利用散射光的测定方法及测定装置

摘要

从激光器(2)发出的激光光束(4)通过带通滤光器经准直透镜(8)照射在样品上。为了接收来自样品(10)的散射光设置有摄影透镜(12)和聚光透镜(14)的光学调整单元(10)，摄影透镜(12)接收样品(10)产生的散射光并使之平行。聚光透镜(14)是具有象散的透镜，并将来自摄影透镜(12)的平行光汇聚。在聚光透镜(14)时汇聚光位置上设置分光器(18)的入口狭缝(19)作为受光口，该入口狭缝(19)的直径约20μm。入口狭缝(19)配置在使光具有象散的聚光透镜(14)汇聚反司托克斯—拉曼散射光的位置上。

说明书

本发明涉及利用散射光的方法测定混合物样品中被分析物质、特别是尿或血浆等生物物质、定性定量测定作为其成分的葡萄糖、丙酮和尿素的方法及装置，特别涉及利用反司托克斯-拉曼(Anti-Stokes-Raman)光散射的测定方法及装置。

利用光散射方法定量测定物质浓度的方法有多种。在利用拉曼散射方法中，有利用拉曼散射强度与试料中的葡萄糖浓度成比例关系的无损测定方法(参见特开平7-49309号专利公报)。为了抑制样品产生的荧光，利用近红外光作为激发光，用透镜汇聚来自样品的散射光，使用频率特性曲线凹下的滤光片屏蔽瑞利散射光后，用分光器分光可获得样品中目标物质的拉曼散射光谱，从而对目标物质进行定量测量。

在现有技术中，为了避开生物物质、从活体取出的物质或其它的荧光发生物质混合物产生的荧光，采用波长比该荧光波长长的激光作为激发光源来定量测定目标物质(见《激光拉曼分光与临床医学》尾畸幸洋等著：OplusE 1992 4 92-99)。但是，由于拉曼散射强度随激发光波长的四次方成反比地减弱，所以，如果用近红外光作激发光，与用可见光光源激发相比，检测出的光强度明显变弱。

此外，在使用比可见光波长长的激光时，还必须使对应该激光的检测器和分光器适用于长波长。但当前近红外线的平面元件或矩阵元件的价格非常昂贵。在使用近红外波长光测定拉曼散射的方法中，还有利用傅立叶变换的FT拉曼分光方法，FT拉曼分光装置是大型仪器，其缺点是在测定过程中花费的时间长。

在利用上述拉曼散射或光散射方法测定样品时，来自样品的目标散射光谱往往被来自样品的荧光抵消。若样品是生物体本身，在从血液、尿、粪便、唾液、泪液等分离出的物质的情况下，或在食品、水果、农产品等情况下荧光特别强。

通过拉曼散射光谱可以观察比激发光的光量子能量高的光谱边界(以下用反司托克斯线表示)和比激发光的光量子能量低的光谱边界(下面用司托克斯线表示)。司拉克斯线是由于光照射到特定分子上时，保持光量子的分子中的少部分放出所保持的光量子后没有回到原来的振动能级上而返回到与电子的基态不同的振动能级(比基态高的能级)上产生的谱线。反司托克斯线是由于在比原来的基态能量高的能级上的电子释放出入射的光量子的大部分后没有返回到原来的能级上，与照射的光的一部分一起跃迁到基态产生的谱线。也就是说，因为反司托克斯线和司托克斯线的能量的宽度都等于振动激发态的能量与基态能量的差，所以反司托克斯线与司托克斯线的移动波数出现在以激发光为对称的位置上。

只要激发光谱与荧光光谱交叉的范围不宽，荧光光谱存在相对激发光量子能量低的范围即在波长长的范围内，从量子理论上考虑，通过照射的光能，处在基态或其它能级的电子只被照射的光能激励，在从该激发能级跃迁到基态的时间内是通过瞬间限于多能级上发生的，即荧光一般产生在比激发光量子能量低的范围(长波侧)。

因此，如果观测拉曼散射分析中的反司托克斯线，则通过避开荧光影响，通过拉曼分光分析方法可以获得试料样品中目标物质成分的光谱，借助于观察目标物质的光谱变化和强度进行被分析物质的定性和定量分析。

在反司托克斯-拉曼散射的研究中，有将泵光和探测器光射入被测定物质测定反司托克斯-拉曼散射的相干的反司托克斯-拉曼分光(CARS)方法。这种分光法的原理是：将两束不同频率的光射入样品中，当这两束入射光的量子能量差与拉曼散射跃迁的频率一致时，只使拉曼散射的跃迁频率的谱发生强迫振动，利用物质内部的强制振动产生相位同步的非线性振动。因此，在用CARS方法的反司托克斯-拉曼散射光谱中与通常的线性拉曼散射光谱的浓度和目标物质的拉曼散射强度的关系不同，光与物质的非线性相互作用变得明显。另外，多光子吸收跃迁，高次相干的过程引起的散射，感应拉曼散射和周波与高次谐波发生等非线形现象共存，其光谱也不一定能线性地反映目标样品的浓度。因此不能把CARS作为定量分析方法使用。

另外，在分光系统中，需要几个激光光源，因此，增大了装置规模。

反司托克斯-拉曼散射光谱与司托克斯-拉曼散射光谱的强度比由以下的玻尔兹曼分布公式近似表示。

式中：  h：普朗克常数    

        k：玻尔兹曼常数

        T：绝对温度

        V：拉曼移动波数

图1表示根据玻尔兹曼分布、假定绝对温度为300K时显示出的反司托克斯线与司托克斯线强度比的计算值。在样品温度为300K下，强度比在-1000cm^-1(用波数的负号表示反司托克斯-拉曼散射在比激发波长短的短波长侧移动)时为0.008，在-1500cm^-1时为0.007。因此，可以认为用通常的线性拉曼分光方法不可能检测出反司托克斯-拉曼散射光。

本发明的第一目的是通过把检测波长设置在比激发波长短的短波长侧即使不采用昂贵的FT拉曼分光装置和用于长波长的CCD元件作为光检测器也能利用与现有技术中相同的拉曼分光系统检测出反司托克斯-拉曼散射光。

本发明的第二个目的是在将上述方法作为样品的分析方法时，通过避开在激发样品时产生的荧光可以准确地进行定性和定量分析。

本发明将激发光照射样品、利用从样品中产生的散射光中的反司托克斯散射光测定分析样品中的被分析物质的方法。

使本发明的方法适用于定量分析方法时，把样品中的被分析物质的浓度和反司托克斯-拉曼散射强度间的相关性合适的移动波数选择为该被分析物质的固有的测定移动波数，检测出在该测定移动波数的反司托克斯-拉曼散射强度，然后根据检测曲线定量分析样品中的被分析物质。

上述测定的移动波数能使被分析物质的浓度与反司托克斯-拉曼散射强度间的相互关系的相关系数R为0.6以上，最好移动波数为0.8以上。相关系数R的值可根据下式计算出 $>>R>=>>>>\Sigma >>i>=>1>>n>>\{>>(>xi>->X>)>>>(>yi>->Y>)>>\}>\sqrt{>[>>\Sigma >>i>=>1>>n>{{}^{}}^{}}$>

式中x_i：各被分析物质各点的浓度

    y_i：对应x_i的拉曼散射光谱强度

    X：各被分析物质的浓度平均值

    Y：拉曼散射光谱强度的平均值

适于本发明方法的合适的样品的一个例子是尿、血浆等生物物质。被分析物质的一个例子是葡萄糖、酮体和尿素等包含在生物物质中的成分。

本发明的测定装置包括：带有激发光源并将激发光照射在样品上的激发光源单元、激发光照射到样品上的样品单元、激发光照射在样品上并汇聚从样品产生的散射光的聚光光学调整单元、从被汇聚光光学调整单元汇聚的散射光中在已提高反司托克斯-拉曼散射光的接收光密度状态下利用光检测器检测上述散射光的接收光单元。

在具体的优选的例子中，聚光光学调整单元作为聚光系统具有象散的透镜，接收光单元在比激发光波长短的短波长的光成象位置上具有受光口，并检测从该受光口入射的散射光。

为了能使接收光单元的光检测器检测出反司托克斯-拉曼散射强度，接收光单元还可以装有使从受光口入射的散射光分光的衍射光栅等机构例如分光器，或者也可在聚光光学调整单元上装有只使要检测的反司托克斯-拉曼散射光的移动波数的光透过的带通滤光器。

激光光源单元最好装有只使照射在样品上的激发光波长的光透过的带通滤光器。

聚光光学调整单元也可以在具有象散的透镜的光入射侧使样品产生的散射光汇聚，并作为平行光引导到该具有象散的透镜上，也可以装有象散小的透镜。

虽然为了除去激发光波长成分，聚光光学调整单元装有使激发光波包含在频率特性曲线凹下范围内的全息摄影频率特性曲线凹下的滤波器，但最好装有屏蔽激光波长和比其波长长的长波侧的光的截止滤光器。在全息摄影频率特性曲线凹下的滤光器的情况下，最好使上述频率特性曲线凹下的范围与激发光光源单元的带通范围对称的。

接收光单元的受光口也可以是分光器的入口狭缝，或者也可以是单芯光纤的一个端面。采用光纤时可以将光纤的另一端面引导到分光器或光检测器上。

为了能改变达到最高受光密度的波长，最好使聚光光学调整单元的具有象散的透镜与受光口间的距离是可调的。

为了提高反司托克斯-拉曼散射光的产生效率，样品单元最好装备有球状容器和使保持该容器的部分成为反射面的积分球形容器的支座。

另外，为了通过补偿光源光强度的变化提高测定数据的再现性，还可装有取出激发光的一部分作为检测参照光用的光学系统，最好根据该参照光的检测强度校正反司托克斯-拉曼散射光的检测强度。

另外，如果还设置在遍及比激发光波长短的短波长侧的确定范围内使反司托克斯-拉曼散射光的接收光灵敏度保持一定而进行计算的处理单元、该处理单元将表示反司托克斯-拉曼散射的存在概率的玻尔兹曼分布和利用本发明的反司托克斯-拉曼散射光的接收光密度增强因素相乘、然后对其结果进行修正则可以提高定量分析的精度，这也是很可取的。

本发明的测定方法是利用反司托克斯-拉曼线测定生物物质和其它物质的方法，即使检测器的灵敏度仅达到1000nm，由于反司托克斯-拉曼线出现在比激发光短的短波长侧，也可以利用激发光例如使用1064nm的激发光对物质的拉曼散射进行测定。这样还可以扩展检测器的使用范围。

在把本发明的测定方法用于对生物物体容易产生荧光的样品进行测定时，为了避开荧光也没有必要选择激光光源的波长，即使采用比较便宜的具有大的振动能量的激光器也能在避开荧光的同时对物质的拉曼散射进行测定。从即使不考虑避开荧光也可以解决的点和受检测器灵敏度制约变小的这点出发也可以扩展可利用的激发光波长的范围。因为高输出的激光光源的振动波长受到限制，所以激发波长的选择范围变宽这件事在使用高输出激光光源时具有很大好处。另外，由于可以避免荧光，所以可以提高S/N(信噪比)，从而可以测定少量的样品。由于生物物质样品只能少量获得，所以这种方法对测定特定生物物质特别有用。

本发明的特定装置将第一波长的激发光照射到样品上，用具有象散的透镜聚集由样品产生的散射光，在该透镜的光轴上通过在透镜侧的位置上而不是在由激发光波长的光成象位置上接收光，由于提高了比激发光波长短的那个波长的反司托克斯-拉曼散射光的接收光密度，所以可以用现有技术中难以利用的常规的拉曼测定装置测定反司托克斯-拉曼散射光。

图1表示根据波尔兹曼分布在绝对温度为300K时的反司托克斯-拉曼线与司托克斯-拉曼线的强度比计算值的曲线；

图2为概略地表示本发明装置的斜视图；

图3A、B是表示光学调整单元的聚光透镜的功能图，图3A是使聚光透镜的入射光变成平行光的情况，图3B是单一聚光透镜的情况；

图4是表示透镜光学材料的BK7的折射率随波长变化的曲线；

图5A、B、C示出了各接收光位置情况下的各波长位置的光密度比；

图6A、B表示使反司托克斯-拉曼散射光谱的接收光灵敏度保持一定的过程的流程图，图6A表示利用标准物质计算校正反函数存储的过程，图6B表示测定未知样品的过程；

图7是显示在测定中使用的装置的一部分的方框图；

图8是表示在图7的测定装置中使用的容器和容器支座的分解斜视图；

图9A是表示用现有装置系统测定的99％酮体的拉曼散射光谱图；图9B是它的放大图；

图10A是表示用实施例中的装置测定的99％酮体的拉曼散射光谱图；图10B是它的放大图；

图11A是用实施例的装置测定的1M葡萄糖水溶液的拉曼散射光谱图；图11B是它的放大图；

图12表示人尿的散射光谱的波形图；

图13是表示把人尿制备成含2M葡萄糖的样品的散射光谱图；

图14是表示该样品的反司托克斯-拉曼散射光谱的波形图；

图15是葡萄糖浓度改变后的尿样品的反司托克斯-拉曼散射光谱图；

图16是显示-1131cm^-1附近的反司托克斯-拉曼散射强度与葡萄糖浓度间的对应关系图；

图17是表示反司托克斯-拉曼散射强度与葡萄糖浓度(32-1000mg/dl)在-2000～-100cm^-1范围内的相关系数R的图；

图18是表示反司托克斯-拉曼散射强度与葡萄糖浓度(32～514mg/dl)在-2000～-100cm^-1范围内的相关系数R的图；

图19A是用本实施例的装置测定的将人血浆制备成含有1M葡萄糖样品的拉曼散射光谱的图；图19B是它的放大图；

图20是表示在-1130cm^-1附近的反司托克斯-拉曼散射强度与葡萄糖浓度间的对应关系的图；

图21是表示人血浆中的葡萄糖浓度与反司托克斯-拉曼散射强度在-2000～0cm^-1的对应关系图；

图22是在人尿中含酮体的样品的散射光谱图；

图23是表示该样品的反司托克斯-拉曼散射光谱图；

图24是表示在人尿中含尿素的样品的散射光谱图；

图25是表示该样品的反司托克斯-拉曼散射的光谱图；

图26是表示在人尿中含葡萄糖，酮体和尿素的样品的散射光谱图；

图27是表示该样品的反司托克斯-拉曼散射光谱图；

图28是表示人尿中含葡萄糖、酮体和尿素的样品的反司托克斯-拉曼散射光谱中的葡萄糖浓度与光谱强度间的对应关系图；

图29是表示人尿中含有葡萄糖，酮体和尿素的样品的反司托克斯-拉曼散射光谱中的酮体浓度与光谱强度的对应关系的图；

图30是表示在人尿中含有葡萄糖、酮体和尿素的样品的反司托克斯-拉曼散射光谱中的尿素浓度与光谱强度的对应关系图。

图2是表示本发明装置的概略构成图。2代表激发光源，例如是氩离子激光器(514.5nm，100mW)等适合的高输出功率型激光装置。来自激光器2的激发光束4通过用于除去侧边带的带通滤光器6，然后通过准直透镜8照射在样品室10中的样品上。样品为气体或液体时将其装在样品盒中，而在固体样品情况下不需要样品盒。

为了接收调整来自样品的散射光设置了聚光光学调整单元16。作为聚光光学调整单元的一个例子包括摄影透镜12和聚光透镜14。摄影透镜12是通过将激发光激发样品产生的散射光沿90°角方向接收变成平行光的组件，是用象散小的材料制作的复合透镜，通常将该摄影透镜的象散设计成尽可能小。因此，可以用这种一般的摄影透镜。当摄影透镜12在样品中产生的散射光从一点产生时，最好是使450-650nm的所述波长的光为平行光。聚光透镜14是有象散的透镜，例如由作为一般透镜材料的BK7制成。聚光透镜14接收来自摄影透镜12的平行光并汇聚在相应波长的焦点上。

在被聚光透镜14所要求的波长的焦点位置上设置分光器18的入口狭缝19作为受光口，该入口狭缝19的宽度约200μm。入口狭缝19设置的位置是要检测的反司托克斯-拉曼散射光汇聚的位置。

分光器是300G/mm、工作波长500nm的衍射光栅20的单分光器，其分辨率为6.8cm^-1(0.18nm/大格栅)，在分光器18上，22，24，26分别为平面镜。

检测器28是液氮冷却型(EEV元件)的256×1024大格栅的CCD摄影元件(美国EG&G公司制造，200-1100nm波长灵敏度)，对被分光器18分光的多个波长同时进行接收检测。由该分光器18和检测器28构成单色器。

由检测器28检测的信号通过光纤30传送给作为数据处理装置的个人计算机32进行数据处理。

在图2中，为了从散射光中除去激发光成分，在摄影透镜12与聚光透镜14之间配置在频率特性曲线凹下范围内含激发光波长的全息照相频率特性曲线凹下的滤光器34。该全息照相频率特性曲线凹下的滤光器例如可以从KAISER OPTICAL SYSTEMS，INC.(美国)购买。该全息照相频率特性曲线凹下的滤光器34具有例如完全遮住包含在频率特性曲线凹下范围波长的光而使频率特性曲线凹下范围以外波长的光的80％透过的特性。

图3A和图3B是用于说明聚光透镜14功能的图。

图3A适用于图2的光学系统，从样品中产生的散射光经摄影透镜12变成平行光，该平行光40入射到聚光透镜14中，当白色的平行光40照射到具有象散的聚光透镜14上时，按照不同的波长在不同位置上成象。按照本发明，利用由于在聚光透镜14上的波长不同而引起焦点位置的变动，通过在反司托克斯-拉曼散射光汇聚的位置配置微小的受光口，可以提高反司托克斯-拉曼散射光的接收密度。

在光学调整单元中，省去摄影透镜12也可以通过具有象散透镜的聚光透镜14直接接收从样品中产生的散射光。图3B示出了没有摄影透镜12情况下的聚光透镜14的功能图。聚光透镜14配置在离开样品散射光发生点10a两倍焦点距离或更远的位置上，散射光发生点10a的象由于波长的不同而成象在不同的位置上。在这种情况下也与图3A的情况相同，利用在聚光透镜14上的波长的不同使焦点位置变动，通过在汇聚反司托克斯-拉曼散射光的位置上配置小的受光口可以提高反司托克斯-拉曼散射光的接收光密度。

可以使用BK7、人造石英、兰宝石、SF11等光学玻璃作为具有象散的聚光透镜14的材料，作为一个例子，在图4A的表中和图4B的曲线示出了利用一般的光学材料BK7情况下的折射率随波长的变化。在300-700nm范围内折射率变化较大。不限于BK7，对于其它光学玻璃在300-700nm的范围内折射率变化大这一点是共同的。

利用氩离子激光器作为激发光源测定拉曼散射光谱时，-4000～4000cm^-1(负范围表示反司托克斯-拉曼散射光谱)的范围相当于波长420-650nm。即在适合的情况下，反司托克斯-拉曼线的范围是聚光透镜象散影响大的范围，从而可以有效地利用象散。

当利用透镜的象散时，可以使比激发光波长长的范围的光密度降低后射入狭缝，而使比激发光波长短的波长范围的光提高密度后射入狭缝。如果用拉曼散射光谱表示，可以使反司托克斯线的接收光密度提高后射入入口狭缝。

在表1中示出了在聚光透镜焦点距离为10mm(波长为500nm以下)的情况下，随不同入射光波长的象散变化的焦点距离。表中的数值代表焦点的位置(mm)。

表1

光学材料的种类                                            波长(nm) 300    400    450    500    550    600    700BK7合成石英兰宝石SF11 9.507 9.433 9.516 8.879    9.650    9.838    9.878    9.504    9.755    9.942    9.932    9.795    10.000    10.000    10.000    10.000    10.062    10.057    10.048    10.142    10.105    10.100    10.078    10.258    10.166    10.158    10.143    10.424

当根据表1的象散引起的移动的距离长度计算焦点的光密度时，其结果如图5A-图5C所示。图5A是假定波长500nm的光的焦点成直径为200μm的圆形的象、计算在该成象位置上的由其它波长(用拉曼移动波数表示)的光成象的大小(面积)，并把波长为500nm的光的密度作为1时的计算密度比的曲线。图5B和图5C是分别在移动波数为-2000cm^-1，-4000cm^-1的光的焦点位置上进行同样的计算并把各自波长的光密度作为1时的结果。波数0cm^-1为激发光波长，负侧为反司托克斯-拉曼范围，正侧为司托克斯-拉曼和荧光范围。在图5B的例中，移动波数在1000cm^-1以上的波长侧密度比已变为1/2以下。因此，如上所述，通过在比激发光波长短的短波长侧的焦点位置上配置受光口，可以降低荧光强度密度，使反司托克斯-拉曼散射光密度提高后入射。

另外，从图5A-5C可以看出，通过改变聚光透镜14和入口狭缝19等与受光口的距离，可以使密度最高，以便可以任意选择接收光的波长。

在实现数据处理单元的便携式计算机32中，将表示反司托克斯-拉曼散射的存在概率的图1的玻尔兹曼分布和通过调节分光器的受光口的位置而使激发光波长短的短波侧的接收光密度增强的因素(图5B，图5C)相乘，并对计算结果进行修正，以便具有按照遍及比激发光波长短的短波侧的确定范围内的反司托克斯-拉曼散射光的接收光灵敏度一定的方式进行计算的功能。用于实现该功能的过程展示在图6A和图6B中。

图6A表示使反司托克斯-拉曼散射光的接收光灵敏度一定的过程。将分光器的受光口配置在波长比激发光波长短的光对应的焦点位置上，测定标准物质，获得反司托克斯-拉曼散射光谱。为了使该光谱的灵敏度在遍及确定范围内一定，计算修正反函数，然后存储起来，用该修正反函数修正已测定的反司托克斯-拉曼散射光谱，然后输出。

接着，如图6B所示，将分光器的受光口配置在与标准物质测定时相同的位置上，测定未知的样品，获得反司托克斯-拉曼散射光谱。调出校正反函数，对该光谱进行校正计算，从而获得为使接收光灵敏度变为一定而校正过的未知样品的反司托克斯-拉曼散射光谱。

因此，通过进行这样的使接收光灵敏度一定的校正之后，便可以方便地利用光谱强度和光谱的峰面积进行定量分析。

在图2的测定装置中，虽然接收光单元装备有把从受光口入射的散射光分光并导入光检测器的分光器，但是也可以在聚光光学调整单元16上装配只使要检测的反司托克斯-拉曼散射光的移动波数的光透过的带通滤光器，而接收光单元不对从受光口入射的散射光分光就可由光检测器检测出。

图7和图8示出了实际进行测定时所使用的测定装置，其中与图2相同的部件用相同的符号表示。

在图7中，由作为激发光源2的激光装置发出的激发光束4通过棱镜40产生光路偏转，经带通滤光器6和准直透镜8变成细光束照射在样品室10的样品上。样品室10如参照图8所详细说明的那样装备有球形的石英制的流体容器42和保持该流体容器42的积分球形容器支座44。

汇聚通过激发光照射到流体容器42内的样品产生的散射光的聚光光学系统装备有作为物镜的象散小的摄影透镜12、全息照象频率特性曲线凹下的滤光器34和具有象散的聚光透镜14。分光器18和检测器28如图2所详细示出的那样。

聚光透镜14装备有沿其光轴可移动地支撑并通过由个人计算机的位置微调装置46控制驱动的移动器48，以便可以使聚光透镜14或靠近分光器18的入口狭缝方向或远离该入口狭缝方向。

为了测定光源强度并可以校正散射光强度，在该测定装置上设置校正光学系统。该校正光学系统装备有在横切带通滤光器6和单色器8之间的光路沿斜方向配置并取出激发光束的一部分作为参照光40r的透明板玻璃的分束镜50、使被该分束镜50取出的参照光40r的光路偏转的分束镜52、调整光量衰减的衰减滤光器54、横切用于使透过该衰减光滤光器的参照光40r射入分光器18的全息照象频率特性曲线凹下的滤光器34与聚光透镜14之间的光路并沿斜方向配置的分束镜56。参照光40r与来自样品的散射光一起射入分光器18，与散射光一起被分光，并由检测器28检测出。

将散射光的检测强度除以参照光40r的检测强度，可获得光源强度变化校正的散射光输出。

在图7中示出了另外的光源驱动装置60和分光器的扫描控制器62，它们被个人计算机32控制。个人计算机32输入检测器28的检测输出，并对该数据进行处理，完成处理装置的功能。在图7中还示出了输出测定数据等的输出装置64和检测器28的电源装置66等。

在图8中示出了在该测定装置中作样品室使用的盒42和保持该盒42的盒支座44。盒42是球形的石英制成的流体盒，在球形的流体盒本体的两侧设置管状的入口部60a和出口部60b，球形支座44成积分球形由互相结合保持盒42的两部分44a和44b组成，流体盒42装备有保持流体盒42的球状部分的积分球部分60、与积分球部分60相连接并保持盒42的入口部60a和出口部60b的保持部62a、62b、激发光束入射孔64、为了使在盒42内产生的散射光沿着与入射光方向成90度角方向取出而朝外方向扩展的出射孔66。

通过使用这样的积分球形盒支座使从入射孔64入射的激光束在积分球部分60上多重反射而提高激发效率，并且汇聚产生的散射光从一个出射孔66射出，从而增强散射光强度，可以实现高灵敏度的测定。

下面说明测定例子，采用图7和图8中所示的测定装置，将光源的氩离子激光(波长514.5nm，输出100mW)作为激发光照射到样品上进行测定。

在图9A和图9B中示出了利用已有的装置测定的99％的酮体的拉曼散射光谱，光检测器的曝光时间为5秒。图9B是放大图。在反司托克斯线侧还观测到790cm^-1附近的C＝0的伸缩振动。其强度比为约0.024，与根据波尔兹曼分布预言的理论值(0.0237)相当精确地一致。

以图9A，B为代表，在图10A，B，图11A，B的光谱中激发光波长(波长0cm^-1)附近的光谱强度也为0这个事实是由于在这些光谱中没有通过参照光测定激发光强度，而是通过频率特性曲线凹下的滤光器除去激发光成分的结果。

图10A和图10B是利用图7、8的装置测定的例子。光检测器的曝光时间为5秒。但是，或这个实施例或以下的实施例在接收由聚光透镜14聚光的散射光然后引导到分光器的受光口的位置上配置直径约200μm的单芯光纤的端面，该光纤的另一端被导向分光器18。在这些实施例的测定中，使受光口的位置靠近聚光透镜14侧，而不配置在由聚光透镜14使激发光波长的光成象的位置上，为使所需要的反司托克斯-拉曼散射光的密度达到最高，可以调节聚光透镜14的位置。图10B是图10A的局部放大图，790cm^-1附近的C＝0伸缩振动的反司托克斯-拉曼线与司托克斯-拉曼线强度的比与图9的结果相比约为其的12倍。

图11A和图11B是用图7，8的实施例的装置测定1M葡萄糖水溶液的拉曼散射光谱，图11A是显示的全体象，图11B是使-200～2000cm^-1范围放大显示光谱图。利用激发光照射的时间约5秒钟。

显然，根据图11A，B的结果可以测定葡萄糖水溶液的反司托克斯-拉曼散射。

图12是人尿的散射光谱，大部分是荧光。在为了获得图12以下的测定数据的测定中，光检测器的曝光时间为1秒。

图13，14是用图7，图8的实施例装置测定在人尿中配制成含有2M葡萄糖的样品的散射光谱，图13是表示比激发光波长的长波侧的+200～+2500cm^-1范围内的司托克斯-拉曼散射光谱，图14是在上述波长短波侧的-200～-2500cm^-1范围内的反司托克斯-拉曼光谱。

图13的司托克斯-拉曼散射峰几乎处在被荧光掩没的状态下。而在图14的反司托克斯-拉曼散射光谱中可以观察到明显的峰。

图15表示用图7、8的实施例的装置测定葡萄糖浓度变化的原样品的反司托克斯-拉曼散射光谱图。样品是把11种浓度不同的葡萄糖水溶液250μl分别混合在11份250μm的人尿中，尿中的葡萄糖浓度按32-1000mg/dl[葡萄糖卡片值：(株式会社京都第一科学制)]配制。

图16是表示在该光谱图中的-1131cm^-1附近的反司托克斯-拉曼散射强度与葡萄糖浓度的相关关系图。在此情况下的相关系数R＝0.997，显示出相关关系非常合适。可以把图16的相关关系作为检测线定量分析尿中葡萄糖的浓度。

图17是表示在上述测定的尿和葡萄糖水溶液的混合样品的反司托克斯-拉曼散射与葡萄糖浓度在-2000～-100cm^-1内的相关系数R的图。相当系数R在0.9以上的范围遍及在宽范围内，在这些范围内制作检测线，便可以定量分析尿中葡萄糖的浓度。

虽然图18与图17同样是表示相关系数R的反司托克斯-拉曼移动波数的依存性的图，但是数据浓度范围变窄为32-514mg/dl的图。R在0.9以上的范围变窄。

图19A、B中示出了人的血浆和葡萄糖水溶液的混合液的反司托克斯-拉曼散射光谱。图19B是图19A的放大图。

图20是表示该光谱的-1130cm^-1附近的反司托克斯-拉曼散射强度与该葡萄糖浓度的相关关系的图。该测定样品是在12份250ul的人血浆中分别混合12种浓度不同的葡萄糖水溶液250ul，血浆中葡萄糖浓度被调制成41，53，66，70，85，95，126，265，520，756，1036mg/dl[葡萄糖卡片值：(株式会社京都第一科学制)和0.5M。这种情况下的相关系数R＝0.995，显示出相关系数非常合适。可以把图20的相关系数作检测线定量分析血液中的葡萄糖浓度。

图21是表示人血浆中的葡萄糖浓度与反司托克斯-拉曼散射的-2000～0cm^-1的相关系数曲线，相关系数R在0.9以上的范围遍及在宽范围内，在这些范围内绘制检测线可以定量分析血浆中葡萄糖浓度。

图22，23是用图7、8的实施例的装置测定人尿中含酮体的样品的散射光谱，图22是表示比激发光波长长的长波侧的+200～+2500cm^-1的司托斯拉曼散射光谱，图23是表示比激发光波长短的短波侧的-200～-2500cm^-1范围的反司托克斯-拉曼散射光谱。

图22的司托克斯-拉曼散射峰几乎处在掩没在荧光状态之下，而在图23的反司托克斯-拉曼散射光谱上却可以观测到明显的峰。

图24、25是表示利用图7、8的实施例的装置测定的散射光谱测定人尿中含尿素的样品的散射光谱，图24是表示比激发光波长长的长波侧的200～2500cm^-1范围内的司托克斯-拉曼散射光谱，图25是表示在比激光波长短的短波波长侧的-200～-2500cm^-1范围内的反司托克斯-拉曼散射光谱。

图24的司托克斯-拉曼散射峰几乎处在掩没在荧光状态下，而在图25的反司托克斯-拉曼散射光谱中却可观测到明显的峰。

图26，27是利用图7、8的实施例的装置测定人尿同时含有葡萄糖、酮体和尿素的样品的散射光谱，图26是表示比激发光波波长长的长波侧的0-2500cm^-1范围内的司托克斯-拉罗散射光谱，图27是表示比激发光波长短的短波长侧的0～-2500cm^-1范围内的反司托克斯-拉曼散射光谱。0cm^-1代表激发光波长，为了校正光源强度的变化同时检测参照光。

图26的司托克斯-拉曼散射峰几乎处在掩没在荧光的状态下，而在图27的反司托克斯-拉曼光谱中可以观察到明显的峰。

配制同时含葡萄糖、酮体和尿素的10种人尿样品，下面示出了测定的各峰值强度与浓度的相关关系。样品按表2所示那样配制。

[表2]

样品号    葡萄糖浓度   酮体浓度    尿素浓度

           (mg/dl)     (mg/dl)     (mg/dl)

  1          120        6.58        35.6

  2          240        4.70        42.7

  3          520        5.64        28.5

  4          320        2.82        21.4

  5          420        1.88        3.57

  6          630        3.76        7.14

  7          740        0.94        14.2

  8          80         0.50        50.0

  9          160        2.35        25.0

  10         380        1.41        15.7

图28是表示反司托克斯-拉曼散射光谱中的-1130cm^-1附近的峰值强度与葡萄糖浓度的相关关系的图。这时的相关系数为R＝0.92，表现出合适的相关关系。把图28的相关关系绘制成检测线可以定量分析含有多种成分的尿中的葡萄糖。

图29是表示反司托克斯-拉曼散射光谱中的-789cm^-1附近的峰值强度与酮体浓度的相关关系。这时的相关系数R＝0.95，表现出合适的相关关系。把图29的相关关系绘制成检测线可以定量分析含有多种成分尿中的酮体浓度。

图30是表示反司托克斯-拉曼散射光谱中的-1016cm^-1附近的峰值强度与尿素浓度的相关关系图。这时的相关系数为R＝0.93，表现出合适的相关关系。把图30的相关关系绘制成检测线可以定量分析含有多种成分的尿中的尿素浓度。