸相当于此肽。

图9所示的和，例如由SEQ ID NO：21和22代表的此肽家族的成员与Toubert等描述的资料不相符(“HLA-A29肽结合基序”，摘要4183，第九届国际免疫学会议，1995年7月23-29日，旧金山，CA，本文一并参考)。按照Toubert等，在任何一个和HLA-A29结合的肽的第三位至少需要一个苯丙氨酸(Phe)残基。在本文所表现出的并不是这种情况。

以上实施例显示了编码肿瘤排斥抗原前体和肿瘤排斥抗原的核酸分子的分离。然而，这些分子和任何以前公开的以上参考文献阐述的MAGE和BAGE编码序列均不同源。因此，本发明的一个方面是分离的核酸分子，其包括SEQ ID NO：1-6任何一个所示的核苷酸序列以及其片段，如SEQ ID NO：1的1-170位核苷酸和51-170位核苷酸或者加工成肿瘤排斥抗原的任何其它片段。SEQ ID NO：1-6的序列既不是MAGE编码序列，也不是BAGE编码序列，通过把那些序列同所引用的参考文献中描述的基因中的任何一个的序列比较，将看到这一点。本发明的另一部分是这样的核酸分子，这些分子也编码非MAGE和非BAGE肿瘤排斥抗原前体，但是这些分子在严格的条件下同包含SEQID NO：1的所描述的核苷酸序列的核酸分子杂交。这里所用的术语＂严格条件＂涉及到一些本领域所熟悉的参数，具体地，作为本文所用的严格条件，指在1M NaCl、1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯中65℃条件下杂交18小时，其后在2xSSC中在室温下两次洗涤滤膜5分钟，接下来是在2xSSC，0.1％SDS中在65℃时洗涤30分钟。还有一些可以利用的其它条件，试剂等，这导致相同或更高的严格程度。技术人员将熟悉这样的条件，因此这里就不列出。

从本实施例中也将看出，本发明包括序列在表达载体中的用途，以及转化或转染宿主细胞和细胞系，这些是原核(例如，大肠杆菌)或真核(例如CHO或COS细胞)。表达载体需要相关的序列，即以上所描述的那些，可操作地与启动子连接。现已发现人类白细胞抗原HLA-Cw6和HLA-A29都呈递从这些基因衍生出来的肿瘤排斥抗原，表达载体也可以包括编码HLA-Cw6或HLA-A29两个之一的核酸分子。在载体包含两种编码序列情况下，可以用其转染正常情况不表达任何一个的细胞。肿瘤排斥抗原前体编码序列也可以单独利用，例如，在宿主细胞已表达HLA-Cw6和HLA-A29中的一个或两个时。当然，在能被利用的特定的宿主细胞上没有限制。如果需要的话，包含两种编码序列的载体可以用于呈递HLA-A29或HLA-Cw6的细胞，肿瘤排斥抗原前体的基因能用于不能表达HLA-A29或HLA-Cw6的宿主细胞中。

本发明也包括所谓的表达试剂盒，其使得技术人员能够制备一个需要的表达载体或多个载体。这样的表达试剂盒至少包括每一个以前所讨论的编码序列中独立的部分。按照需要，可以添加其它的组分，只要所需的以前所述的序列包含于其内。

为了把本发明的核酸分子以及TRAPs和以前所描述的MAGE和BAGE材料区别开，本发明被称作GAGE基因家族和TRAPs。因此，当在本文中使用＂GAGE＂时，它指由前述序列编码的肿瘤排斥抗原前体，＂GAGE编码分子＂和类似的术语用来描述核酸分子本身。

本文描述的本发明有许多用途，其中的一些这里作描述。首先，本发明使得技术人员可以诊断以表达TRAP或呈递肿瘤排斥抗原为特征的疾病，例如黑素瘤。这些方法涉及测定TRAP基因表达，和/或由其衍生的TRAs，如由HLA-Cw6或HLA-A29呈递的TRA。在前者的情况下，这种测定是通过任何标准的核酸测定方法进行的，包括聚合酶链反应或以标记的杂交探针测定。在后一情况下，用TRA和HLA复合物的结合配体(如抗体)来测定是尤其优选的。另一个测定方法是以上描述类型的TNF释放测定。为完成此项分析测定，优选确认不存在精巢细胞，因为这些细胞正常表达GAGE。然而，当人们能常规地区分精巢细胞和其它类型细胞时，这种方法不是必要的。而且在实践上在非睾丸样品中有精巢细胞存在是不可能的。

TRAP基因的分离也使TRAP分子本身的分离成为可能，尤其是分离含有SEQID NO：2-6中任何之一编码的氨基酸序列的TRAP。这些分离的分子，当作为TRA或TRA和HLA例如HLA-Cw6或HLA-A29的复合物存在时，可与佐剂等材料结合以生产有用的疫苗来治疗以TRAP分子表达为特征的疾病。

例证性的佐剂包括弗氏完全和不完全的佐剂、灭活的B.pertussis生物体、＂BCG＂或Bacille Calmente-Guerin、氢氧化铝、胞壁酰二肽和它的衍生物，它们可以在可代谢的油中乳化，如鲨烯、单磷酰基脂A(MPL)、匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)、皂苷提取物如QA-7、QA-19和QA-21(也称为QS-21)(这些在Kensil等的美国专利5,057,540都已有描述，本文一并参考)，MTP-MF59、N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲铵硫酸二甲酯(DOTAP)、阳离子两亲物DOTMA、中性磷脂如DOPE，以及这些物质的组合物。以上所列绝非全部，普通的技术人员能够完善此列举。本文包含所有附加的佐剂。

此外，也可以由在其表面上呈递TRA/HLA复合物的细胞制备疫苗，如非增殖的癌细胞、非增殖的转染子等。在细胞用作疫苗的所有情况下，这些细胞可以是用编码一个或两个提供CTL反应必需组分的序列转染的细胞，或是没有转染而表达两个分子的细胞。并且，TRAP分子、它相关的TRAs以及TRA和HLA的复合物，通过本领域公知的标准技术，都可以用来产生抗体。

当“疾病”用于本文时，它是指表达肿瘤排斥抗原前体的任何病理状态。这种疾病的一个例子是癌，特别是黑素瘤。黑素瘤作为一种产生色素的癌细胞是公知的。

如以上表明，肿瘤排斥抗原，如SEQ ID NO：4所述的，也是本发明的一部分。多肽也是本发明的一部分，如包含8-16个氨基酸的分子，只要此多肽包含SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列。如实施例表明的，长于SEQ ID NO：4八聚物的多肽由呈递HLA-Cw6的癌细胞加工成SEQ ID NO：4的肿瘤排斥抗原，并且呈递这些多肽。呈递作用通过存在于体液样品的胞溶性T-淋巴细胞和呈递这种复合物的细胞接触导致溶解。同样地，长于SEQ ID NO：22肽，如SEQ ID NO：21，被癌细胞(如HLA-A29阳性细胞)加工成合适的TRA，并被呈递。

因此，本发明的另一个特征是具有9-16个氨基酸长且包含以下序列的任何肽：

Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr    (SEQ ID NO：23)其中Xaa是任何氨基酸。这些肽与HLA-A29分子结合和/或加工成和HLA-A29分子结合的肽。实施例表明了这些肽被加工成肿瘤排斥抗原这一事实。

这种性质可以用于与其它参数一起确认病理情况诊断，如癌，特别是黑素瘤的诊断。例如，研究者可以研究血液或尿之中的抗原，观察其生理变化，，然后利用本文所描述的CTL增殖方法确认黑素瘤的诊断。

依据本发明的肽本身可以用于HLA分型测定。当需要进行皮肤移植、器官移植等，必须完成HLA分型测定以最大限度地减少移植排斥的可能性，这一点是公知的。本发明的肽可以用来确定个体是HLA-Cw6还是HLA-A29阳性，以便可以选择适当的供体。这种测定简单易行，将本发明的肽和感兴趣样品接触，其和样品中的细胞结合指示提取样品的个体是HLA-Cw6或HLA-A29阳性。人们可以标记肽本身，将其和标记的接头缀合或以其它的方式结合，将他们固定在固相中等等，以便优化这种测定。对技术人员来说，其它的标准方法是清楚的，本文不必表述。

以此公开内容为基础的治疗方法是以受治疗者的导致呈递TRA的细胞(如HLA-A29 HLA-Cw6细胞)溶解的免疫系统反应为前提。这样一种方法是施用特异于复合物的CTL给具有待定表型的异常细胞的受治疗者。体外产生这样的CTLs在技术人员的知识范围内。具体地说，使细胞的样品(如血细胞)和呈递复合物并且能激发特异性CTL增殖的细胞接触，靶细胞可以是转染子，如上文所描述类型的COS细胞。这些转染子在他们的表面上呈递所需的复合物，并且当与感兴趣CTL结合时，刺激其增殖。象本文利用的COS细胞是很容易得到的，其它合适的宿主细胞也是很容易得到的。

详细地说，称之为过继转移法(Greenberg，J.Immunol.136(5)：1917(1986)；Riddel等，Science：257 238(7-10-92)；Lynch等，Eur.J.Immunol.21：1403-1410(1991)；Kast等，Cell 59：603-614(11-17-89))的这种治疗方法，是将呈递所需复合物的细胞和CTLs合并以导致特异于其的CTL增殖。把增殖的CTLs施用给具有细胞异常的受治疗者，所述的细胞异常的特征是具有某些呈递特定复合物的异常细胞，其中特定复合物包含相关的HLA分子。其后CTLs溶解异常细胞，进而完成所要求的治疗目的。

以上疗法假定至少受治疗者的一些异常细胞呈递相关HLA/TRA复合物。这很容易测定出来，因为本领域十分通晓用于鉴定细胞呈递特定HLA分子的方法，也知道如何鉴定表达相关序列(在此为GAGE序列)的RNA的细胞。通过以上筛选方法鉴别出呈递相关复合物的细胞后，它们就能和病人的包含CTLs的样品结合。如果呈递复合物的细胞被混合的CTL样品溶解，那么就能够假定GAGE衍生的肿瘤排斥抗原被呈递，这个受治疗者就是以上所述的治疗方法的合适的候选人。

依据本发明，过继转移法不是可供使用的疗法的唯一形式，利用一些方法，CTLs也能在体内产生。例如一种利用非增殖细胞表达复合物的方法，上文已经作了详细描述。用于此法的细胞可以是那些正常表达复合物的细胞，如照射的黑素瘤细胞或用一个或两个呈递复合物的所需基因转染的细胞。Chen等(美国科学院学报88：110-114(1月1991年))举例说明了这种方法，示出在治疗中应用转染细胞表达HPV E7肽。各种细胞类型都可以利用。同样地，携带一个或两个感兴趣基因的载体也可以利用，病毒或细菌载体是尤其优选的。在这个体系中，感兴趣的基因由例如一种牛痘病毒或细菌BCG携带，并且这些物质确实感染宿主细胞。得到的细胞呈递感兴趣复合物并能被自身CTLs识别，之后CTL增殖。把肿瘤排斥抗原或其前体和能促进掺入到HLAL-Cw6呈递细胞(然后呈递感兴趣的HLA/肽复合物)的佐剂组合，也能获得同样的结果。TRAP被加工以产生HLA分子的肽配体但TRA呈递无须进一步加工。

本领域技术人员对本发明的其它方面将会很清楚，在这里就不必赘述了。

使用的术语和表述是说明性而不是限制性的，利用这样的术语和表述并无意排除任何一个显示和描述的特征的等同物或其部分，应认识到在本发明的范围内，各种修改是可能的。

                            序列表

(1)一般信息：

    (i)申请人：皮埃尔·范德布鲁根，贝努瓦·范登艾恩德，奥利维尔·德巴克，蒂尔瑞·博恩-法勒尔

    (ii)发明名称：编码GAGE肿瘤排斥抗原的分离的截短的核酸分子，

              肿瘤排斥抗原和其用途

    (iii)序列数：18

    (iv)通讯地址：

        (A)收信人：Felfe & Lynch

        (B)街道：805 Third Avenue

        (C)城市：纽约市

        (D)州：纽约

        (E)国家：美国

        (F)ZIP：10022

    (v)计算机可读形式：

        (A)媒介类型：软盘，5.25英寸，360kb存储量

        (B)计算机：IBM PS/2

        (C)操作系统：PC-DOS

        (D)软件：Wordperfect

    (vi)当前申请数据：

        (A)PCT/US96/00381

        (B)申请日：11-1-1996

    (vii)在先申请数据：

        (A)申请号：08/531,662

        (B)申请日：21-9-1995

        (C)分类号：435

    (vii)在先申请数据：

        (A)申请号：08/370,648

        (B)申请日：10-1-1995

    (vii)在先申请数据：

        (A)申请号：08/250,162

        (B)申请日：27-5-1994

    (vii)在先申请数据：

        (A)申请号：08/096,039

        (B)申请日：22-7-1993

    (viii)律师/代理人信息：

        (A)姓名：Hanson，Norman D.

        (B)登记号：30,946

        (c)案号：LUD 5323.3-PCT

    (ix)电信信息：

        (A)电话：(212)688 9200

        (B)传真：(212)838 3884(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：646个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CTGCCGTCCG GACTCTTTTT CCTCTACTGA GATTCATCTG TGTGAAATAT       50GAGTTGGCGA GGAAGATCGA CCTATCGGCC TAGACCAAGA CGCTACGTAG      100AGCCTCCTGA AATGATTGGG CCTATGCGGC CCGAGCAGTT CAGTGATGAA      150GTGGAACCAG CAACACCTGA AGAAGGGGAA CCAGCAACTC AACGTCAGGA      200TCCTGCAGCT GCTCAGGAGG GAGAGGATGA GGGAGCATCT GCAGGTCAAG      250GGCCGAAGCC TGAAGCTGAT AGCCAGGAAC AGGGTCACCC ACAGACTGGG      300TGTGAGTGTG AAGATGGTCC TGATGGGCAG GAGATGGACC CGCCAAATCC      350AGAGGAGGTG AAAACGCCTG AAGAAGAGAT GAGGTCTCAC TATGTTGCCC      400AGACTGGGAT TCTCTGGCTT TTAATGAACA ATTGCTTCTT AAATCTTTCC      450CCACGGAAAC CTTGAGTGAC TGAAATATCA AATGGCGAGA GACCGTTTAG      500TTCCTATCAT CTGTGGCATG TGAAGGGCAA TCACAGTGTT AAAAGAAGAC      550ATGCTGAAAT GTTGCAGGCT GCTCCTATGT TGGAAAATTC TTCATTGAAG      600TTCTCCCAAT AAAGCTTTAC AGCCTTCTGC AAAGAAAAAA AAAAAA          646(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：18个碱基对

    (B)类型型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

AGACGCTACG TAGAGCCT                             18(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：18个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQID NO：3：

CCATCAGGAC CATCTTCA                            18(2)SEQ ID NO：4的信息

(i)序列特征：

    (A)长度：8个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：  Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr

               5(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：9个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQID NO：5：  Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr

               5(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：9个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQID NO：6：  Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val

               5(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：10个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：  Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val

              5                   10(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：9个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Glu

              5(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：18个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：GACCAAGACG CTACGTAG                          18(2)SEQ ID NO：10信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：18个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：CCATCAGGAC CATCTTCA                            18(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：17个碱基对

    (B)型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：GCGGCCCGAG CAGTTCA                            17(2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：15个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Met Ser Trp Arg Gly Arg Ser Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg

              5                 10                  15(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：16个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Glu Pro Pro Glu Met Ile

             5                  10                   15(2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：538个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：ACGCCAGGGA GCTGTGAGGC AGTGCTGTGT GGTTCCTGCC GTCCGGACTC      50TTTTTCCTCT ACTGAGATTC ATCTGTGTGA AATATGAGTT GGCGAGGAAG      100ATCGACCTAT CGGCCTAGAC CAAGACGCTA CGTAGAGCCT CCTGAAATGA      150TTGGGCCTAT GCGGCCCGAG CAGTTCAGTG ATGAAGTGGA ACCAGCAACA      200CCTGAAGAAG GGGAACCAGC AACTCAACGT CAGGATCCTG CAGCTGCTCA      250GGAGGGAGAG GATGAGGGAG CATCTGCAGG TCAAGGGCCG AAGCCTGAAG      300CTCATAGCCA GGAACAGGGT CACCCACAGA CTGGGTGTGA GTGTGAAGAT      350GGTCCTGATG GGCAGGAGAT GGACCCGCCA AATCCAGAGG AGGTGAAAAC      400GCCTGAAGAA GGTGAAAAGC AATCACAGTG TTAAAAGAAG ACACGTTGAA      450ATGATGCAGG CTGCTCCTAT GTTGGAAATT TGTTCATTAA AATTCTCCCA      500ATAAAGCTTT ACAGCCTTCT GCAAAGAAAA AAAAAAAA                   538(2)SEQ ID N0：15的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：560个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：CTCATATTTC ACACAGATGA GTTGGCGAGG AAGATCGACC TATTATTGGT      50CTAGGCCAAT AATAGGTCGA TCTTCCTCGC CAACTCATAT TTCACACAGA      100TGAATCTCAG TAGAGGAAAA TCGACCTATT ATTGGCCTAG ACCAAGGCGC      150TATGTACAGC CTCCTGAAGT GATTGGGCCT ATGCGGCCCG AGCAGTTCAG      200TGATGAAGTG GAACCAGCAA CACCTGAAGA AGGGGAACCA GCAACTCAAC      250GTCAGGATCC TGCAGCTGCT CAGGAGGGAG AGGATGAGGG AGCATCTGCA      300GGTCAAGGGC CGAAGCCTGA AGCTGATAGC CAGGAACAGG GTCACCCACA      350GACTGGGTGT GAGTGTGAAG ATGGTCCTGA TGGGCAGGAG ATGGACCCGC      400CAAATCCAGA GGAGGTGAAA ACGCCTGAAG AAGGTGAAAA GCAATCACAG      450TGTTAAAAGA AGGCACGTTG AAATGATGCA GGCTGCTCCT ATGTTGGAAA      500TTTGTTCATT AAAATTCTCC CAATAAAGCT TTACAGCCTT CTGCAAAGAA      550AAAAAAAAAA                                                  560(2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：540个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：CGCCAGGGAG CTGTGAGGCA GTGCTGTGTG GTTCCTGCCG TCCGGACTCT      50TTTTCCTCTA CTGAGATTCA TCTGTGTGAA ATATGAGTTG GCGAGGAAGA      100TCGACCTATT ATTGGCCTAG ACCAAGGCGC TATGTACAGC CTCCTGAAAT      150GATTGGGCCT ATGCGGCCCG AGCAGTTCAG TGATGAAGTG GAACCAGCAA      200CACCTGAAGA AGGGGAACCA GCAACTCAAC GTCAGGATCC TGCAGCTGCT      250CAGGAGGGAG AGGATGAGGG AGCATCTGCA GGTCAAGGGC CGAAGCCTGA      300AGCTGATAGC CAGGAACAGG GTCACCCACA GACTGGGTGT GAGTGTGAAG      350ATGGTCCTGA TGGGCAGGAG ATGGACCCGC CAAATCCAGA GGAGGTGAAA      400ACGCCTGAAG AAGGTGAAAA GCAATCACAG TGTTAAAAGA AGGCACGTTG      450AAATGATGCA GGCTGCTCCT ATGTTGGAAA TTTGTTCATT AAAATTCTCC      500CAATAAAGCT TTACAGCCTT CTGCAAAAAA AAAAAAAAAA                 540(2)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：532个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：AGCTGTGAGG CAGTGCTGTG TGGTTCCTGC CGTCCGGACT CTTTTTCCTC      50TACTGAGATT CATCTGTGTG AAATATGAGT TGGCGAGGAA GATCGACCTA      100TTATTGGCCT AGACCAAGGC GCTATGTACA GCCTCCTGAA GTGATTGGGC      150CTATGCGGCC CGAGCAGTTC AGTGATGAAG TGGAACCAGC AACACCTGAA      200GAAGGGGAAC CAGCAACTCA ACGTCAGGAT CCTGCAGCTG CTCAGGAGGG      250AGAGGATGAG GGAGCATCTG CAGGTCAAGG GCCGAAGCCT GAAGCTGATA      300GCCAGGAACA GGGTCACCCA CAGACTGGGT GTGAGTGTGA AGATGGTCCT      350GATGGGCAGG AGATGGACCC GCCAAATCCA GAGGAGGTGA AAACGCCTGA      400AGAAGGTGAA AAGCAATCAC AGTGTTAAAA GAAGGCACGT TGAAATGATG      450CAGGCTGCTC CTATGTTGGA AATTTGTTCA TTAAAATTCT CCCAATAAAG      500CTTTACAGCC TTCTGCAAAG AAAAAAAAAA AA                         532(2)SEQ ID NO：18的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：539个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链    

    (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：GCCAGGGAGC TGTGAGGCAG TGCTGTGTGG TTCCTGCCGT CCGGACTCTT      50TTTCCTCTAC TGAGATTCAT CTGTGTGAAA TATGAGTTGG CGAGGAAGAT      100CGACCTATTA TTGGCCTAGA CCAAGGCGCT ATGTACAGCC TCCTGAAGTG      150ATTGGGCCTA TGCGGCCCGA GCAGTTCAGT GATGAAGTGG AACCAGCAAC      200ACCTGAAGAA GGGGAACCAG CAACTCAACG TCAGGATCCT GCAGCTGCTC      250AGGAGGGAGA GGATGAGGGA GCATCTGCAG GTCAAGGGCC GAAGCCTGAA      300GCTGATAGCC AGGAACAGGG TCACCCACAG ACTGGGTGTG AGTGTGAAGA      350TGGTCCTGAT GGGCAGGAGG TGGACCCGCC AAATCCAGAG GAGGTGAAAA      400CGCCTGAAGA AGGTGAAAAG CAATCACAGT GTTAAAAGAA GACACGTTGA      450AATGATGCAG GCTGCTCCTA TGTTGGAAAT TTGTTCATTA AAATTCTCCC      500AATAAAGCTT TACAGCCTTC TGCAAAAAAA AAAAAAAAA                  539