辣椒植物遗传转化和再生的方法

摘要

本发明属于植物遗传转化和再生的方法,特别是关于利用辣椒外植体下胚轴进行遗传转化和再生的方法。通过辣椒下胚轴和携带外源基因的农杆菌共培养,转化后的下胚轴经过诱导培养、选择性的诱导培养、选择性的再生培养可得到辣椒转化后的再生芽,再生芽通过选择性芽伸长培养和选择性生根培养,可以由伸长的茎芽生长为有正常根的完整植株。本方法获得的辣椒植株,经PCR分析表明辣椒染色体中已整合有CMV－CP基因和TMV－CP基因并有明显的抗CMV和TMV的能力。T2代纯合系有稳定的遗传性。

说明书

本发明是属于植物遗传转化和再生的方法，特别是关于辣椒植物的遗传转化和再生方法。

目前，许多植物遗传学家选择高等植物为材料进行有关目的基因的转化和再生，以期达到改造植物体，使其具有某种新的特征。例如，作为备受人们喜欢的蔬菜辣椒(pepper)是茄科(Solanaceae)辣椒属(Capsicum)，富含维生素C，还可用于制作辣椒干粉和天然色素。但辣椒栽培中辣椒能被多种植物病毒如黄瓜花叶病毒(CMV)，烟草花叶病毒(TMV)，马铃薯Y病毒(PVY)，番茄斑萎病毒(TSWV)等感染，有时数种病毒混合侵染，从而导致辣椒大幅度减产和质量低劣。所以辣椒被列入转化抗病基因的寄主。

自七十年代末期至今，国内外有关从辣椒子叶、下胚轴、原生质体、愈伤组织、花粉、胚、茎尖等外植体和组织再生成完整植株报道也有一些，但不易重复或再生成完整植株的频率太低。尽管都想通过转化导入抗病的外源基因，由于上述原因有的只能得到抗卡那霉素的分化芽，成功的例子极少。

1989年Saito等在美国植物生理学会年会上报告了外植体经农杆菌介导的转化，外植体产生愈伤组织；1990年Liu等在Plant CellRep.9：360-364报道了农杆菌介导的转化，农杆菌与外植体下胚轴和子叶及叶组织共培养后得到少量分化的芽和类似叶的结构，能检测到GUS基因的瞬间表达，但没有得到再生的完整植株；1991年王玉文等在植物学报33(10)：780-786报道以子叶为外植体进行转化，在子叶上检测到GUS基因瞬间表达，只得到了抗卡那霉素再生芽；1992年董春枝等在园艺学报19(2)：184-186报道了以子叶为外植体，经农杆菌介导的转化，得到了再生植株；1993年叶志彪等在植物学报35(增刊)：88-93报道了以子叶为外植体经农杆菌介导的转化后得到8株再生植株，经检测均含有NPTII基因；1994年张宗江等在华北农学报9(3)：67-71报道了以子叶为外植体经农杆菌介导的转化，62个再生植株中有12个抗卡那霉素阳性株，其染色体已整合了CMV-CP基因，子代接种CMV后筛选到5个抗CMV株系。

1993年11月16日Engler等人美国专利，专利号：5262316，“Genetically transformed pepper plants and Methods for theirproduction”是用幼胚子叶或展开子叶为外植体经农杆菌介导的转化，与农杆菌共培养后不通过愈伤直接诱导转化的再生芽，发根后产生完整植株，外源DNA被稳定地整合到再生辣椒植物的染色体中并能表达外源DNA编码的基因。

综述目前国内外的现有技术，还未见过用辣椒下胚轴为外植体进行遗传转化，并获得成功的例子。

本发明特点是以辣椒下胚轴为外植体而不是以子叶为外植体经农杆菌介导的转化.本文所使用的农杆菌是指利用CaMV35S启动子和rbcS的转录终止信号构建的能同时表达CMV-CP基因和TMV-CP基因中间载体以及只表达TMV-CP基因中间载体，通过三亲交配转入到含去毒Ti质粒的农杆菌(见科学通报1990年第一期1358-1359页)。由农杆菌转化后的下胚轴经诱导培养，选择性的诱导、再生、伸长、生根培养，多次反复实验表明转化后均能得到辣椒的再生完整植株。在以农杆菌为介导引入CMV-CP和TMV-CP基因获得对CMV和TMV具有抗性的辣椒的研究中，PCR分析证明CMV-CP基因和TMV-CP基因或TMV-CP基因已整合到辣椒的染色体中。子代(T1代)植株在温室同时接种提纯的CMV和TMV后表现抗性，抗病的T1代的子代用卡那霉素筛选出100％抗卡那霉素的T2代纯合系，PCR分析表明外源抗病基因稳定地遗传。其它有用基因也能应用该转化和再生方法引入辣椒，是辣椒遗传育种新途径之一。

本发明采用辣椒下胚轴为外植体进行转化和再生的具体方法是：

选用成熟的辣椒种子，浸泡在0.1％HgCl2(含0.1％吐温-20)中1-2分钟进行表面消毒，用无菌水充分淋洗后转移到实生苗生长培养基(1/2MS，3％蔗糖，0.6％琼脂，pH5.8)，28℃黑暗培养9天后可得到大约4cm高的黄色实生苗，转移至组培间于25℃±2℃，光照的条件下再继续培养3-5天，绿色的12-14天苗龄实生苗是切取下胚轴用于转化的最好材料。

转化实验前一天按常规方法培养农杆菌，培养基中添加乙酰丁香酮其浓度范围可以在25-75毫克/升，28℃200rpm振荡培养16小时左右，转化前菌液用pH7.0的MS液体培养基(含3％蔗糖，乙酰丁香酮的含量可以在25-75毫克/升之间)稀释到O.D560nm＝0.1-0.3。室温放置备用。

在培养皿中切取12-14天实生苗的下胚轴(一次操作以20个下胚轴为宜)，加入3ml稀释好的农杆菌菌液，摇动培养皿，使菌液充分接触下胚轴两端伤口，2分钟后吸尽菌液，将下胚轴转移到铺有干滤纸的培养皿中，当干滤纸吸掉下胚轴上剩余的菌液后速将下胚轴转移到含诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+1.0-3.0毫克/升BA(6-苄基腺嘌呤)+0.1-1.0毫克/升IAA(吲哚乙酸)，pH5.8)培养皿中，用Parafilm封闭培养皿，置25℃±2℃黑暗共培养1-3天。

共培养2天后下胚轴被转移到选择性诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+1.0-3.0毫克/升BA+0.1-1.0毫克/升IAA+75毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)选择转化的细胞，50ml广口三角并放10-20个下胚轴，用能经受高压灭菌的透明塑料薄膜封口，置25℃±2℃，光照培养2-5天。

共培养2天，选择性诱导培养2-5天，共5天后将下胚轴转移到选择性再生培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+0.1-1.0毫克/升BA+0.01-0.1毫克/升IAA+75毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)，二至三周后转移到50毫克/升卡那霉素的选择性再生培养基，每隔2-3周更换一次新鲜培养基。置25℃±2℃，光照培养。下胚轴与农杆菌共培养后2-4周，从下胚轴两端切口外周膨大的淡黄绿色愈伤处长出数个再生芽，12-15％下胚轴在选择性再生培养基长出再生芽。

切下再生芽转移到选择性芽伸长培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+0.05-0.20毫克/升IAA+50毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)。每隔2-3周更换一次新鲜培养基。置25℃±2℃，光照培养。

待再生芽伸长至约2cm并有2-3个节时，从基部将茎芽切下转移到选择性生根培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+0.05-0.20毫克/升IBA(吲哚丁酸)+50毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)，光照培养。两周后长出正常的根。

从三角并中小心取出完整植株，用自来水洗净培养基后移植到置有蛭石的小花盆，施加液体MS培养基(含0.1毫克/升IBA)一次，置温室阴凉处(注意保湿)，数天后移栽到灭过菌的土壤中即为转化了的抗卡那霉素再生辣椒植株。

实施例1：

选饱满的成熟辣椒种子100粒置于100ml烧杯，加适量0.1％HgCl2(含0.1％吐温-20)，摇动烧杯，1分半钟后用无菌水充分淋洗种子并转移到pH5.8的实生苗生长培养基(1/2MS，3％蔗糖，0.6％琼脂)，28℃黑暗培养9天后转移至25℃±2℃，光照培养4天即为13天苗龄的辣椒实生苗。

转化前一天，按常规方法培养农杆菌(携带TMV-CP基因)，但需添加30毫克/升乙酰丁香酮，28℃200rpm振荡培养16小时左右，转化时菌液用pH7.0的MS液体培养基(含3％蔗糖，30毫克/升乙酰丁香酮)稀释到O.D560nm＝0.2。

在培养皿中切取13天实生苗的下胚轴(一次操作以20个下胚轴为宜)，加入3ml稀释好的农杆菌菌液，摇动培养皿，使菌液充分接触下胚轴两端伤口，2分钟后吸尽菌液，将下胚轴转移到铺有干滤纸的培养皿中，当干滤纸吸掉下胚轴上剩余的菌液后速将下胚轴转移到含诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+2毫克/升BA+0.5毫克/升IAA，pH5.8)培养皿中，用Parafilm封闭培养皿，置25℃±2℃(黑暗)共培养2天。

共培养后下胚轴被转移到选择性诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+2毫克/升BA+0.5毫克/升IAA+75毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)选择转化的细胞，50ml广口三角并放10-20个下胚轴，用能经受高压灭菌的透明塑料薄膜封口，置25℃±2℃，光照培养三天。

三天后下胚轴转移到选择性再生培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+0.5毫克/升BA+0.05毫克/升IAA+75毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)上培养。三周后再转移到50毫克/升卡那霉素的选择性再生培养基，每隔2-3周更换一次新鲜培养基。置25℃±2℃，光照培养。

约经3周后，从下胚轴两端切口外周膨大的黄绿色愈伤处长出数个再生芽，12％下胚轴在选择性再生培养基长出再生芽，切下再生芽转移到选择性芽伸长培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+0.1毫克/升IAA+50毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)。每个三角并放1-4个再生芽，置25℃±2℃，光照培养。

待芽伸长至2cm并有2个节时，从基部将茎芽切下转移到选择性生根培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+0.1毫克/升IBA+50毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)，每个5cm×12cm圆筒形培养并放一个再生茎芽，置25℃±2℃，光照培养。两周后长出正常的白色根。

从并中小心取出完整植株，用自来水洗净培养基后移植到含蛭石小盆，施加液体MS培养基(含0.1毫克/升IBA)一次，置温室阴凉处，5天后移栽到灭过菌的土壤中，最后共得7株抗卡那霉素再生辣椒植株。PCR分析证明其中3株辣椒染色体已整合有TMV-CP基因。实施例2

选成熟辣椒种子200粒置于100ml烧杯，加适量0.1％HgCl2(含0.1％吐温-20)，摇动烧杯，1分40秒钟后用无菌水充分淋洗种子并转移到pH5.8的实生苗生长培养基(1/2MS，3％蔗糖，0.6％琼脂)，28℃黑暗培养9天后转移至25℃±2℃，光照培养3天后即为12天苗龄辣椒实生苗。

转化前一天，按常规方法培养农杆菌(携带TMV-CP和CMV-CP基因)，但需添加30毫克/升乙酰丁香酮，28℃200rpm振荡培养16小时左右，菌液用pH7.0的MS液体培养基(含3％蔗糖，30毫克/升乙酰丁香酮)稀释到O.D560nm＝0.3。

在培养皿中切取12天实生苗的下胚轴(一次操作以20个下胚轴为宜)，加入3ml稀释好的农杆菌菌液，摇动培养皿，使菌液充分接触下胚轴两端伤口，2分钟后吸尽菌液，将下胚轴转移到铺有干滤纸的培养皿中，当干滤纸吸掉下胚轴上剩余的菌液后速将下胚轴转移到含诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+2毫克/升BA+0.5毫克/升IAA，pH5.8)培养皿中，用Parafilm封闭培养皿，置25℃±2℃，黑暗共培养2天。

共培养2天后，下胚轴被转移到选择性诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+2毫克/升BA+0.5毫克/升IAA+75毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)选择转化的细胞，50ml广口三角并放10-20个下胚轴，用能经受高压灭菌的透明塑料薄膜封口，置25℃±2℃，光照培养。

三天后下胚轴转移到选择性再生培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+0.5毫克/升BA+0.05毫克/升IAA+75毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)(如图1左所示)。三周后再转移到50毫克/升卡那霉素的选择性再生培养基，每隔2-3周更换一次新鲜培养基。置25℃±2℃，光照培养。

转化后2-3周始，从下胚轴两端切口外周膨大的黄绿色愈伤处长出数个再生芽(如图1右所示)，14％下胚轴在选择性再生培养基长出再生芽，切下再生芽转移到选择性芽伸长培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+0.1毫克/升IAA+50毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)每个三角并放1-4个再生芽(如图2右所示)。置25℃±2℃，光照培养。

待芽伸长至2cm或2cm以上，并有2个节时(如图2中所示)，从基部将茎芽切下转移到选择性生根培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+0.1毫克/升IBA+50毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)，每个5cm×12cm圆筒形培养并放一个再生茎芽，置25℃±2℃，光照培养。两周后长出正常的白色根(如图2左所示)。共得到15株抗卡那霉素再生完整植株，从并中小心取出植株，用自来水洗净培养基后移植到含蛭石小盆(如图3右所示)，施加液体MS培养基(含0.1毫克/升IBA)一次，置温室阴凉处，5天后移栽到灭过菌的土壤中，缓苗后(如图3左所示)经PCR分析(如图4左半部分所示)证明其中7株辣椒染色体已整合有CMV-CP基因和TMV-CP基因，ELISA检测表明CMV-CP有不同程度表达。长至十多厘米高时移栽到大花盆，在温室正常开花结果(如图5所示)。单株自花授粉，结椒后其种子示为T1代。其中5个株系的40个T1代辣椒植株在温室长至9个叶片时在每一植株上先人工接种提纯的CMV，7天后在每一植株另外叶片上人工接种提纯的TMV。40株T1代转基因辣椒中有10株显示对CMV和TMV有抗性。如图6所示，左边一盆为转基因植株经人工接种CMV和TMV后表现高的抗病性；右边两盆为未经转化的同一品种辣椒植株人工接种CMV和TMV后显示严重病症。抗性植株自花授粉结椒后其种子示为T2代，T2代种子在含卡那霉素(300毫克/升)的MS培养基上萌发，最终筛选出7个100％抗卡那霉素的T2代纯合系。纯合系田间试种，其中1个纯合系表现高的抗病性和优良的农艺性状(如图7所示)。图8所示为未经转化的同一品种辣椒作为田间试种的对照，不抗病，表现为植株矮小、树冠小、叶片显病症、挂果期才开少量的花且易落花。实施例3

选成熟辣椒种子200粒置于100ml烧杯，加适量0.1％HgCl2(含0.1％吐温-20)，摇动烧杯，1分20秒钟后用无菌水充分淋洗种子并转移到pH5.8的实生苗生长培养基(1/2MS，3％蔗糖，0.6％琼脂)，28℃黑暗培养9天后转移至25℃±2℃，再光照培养5天即为14天苗龄实生苗。

转化前一天，按常规方法培养农杆菌(携带TMV-CP和CMV-CP基因)，但需添加30毫克/升乙酰丁香酮，28℃200rpm振荡培养16小时左右，转化时菌液用pH7.0的MS液体培养基(含3％蔗糖，30毫克/升乙酰丁香酮)稀释到0.D560nm＝0.2。

在培养皿中切取14天实生苗的下胚轴(一次操作以20个下胚轴为宜)，加入4ml稀释好的农杆菌菌液，摇动培养皿，使菌液充分接触下胚轴两端伤口，2分钟后吸尽菌液，将下胚轴转移到铺有干滤纸的培养皿中，当干滤纸吸掉下胚轴上剩余的菌液后速将下胚轴转移到含诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+2毫克/升BA+0.5毫克/升IAA)培养皿中，用Parafilm封闭培养皿，置25℃±2℃，黑暗共培养2天。

共培养2天后下胚轴被转移到选择性诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+2毫克/升BA+0.5毫克/升IAA+75毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)选择转化的细胞，50ml广口三角并放9-11个下胚轴，用能经受高压灭菌的透明塑料薄膜封口，置25℃±2℃，光照培养三天。

三天后转移到选择性再生培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+0.5毫克/升BA+0.05毫克/升IAA+75毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)三周后转移到50毫克/升卡那霉素的选择性再生培养基，每隔2-3周更换一次新鲜培养基。置25℃±2℃，光照培养。

转化后3周始，从下胚轴两端切口外周膨大的黄绿色愈伤处长出数个再生芽，11％下胚轴在选择性再生培养基长出再生芽，切下再生芽转移到选择性芽伸长培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+0.1毫克/升IAA+50毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)每个三角并放1-4个再生芽。置25℃±2℃，光照培养。

待芽伸长至2cm并有2或3个节时，从基部将茎芽切下转移到选择性生根培养基(MS+3％蔗糖+0.6％琼脂+0.1毫克/升IBA+50毫克/升卡那霉素+300毫克/升羧苄青霉素，pH5.8)，每个5cm×12cm圆筒形培养并放一个再生茎芽，置25℃±2℃，光照培养。两周后长出正常的白色根。

共得到14株抗卡那霉素再生完整植株，从并中小心取出植株，用自来水洗净培养基后移植到含蛭石小盆，施加液体MS培养基(含0.1毫克/升IBA)一次，置温室阴凉处，5天后移栽到灭过菌的土壤中，缓苗后经PCR分析证明其中6株辣椒染色体已整合有CMV-CP基因和TMV-CP基因，ELISA检测表明CMV-CP有不同程度表达。长至十多厘米高时移栽到大花盆，在温室正常开花结果。单株自花授粉，结椒后其种子示为T1代。其中2个株系的23个T1代辣椒植株在温室长至9个叶片时在每一植株上先人工接种提纯的CMV，7天后在每一植株另外叶片上人工接种提纯的TMV。23株T1代转基因辣椒中有5株显示对CMV和TMV有抗性。抗性植株自花授粉结椒后其种子示为T2代，T2代种子在含卡那霉素(300毫克/升)的MS培养基上萌发，最终筛选出3个100％抗卡那霉素的T2代纯合系。纯合系田间试种，其中2个纯合系表现抗病性。

附图说明：

图1左：下胚轴在选择性再生增养基中；

图1右：转化后经2-3周，在选择性再生增养基中，从下胚轴两端切口外周膨大的愈伤处长出再生芽；

图2右：在选择性再生培养基上长出的再生芽，切下后被转移到选择性芽伸长培养基；

图2中：再生芽在选择性芽伸长培养基中能伸长至2cm或2cm以上，并有2个节；

图2左：伸长茎芽转移到选择性生根培养基，两周后长出正常的白色根，再生成完整的植株；

图3：再生的完整植株移栽到含灭过菌土壤的小盆中；

图4：PCR分析结果：A部分：辣椒植株染色体已整合有CMV-CP基因和TMV-CP基因和TMV-CP基因；B部分：为标准分子量和相关阳性质粒作对照；

图5：植株长至十多厘米高时移栽到大花盆，在温室正常开花结果，结椒后其种子示为T1代。

图6：左边一盆为转基因植株经人工接种CMV和TMV后表现高的抗病性，且正常开花结果；右边两盆为未经转化的同一品种辣椒植株，人工接种CMV和TMV后表现高的感病性，且丧失了开花结果的能力；

图7：T2代纯合系田间试种，其中1个纯合系表现高的抗病性和优良的农艺性状；

图8：未经转化的同一品种辣椒作为田间试种的对照，不抗病，表现为植株矮小、树冠小、叶片显病症、挂果期才开少量的花且易落花。