法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-05-25
专利权有效期届满 IPC(主分类):C12N9/06 授权公告日:20021225 申请日:19960411
专利权的终止
2002-12-25
授权
授权
1998-07-01
实质审查请求的生效
实质审查请求的生效
1997-02-19
公开
公开
本发明涉及一种新的果糖基氨基酸氧化酶。更具体地说，本发明涉及一种来自青霉属的新的果糖基氨基酸氧化酶、一种生产该酶的方法、一种使用该酶的amadori化合物的分析方法和一种含有该酶的试剂或试剂盒。
当反应性物质(如具有氨基的蛋白质，肽和氨基酸)与还原性糖(如具有醛基的醛糖)共存时，它们通过氨基和醛基发生非酶促且不可逆的化合，接着经amadori重排形成amadori化合物。由于amadori化合物的产率是反应物浓度，接触时间，温度和类似条件的函数，因此对样品中amadori化合物的测定提供了有关该样品的有用信息。一般含有amadori化合物的物质的例子包括食品(如酱油)和体液(如血液)。
在活体内，通过葡萄糖与各种氨基酸之间的糖化反应形成果糖基胺。例如，血液中血红蛋白和清蛋白的糖化产物分别称为糖化血红蛋白和糖化清蛋白。术语“果糖胺”涉及在碱性溶液中果糖基胺作为还原剂起作用的能力。由于血液中这些糖化衍生物的浓度反映了在一段特定的时期内的平均血糖水平，因此它可用作诊断和控制糖尿病的明显指标。因此，在血液中测量amadori化合物的方法的建立在临床上是有用的。
而且，可根据食品中amadori化合物的量估计保存的状态和食品生产后的期限。因此，测量amadori化合物的方法对食品质量的控制也有用。
正如上面举例说明的，amadori化合物试验在涉及医药和食品的宽范围的领域中是有用的。
amadori化合物试验的例子包括利用高效液相色谱[Chromatogr.Sci.10：6579(1979)]，用附着有硼酸的固体物质填充的柱[Clin.chem，28：2088-2094(1982)]，电泳[Clin.Chem.26：1598-1602(1980)]或抗原-抗体反应[JJCLA 18：620(1993)，J.Clin.Lab.Inst.Reag.16：33-37(1993)]的方法，测量果糖胺总量的方法[Clin.chim.Acta127：87-95(1982)]，用硫代巴比土酸氧化后的比色测定法[Clin.Chim.Acta 112：197-204(1981)]，或类似方法。然而这些现存的方法需要昂贵的装置并且未必足够精确和快速。
在临床试验和食品分析领域中，利用酶促过程的方法变得越来越普遍，这是因为，由于酶的特性(在底物、反应、结构、活性位点等方面的特异性)，待分析物质可被精确和快速选择性地分析。
已提供的试验包含将氧化还原酶与amadori化合物反应并测定氧的消耗或过氧化氢的产生作为amadori化合物总量的指标(例如，日本专利(KOKOKU)5-33997和6-65300，日本专利公开2-195900，3-155780，4-4874，5-192193，6-46846和7-289253)，而且已建议将糖化蛋白质试验用于诊断糖尿病(日本专利公开2-195899，2-195900，5-192193，6-46846和7-289253)。
由氧化还原酶催化的amadori化合物的分解可用下列反应式代表：
其中R1是醛糖残基，R2是氨基酸，蛋白质或肽残基。
催化上面反应的酶的例子如下：
1.来自棒状杆菌属(日本专利5-33997和6-65300)或曲霉属(日本专利公开3-155780)的果糖基氨基酸氧化酶；
2.来自假丝酵母属的果糖基胺去糖基酶(日本专利公开6-46846)；
3.来自青霉属的果糖基氨基酸去糖基酶(日本专利公开4-4874)；
4.来自棒状杆菌属，镰孢属，支顶孢属或德巴利氏酵母属的酮胺氧化酶(日本专利公开5-192193)；
5.可根据J.Biol.Chem.，Vol.239，PP.3790-3796(1964)所述的方法制备烷基赖氨酸酶。
然而，涉及这些现存的酶的试验有缺陷。
例如，血液中糖尿病诊断的指标有糖基化的清蛋白，糖基化的血红蛋白和果糖胺。当葡萄糖结合到蛋白质分子赖氨酸残基的ε-位时形成糖基化的白蛋白[J.Biol.Chem.，261：13542-13545(1986)]。至于糖基化的血红蛋白，葡萄糖也结合到β-链N端的缬氨酸上[J.Biol.Chem.254：3892-3898(1979)]。因此，需要使用对果糖基缬氨酸及对果糖基赖氨酸具有高度特异性的酶来测定糖基化的蛋白质以作糖尿病的有效指标。然而，来自棒状杆菌属的酶不能作用于果糖基赖氨酸。至于来自曲霉属的酶，它对糖基化蛋白质或其水解产物的作用尚不清楚。尽管在日本专利公开5-192193中描述的酮胺氧化酶与果糖基缬氨酸反应，但它不能用于赖氨酸残基结合到糖上的糖基化蛋白质的精确分析。由于果糖基胺去糖基酶对二果糖基赖氨酸具有高度特异性，因此它不能用于对其中赖氨酸残基在ε-位糖基化或缬氨酸残基糖基化的物质具有特异性的试验。另外，使用烷基赖氨酸酶的方法不可靠或不精确，因为所说的酶缺乏特异性且即使赖氨酸残基结合到非糖部分上时也与物质发生反应。来自青霉属的果糖基氨基酸去糖酶(日本专利公开4-4874)与果糖基赖氨酸和果糖基丙氨酸都发生反应。
如上所述，现存的酶末必给出对糖基化蛋白质的精确分析方法，因此需要开发对果糖基赖氨酸和果糖基缬氨基具有高度特异性的酶。
一般来说，为了提高涉及酶促过程的试验的精确性和有用性，必须使用具有适用于给定试验之目的的催化活性的酶。因此，必须选择考虑到了诸多因素(如待测物质(即底物)样品状态，测量条件和类似因素)的合适的酶，以便精确并可重复地完成试验。为实现该目的，必须预先获得许多酶，并弄清其活性，底物特异性，温度稳定性，pH稳定性和类似特征。因此，必须形成越来越多的果糖基氨基酸氧化酶并弄清其特征。
为了提供对amadori化合物，特别是对糖基化的蛋白质具有特异性的新果糖基氨酸氧化酶，本发明发明人进行了深入的研究并发现可经过在果糖基赖氨酸和/或果糖基Nα-Z-赖氨酸存在的条件下培养青霉属菌株来获得目标酶。
因此，本发明提供了一种新的果糖基氨基酸氧化酶，它经在含有果糖基赖氨酸和/或果糖基Nα-Z-赖氨酸的培养基中培养能产生果糖基氨基酸氧化酶的青霉属菌株来产生。
为实现本发明的目的，含有果糖基赖氨酸的培养基含有果糖基赖氨酸和/或果糖基Nα-Z-赖氨酸，该培养基用于培养能产生本发明的果糖基氨基酸氧化酶的微生物，它经在100到150℃下将葡萄糖与赖氨酸和/或Nα-Z-赖氨酸一起用高压锅蒸煮3到60分钟获得的果糖基赖氨酸和/或果糖基Nα-Z-赖氨酸(下文它可缩写成“FZL”)。正如下文所描述的，本发明的果糖基氨基酸氧化酶意外地对果糖基缬氨酸和赖氨酸都具有特异性，并且具有对前者活性更高的特征。在本说明书全文中，本发明的术语“果糖基氨基酸氧化酶可缩写成”“FAOD”。
可经在含果糖基赖氨酸和/或FZL的培养基中培养能产生FAOD的青霉属菌株来制备本发明的酶。
青霉属菌株的例子包括微紫青霉S-3413(FERMBP-*****)，微紫青霉(IF No.4651，6581，7905)，草酸青霉(IFO No.5748)，爪哇青霉(IFONo.7994)，产黄青霉(IFO No.4897)和暗蓝青霉(IFO No.5337)。
本发明的FAOD一般具有下列理化特征：
1)在氧存在的条件下，催化amadori化合物的氧化，产生α-酮醛，胺衍生物和过氧化氢；
2)大约4.0到11.0的pH范围内稳定，最适pH为7.5；
3)在大约15到50℃的温度范围内稳定，最适温度为25℃；
4)当用Superdex 200pg进行凝胶过滤估测时分子量大约为38,700(38.7KDa)。
用于制备本发明的FAOD的果糖基赖氨酸和/或FZL可经在100到150℃下用高压锅蒸煮0.01到50％(W/W)的葡萄糖与0.01到20％(W/W)赖氨酸和/或Nα-Z-赖氨酸混合溶液3到60分钟获得。具体地说，经过在120℃下用高压锅蒸煮含200g葡萄糖和10gNα-Z-赖氨酸，总体积为1000ml的溶液20分钟来制备。
可通过将以上述方式获得的果糖基赖氨酸和/或FZL加入到任意一种常规培养基中获得含果糖基赖氨酸和/或FZL的培养基(下文称为FZL培养基)，但也可经在100到150℃下用高压锅蒸煮含0.01到50％(W/W)葡萄糖，0.01到20％(W/W)赖氨酸和/或Nα-Z-赖氨酸，0.1％(W/W)K2HPO4，0.1％(W/W)NaH2PO4，0.05％(W/W)MgSO4·7H2O，0.01％(W/W)CaCl2·2H2O和0.2％(W/W)酵母提取物的混合物(优选pH5.6至6.0)3到60分钟的方法常规制备该培养基。
用于生产本发明的FAOD的培养基可以是人工合成的或天然的培养基，它是本领域常用的，含有碳源，氮源，无机物和其它营养成份。碳源的例子包括葡萄糖，木糖，甘油和类似物；氮源的例子包括胨，酪蛋白消化物，酵母提取物，和类似物；无机物的例子包括钠、钾、钙、锰、镁、钴和正常培养基中通常包含的类似物。
当能产生本发明的FAOD的微生物在含果糖基赖氨酸和/或FZL的培养基中培养时，可将本发明的FAOD诱导到最高程度。优选的培养基的例子包括含果糖基赖氨酸和/或FZL的培养基(1.0％葡萄糖，0.5％果糖基赖氨酸，1.0％K2HPO4，0.1％NaH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.01％CaCl2·2H2O和0.01％维生素的混合物)，其中果糖基赖氨酸和/或FZL用作唯-氮源，葡萄糖用作碳源。
特别优选的培养基(pH5.6至6.0)含20g(2％)葡萄糖，10g(1％)果糖基赖氨酸和/或FZL，1.0g(0.1％)K2HPO4，1.0g(0.1％)NlaH2PO4，0.5g(0.05％)MgSO4·7H2O，0.1g(0.01％)CaCl2·2H2O和2.0g(0.2％)酵母提取物，总体积为1,000ml。
可经过将果糖基赖氨酸和/或FZL加入任意常规培养基中或经用高压锅蒸煮含葡萄糖及赖氨酸和/或Nα-Z-赖氨酸的培养基来制备含果糖基赖氨酸和/或FZL的培养基。经两种方法的任-种获得的培养基呈棕色，这是由于存在果糖基赖氨酸和/或FZL，因此称为“FZL棕色培养基或GL(糖基化赖氨酸和/或糖基化Nα-Z-赖氨酸)棕色培养基”。
正常情况下，在温度范围为25到37℃，优选为28℃，培养基pH范围为4.0至8.0，优选为5.5到6.0的条件下进行培养。然而，根据各种因素(如微生物的状态)可变动培养条件，且不限于上面描述的那些条件。例如，在所述条件下培养微紫青霉S-3414菌株20到48小时，优选地为36小时时，在培养基中积累FAOD(见图1)。然后按常规方式处理所得的培养基以去掉核酸，细胞壁片段和类似物并产生酶制品。
由于正常情况下本发明的FAOD酶活性在细菌/真菌细胞中积累，因此，收获培养物中的细胞并磨碎以提取该酶。
细胞的磨碎可以常规方式完成，例如，以机械磨碎法，用溶剂自身消化，冻融，超声处理，挤压或类似方法。
酶的分离和纯化方法也是本领域已知的。可组合已知方法(例如用硫酸铵盐析，用诸如乙醇等的有机溶剂沉淀，离子交换色谱，疏水色谱，凝胶过滤，亲和色谱和类似方法)来进行分离和纯化。
例如，经过将所得的培养物进行离心或抽吸过滤收获菌丝，洗涤，悬浮于0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.5)，用Dino-Mill磨碎并离心。然后使用诸如硫酸铵分离和DEAE-Sephacel离子交换色谱来纯化无细胞提取物的上清液。
为实现本发明的目的，FAOD包括可从全部纯化过程中获得的任何含酶物质和溶液而不论该酶的纯度，包括培养基及具有催化上面定义的amadori化合物氧化的能力物质或溶液。
另外，与FAOD酶促活性有关且保留该活性的任何FAOD片段均落在本发明的范围内，因为这类片段对于达到本发明的目的也是有用的。
由此获得的FAOD在糖尿病的诊断中测定amadori化合物(特别是糖基化的蛋白质)时是有用的。
本发明还提供了生产FAOD的方法，包含在含有糖基赖氨酸和/或果糖基Nα-Z-赖氨酸的培养基中培养能产生FAOD的青霉属菌株，并从所得的培养物中回收FAOD。
微紫青霉S-3413(下文称为S-3413菌株)是产生本发明的FAOD的菌株之一，它是本发明者从土壤中分离的一种新真菌。根据Udagawa Shunichi et al.，“KINRUI-ZUKAN”KOdan-Sha Scientific，1993的教导对该分离的真菌进行了分类。其真菌学特征表示如下：
(1)不形成子囊世代。
(2)形成青霉头。
(3)具有梨形瓶梗，在其顶端突然变窄形成较长的细尖端。
(4)青霉头分枝并不规则伸展。
(5)不形成菌核。
(6)分生孢子连锁显著伸展。
(7)在培养基中的生长状态如下：
在Czapek琼脂培养基中迅速生长。在恒温箱中25℃培养10天时，菌株象羊毛一样伸展，颜色呈淡黄或暗绿。还观察到放射状的深皱折。
S-3413菌株最初作为一种驯化的微生物保藏品(FERMP-14867，保藏日：1994年3月14日)保藏于日本Tsukuba-shi，Ibaraki-ken“国家生物科学和人类技术研究所，工业科学和技术机构”并按布达佩斯条约于1996年3月14日变为国际保藏品(FERM BP-5475)。
本发明的FAOD具有下列特征：
1.正常诱导特征：
本发明的FAOD是由果糖基赖氨酸和/或FZL诱导的可诱导酶，且是经在含果糖基赖氨酸和/或FZL作氮源，葡萄糖作碳源的培养基中培养能产生FAOD的青霉属菌株来生产的。在经高压锅蒸煮葡萄糖与赖氨酸和/或Nα-Z-赖氨酸的混合物获得的Gl棕色培养基中可诱导FAOD，而在含已单独用高压锅蒸煮的葡萄糖和赖氨酸和/或Nα-Z-赖氨酸的培养基中不能诱导FaOD，这表明该酶对amadori化合物具有特异性。
2.反应特异性和底物特异性。
本发明的FAOD在下面反应中具有催化活性：
其中R1是醛糖残基，R2是氨基酸，蛋白质或肽残基。
在上面反应式中，amadori化合物的分子式为R1-CO-CH2-NH-R2，其中R1是-OH，-(CH2)n-或-[CH(OH)]n-CH2OH(n是0到6的整数)，R2是-CHR3-[CONHR3]mCOOH(R3是α氨基酸的侧链残基，m是1到480的整数)，该化合物是优选的底物。在这些化合物中，R3是选自赖氨酸，多聚赖氨酸，缬氨酸，天冬酰胺等的氨基酸的侧链残基，n是5到6，m是55或更小的化合物是更优选的。
本发明的FAOD的底物特异性如下面表1所示。表1纯化的FAOD的底物特异性
底物 浓度 比活性Nα-果糖基Nα-Z-赖氨酸 1.67mM 22.4果糖基缬氨酸 1.67mM 100Nα-甲基-L-赖氨酸 1.67mM M.D*1FHSA*2 0.17％ N.D.胰酶FHSA 0.17％ 0.5糖基血红蛋白 0.17％ M.D.胰酶糖基血红蛋白 0.17％ 0.21)：检测不到2)：果糖基人血清白蛋白
从表1很明显地看到，本发明的FAOD对FZL和果糖基缬氨酸两者都具有高度特异性。
产生FAOD的青霉属菌株的例子和FAOD的底物特异性如下面表2所示。
表2从生长于FZL棕色培养基的青霉属菌株中纯
化的FAOD的底物特异性
比活性(10-2U/mg白质)保藏号 菌株 果糖基 果糖基
Nα-Z-赖氨酸 缬氨酸FERM BP-5475 微紫青霉 S-3413 3.0 17.3IFO4651 微紫青霉 0.3 0.5IFO6581 微紫青霉 N.D.1) 0.2IFO7905 微紫青霉 0.3 0.5IFO5748 草酸青霉 3.0 16.2IFO7994 爪哇青霉 2.8 12.0IFO4897 产黄青霉 1.8 11.3IFO5337 暗蓝青霉 6.1 21.91)：检测不到
从表2中可明显地看到，本发明的FAOD对果糖基缬氨酸比对果糖基赖氨酸具有更大的活性，表明所说的FAOD在对糖基化血红蛋白的分析中有用。
3.pH和温度条件
pH条件的测定：
经过将FAOD加入到0.1M乙酸(AC)，磷酸钾缓冲液(K-P)，Tirs-HCl缓冲液或甘氨酸(Gly)-NaOH缓冲液(pH4.0至11.0)的混合物中，25℃下保温10分钟并在正常条件(25℃，pH8.0)下测量FAOD的活性来测定pH条件。
当根据上面方法进行评价时，本发明的FAOD在大约4.0到11.0的pH范围内是稳定的，优选pH从6.0到9.0。最适pH是大约pH7.5(见图2)。
温度条件的测定
经过将FAOD加入到50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，温度范围从15到60℃的混合物中，在相同条件下将混合物保温10分钟并在正常条件下测定FAOD的活性来测定温度条件。
本发明的FAOD在15到50℃的温度范围内稳定，优选的是15到45℃，更优选的是大约15℃。在15到45℃有效地进行酶反应，优选地在15到40℃，更优选地为大约25℃(见图3)。
4.滴定度的评价
按如下方法进行滴定：
(1)利用比色法测定产生的过氧化氢的方法。
A.产率测量：
经过将预先得到的果糖基缬氨酸(下文称为FV)溶于蒸馏水来制备100mM的FV溶液。向100μl45mM4-氨基安替比林，100μl 60U/ml过氧化物酶，100μl60mM苯酚，1ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)和50μl酶溶液的混合物中加蒸馏水至总体积为2.95ml。混合物在25℃下平衡并向其中加入50μl100mM的FV溶液，然后，在505nm处测量随时间变化的吸光率。根据产生的苯醌色素的的分子吸光率(5.16×103M-1cm-1)计算每分钟产生的过氧化氢总量(μmol)。取所得的值作为酶活性单位(U)。
B.终点法
按与上面方法A所述相同的方式制备溶液并向其中加入底物溶液。30℃下培养30分钟后，在505nm处测吸光度。参照使用标准过氧化氢溶液预先获得的校准曲线，根据产生的过氧化氢总量评价酶活性。
(2)因酶反应吸收的氧的测定方法
向1ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)和50μl酶溶液的混合物中加入蒸馏水以获得总体积为3.0ml的溶液。将所得的溶液在Lank Brothers Co.生产的氧电极池中充电。在25℃下搅拌溶液使在该温度下的溶氧达到平衡，向其中加入10μl 50mM FV。然后在记录器上连续测量氧吸收以获得起始速率。根据校准曲线测定一分钟的吸收氧总量，将它用作酶单位。
5.酶的抑制，活化和稳定：
(1)金属的影响
向酶溶液中加入含溶于0.1M Tris-HCl缓冲液(PH8.0)且终浓度为1mM的待试金属离子之溶液，30℃温育5分钟后，评价酶活性。结果如下表3所示。
表3金属离子对微紫青霉S-3413FAOD活性的影
响
金属(1mM) 比活性(％)
无 100
LiCl 88
KCl 103
NaCl 100
RbCl 105
CsCl 103
MgCl2 103
CaCl2 74
MnCl2 144
FeSO4 114
CoSO4 13
CuCl2 51
ZnSO4 5.8
AgNO3 5.7
BaCl2 66
HgCl2 2.1
FeCl3 100
从表3可明显地看到，本发明的FAOD活性似乎被铜和钡离子抑制且被钴、锌、银和汞离子强烈抑制。
(2)各种抑制剂的影响
以基本上类似于上面(1)所述的方式试验各种物质的抑制效应。在本试验中，对氯汞苯甲酸(PCMB)的终浓度是0.1mM，而其它是1mM。结果如表4所示。经过将纯化的FAOD在含0.1mM二硫苏糖醇(DTT)的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)中透析过夜并测量酶活性来检测稳定作用。
表4各种抑制剂对FAOD活性的影响
试剂(1mM) 比活性(％)
无 100
PCMB*1 0.69
DTNB*2 13
碘乙酸 102
叠氮化钠 118
α，α′-联吡啶 105
O-菲咯啉 111
氨基脲 103
苯肼 0.17
肼 12
羟胺 18
Deprenyl 107
氨基胍 63
EDTA*3 109
*1：PCMB，对氯汞苯甲酸。
*2：DTNB，5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)。
*3：EDTA，乙二胺四乙酸。
从表4中可明显地看到，FAOD的活性受PCMB，DTNB，肼，苯肼和羟胺的强烈抑制，表明SH和/或羰基在酶反应中可以充当重要角色。
经二硫苏糖醇(DTT)可稳定酶，用于保存的优选溶剂是含0.1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)。
6.分子量
当在Superdex 200pg上凝胶过滤测定时，分子量是大约38,700(38.7KD)(见图4)。
根据Davis的方法使用10％凝胶在40mA电泳3小时进行SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)并用考马斯亮蓝G-250染色蛋白质。当在SDS-PAGE上测量时，使用以相同方式进行包含磷酸化酶B，牛血清白蛋白，卵清蛋白，碳酸酐酶和大豆胰蛋白酶抑制剂的标准蛋白质的电泳获得的校准曲线，得到FAOD亚单位的分子量是大约48,700(48.7KDa)，(见图5)，这表明本发明的FAOD是单体。
7.与已知酶的比较
将本发明的FAOD与来自各种微生物的已知果糖基氨基酸氧化酶进行了比较。
表5来自各种微生物的果糖基氨基酸氧化酶的比
较微生物 微紫青霉 棒状杆菌属的种1) 曲霉属的种2)分子量 S-3413(凝胶过滤) 38,700 88,000 83,000(SDS-PAGE) 48,700 44,000 43,000辅酶 共价结合的FAD 非共价结合的FAD 非共价结合的FAD底物特异性(U/mg量白质)(果糖基缬氨酸) 3.03) N.D.4) 11.284)(果糖基赖氨酸) 17.3 7.09 59.8最适pH 7.5 8.3 7.7量适温度(℃) 25 40 40以HS试剂灭活 灭活 未灭活 灭活
1).T.Horiuchi et al.，Agric.Biol.Chem.，53(1)，103-110(1989).
2).T.Horiuchi et al.Agric.Biol.Chem.，55(2)，333-338(1991).
3)对果糖基Nα-Z-赖氦酸的比活性
4).对Nα-D-果糖基Nα-甲酰基赖氢酸的比活性
如表5所显示的在本发明的FAOD和来自两种菌株的其它酶之间可看到下列区别：
(1)分子量：本发明的FAOD是单体，而其它酶是二聚体。
(2)辅酶：本发明的FAOD需要共价结合的FAD，而其它酶需要非共价结合的FAD。
(3)最适pH，最适温度，和受SH试剂的抑制：资料表明本发明的FAOD与其它酶明显不同。
本发明的FAOD与来自青霉属的果糖基氨基酸去糖基酶(日本专利公开4-4874)之间的区别表示如下：
(1)底物特异性：果糖基氨基酸去糖基酶对果糖基赖氨酸和果糖基丙氨酸具有活性，而本发明的FAOD对果糖基赖氨酸和果糖基缬氨酸具有活性，对果糖基缬氨酸的活性更高。
(2)诱导特异性：果糖基氨基酸去糖基酶可在无果糖基氨基酸的培养基中产生，而本发明的FAOD经在含果糖基赖氨酸的培养基中生长青霉属菌株来诱导。
(3)制备过程：经在“棕色培养基”中培养青霉属菌株有效制备本发明的FAOD。
正如上面所讨论的，本发明的FAOD在amadori化合物试验中有用。因此，本发明提供了一种样品中amadori化合物的分析方法，它包含将含有amadori化合物的样品与本发明的FAOD接触并测定消耗的氧总量或产生的过氧化氢总量。根据对糖基化蛋白质和/或糖基化速率的测量或对活体样品中果糖基胺的测定完成本发明的分析。
以下面反应式评价FAOD的酶活性：
其中R1是醛糖残基，R2是氨基酸，蛋白质或肽残基。
至于待试样品溶液，可使用任何含amadori化合物的溶液，例如，来自食品的样品溶液(如酱油等)以及来自活体如血液(例如：全血，血浆和血清)，尿或类似物的样品溶液。
本发明的FAOD在合适的缓冲液中与含amadori化合物的样品反应。尽管根据所使用的酶和待测样品的不同可变动反应混合物的适当pH和温度，但它们应在上面限定的范围内，这就是说：pH从6.0到9.0，优选的是7.5，温度从15到45℃，优选的是15到40℃。至于缓冲液，可使用磷酸钾缓冲液。
试验中所用的FAOD总量一般是0.1单位/ml或更大，在终点法的情况下优选1至100单位/ml。
为实现本发明的目的，可经过下面所示的已知试验方法中的任意一种来完成对amadori化合物的测定。
(1)根据产生的过氧化氢总量进行测定
根据过氧化氢的测定方法(如比色法或利用过氧化氢电极的方法)从产生的过氧化氢总量可估测样品中amadori化合物的总量。然后根据表示过氧化氢总量和amadori化合物总量之间关系的校准曲线估测样品中amadori化合物的总量。具体地说，除了FAOD总量是1单位/ml且待测样品在测量产生的过氧化氢前被稀释外。可用与“4滴定度评价”中所述相似的方法进行估测。
至于过氧化氢的显色系统，可使用任何因生色团(如苯酚)和成色剂(如4-氨基安替比林3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙)之间在过氧化物酶存在的条件下发生的氧化缩合而显色的系统。生色团的例子包括酚衍生物，苯胺衍生物和甲苯胺衍生物，例如：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-m-甲苯胺，N，N-二甲基苯胺，N，N-二乙基苯胺，2，4-二氯酚，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3，5-二甲基苯胺和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3，5-二甲基苯胺。也可用在过氧化物酶存在的条件下经氧化显色的无色型显色剂。这种“无色型显色剂”是本领域中已知的，其例子包括邻联茴香胺，邻联甲苯胺，3，3-二氨基联苯胺，3，3，5，5-四甲基联苯胺，N-羧基甲基氨基羰基)-4，4-二(二甲基氨基)-联苯胺，10-(羧基甲基氨基羰基)-3，7-二(二甲基氨基)吩噻嗪和类似物。
(2)根据消耗的氧总量进行的测定：
可使用表示消耗的氧总量与amadori化合物总量之间关系的校准曲线从消耗的氧总量估测样品中的amadori消耗的氧总量经从反应开始时的氧总量减去反应完成时的氧总量来计算。具体地说，除了FAOD总量是1单位/ml且在测量消耗的氧前适当地预先稀释街加样品外，可用与“4.滴定度评价”中描述的滴定相似的方法进行测定。
根据本发明的分析方法，可直接使用样品溶液，但在某些情况下预先处理样品(以便释放在糖基化的蛋白质中糖结合的赖氨酸和/或缬氨酸残基)。可能是优选的。
为达到该目的，用蛋白酶(酶法)或诸如盐酸等的化学物质(化学方法)处理样品。优选酶法，在这种情况下，在本发明的方法中可使用本领域已知的内切型或外切型蛋白酶。内切型蛋白酶的例子包括胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，蛋白酶K，木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，蛋白酶XIV，赖氨酰内肽酶，proleser和波萝蛋白酶F。外切型蛋白酶的例子包括氨基肽酶和羧基肽酶。酶处理的方法是已知的，例如，可按下面实施例的描述进行胰酶处理。
如上所述，本发明的FAOD对果糖基缬氨酸具有特异性，因此它在糖基化血红蛋白试验中有用。另一方面，本发明的FAOD对糖基化蛋白质中的果糖基赖氨酸具有特异性且在对糖尿病的诊断和治疗中有用，该诊断和治疗包含测量血液样品中的糖基化蛋白质。
当试验血液(例如全血，血浆或血清)时，可使用来自活体的血液样品或预处理(例如透折等)后的血液样品。
而且，在本发明方法中使用的酶(例如：FAOD，过氧化物酶，等等)可以液体状态或固定于合适的固态支持物后使用。例如，可使用固定于颗粒上的酶填充的柱子以获得用于试验糖基化的蛋白质或类似物的装置，该装置在诸如必须精确和快速试验许多样品的临床检查的常规试验中，可提高其效率。固定化酶在经济效益方面也具有优势，因为它可重复使用。
而且经过将酶与显色剂以合适的方式组合可提供一套试剂盒。该试剂盒在针对amadori化合物的临床分析和食品分析中有用。
可用本领域已知的方法进行酶的固定化。例如，可用载体结合法，交联法，包含法，复合法和类似方法进行。载体的例子包括聚合物凝胶，微胶囊，琼脂，藻酸盐，角叉藻聚糖和类似物。可根据本领域已知的方法通过共价键、离子键、物理吸附、生化亲和等将酶结合到载体上。
当使用固定化酶时，可在流动或批量系统中进行试验。如上所述，固定化酶对血液样品中糖基化蛋白质的常规试验(临床检查)特别有用。当临床检查用于糖尿病诊断时，作为糖尿病诊断的标准的结果以糖基化蛋白质的浓度或样品中糖基化蛋白质浓度与总蛋白质浓度比率的糖基化率或果糖基胺的总量来表达。总蛋白质浓度可用常规方式测定，例如，通过在280mm下测吸光率、Bradford法、Lowry法，bullet法，白蛋白自然荧光法或血红蛋白吸附法。
本发明还提供了一种用于amadori化合物分析的试剂或试剂盒，它包含本发明的FAOD和pH最优选的为6.0至9.0，更优选地为7.5的缓冲液。当固定FAOD时，固相支持物可选自聚合物凝胶和类似物，优选的是藻酸。
至于终点分析，试剂通常有1至100单位/mlFAOD(对每一样品)，和作为缓冲液的磷酸钾缓冲液(pH7.5)。
当根据产生的过氧化氢测定amadori化合物时，可使用上面在“(1)根据产生的过氧化氢总量进行测定”所述的任何因氧化缩合显色的显色系统，无色型显色试剂和类似物。
用于本发明的amadori化合物分析的试剂可与合适的显色试剂以及颜色标准或标准物质结合以产生一套试剂盒，该试剂盒在初步诊断或检查中有用。
上面所述的试剂或试剂盒用于测量糖基化蛋白质的总量和/或糖基化率或测定活体样品中的果糖基胺。
如上所述，本发明的FAOD对果糖基赖氨酸和果糖基缬氨酸都具有特异性，因此在开发新的临床分析方法和食品分析方法中有用，从而对糖尿病的诊断和食品的质量控制有用。特别是期望它在糖尿病的诊断中有用，其中糖基化蛋白质的总量和/或糖基化率或血液中果糖基胺的总量作为诊断或控制糖尿病的指标。通过使用本发明的用于测定amadori化合物的试剂的试验方法精确和有效地测定糖基化蛋白质(它有助于糖尿病的诊断或治疗)现在是可能的。
图1是表示培养时间与微紫青霉S-3414培养基中产生的FAOD总量之间的关系的图示。
图2是表示最适pH与溶剂中FAOD活性之间的关系的图示。
图3是表示最适温度与溶剂中FAOD活性之间的关系的图示。
图4是表示了经凝胶过滤在Superdex 200pg上测定的FAOD的分子量的图示。
图5是表示从微紫青霉S-3413纯化的FAOD在SDS-PAGE上的迁移方式的照片。
图6表示从微紫青霉S-3413纯化的FAOD的吸收光谱。
图7是表示糖基化血红蛋白总量与FAOD作用所产生的过氧化氢总量之间关系的图示。
图8是表示糖基化血红蛋白总量与因FAOD作用产生的过氧化氢总量之间关系的图示。
图9是表示血红蛋白Alc水平与因FAOD作用产生的过氧化氢总量之间关系的图示。
下面实施例进一步详细地解释本发明但不构成对其范围的限制。
实施例1微紫青霉S-3413的发酵和FAOD的纯化
1)发酵
将微紫青霉S-3413(FERM BP-*****)接种到含0.5％FZL、1.0％葡萄糖、0.1％K2HPO4、0.1％NaH2PO4、0.05％MgSO4、0.01％CaCl2和0.2％酵母提取物的培养基(pH6.0，10L)中，用发酵罐在通气(2L/分)和搅拌(500rpm)条件下28℃培养36小时。过滤培养物以收获菌丝体。
2)粗提物的制备
将菌丝体部分(湿重410g)悬浮于含0.1mM DTT的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5，800ml)中用Dino-Mill磨碎。磨碎的混合物在9,500rpm下离心20分钟以获得作为粗提物的上清液(无细胞提取物)，然后对其进行纯化。
3)纯化
向粗提物中加入硫酸铵至40％饱和状态，将混合物在12,000rpm下离心10分钟。向上清液中加入硫酸铵至75％饱和，搅拌并在12,000rpm下离心10分钟。
将沉淀溶于含0.1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)(下文称为“缓冲液A”)中，溶液在缓冲液A中透析过液，其中更换透析溶剂2次。所得的酶溶液上样到用缓冲液A平衡的DEAE-Sephacel柱(4.2×26cm)上。观察用缓冲液A洗柱的馏分的活性，收集馏分并用以0至55％饱和范围的硫酸铵分离。所得物质吸附到用含25％硫酸铵的缓冲液A平衡的苯基-Sepharose6FF(低置换)柱(HR10/10)上。用相同缓冲液洗涤后，用25％到0％饱和的硫酸铵线性梯度洗脱柱子。合并活性馏分，用硫酸铵浓缩，在用含0.1M DTT的0.2M磷酸钾缓冲液(pH7.5)平衡的Superdex 200pg柱上进行凝胶过滤以产生70到100单位的纯化酶制品。
用Superdex 200pg进行凝胶过滤显示：根据图4所示的校准曲线得到分子量大约为38，7000(38.7KDa)。
使用纯化的酶，根据Davis的方法，用10％凝胶在40mA下经SDS-PAGE3小时并用考马斯亮蓝G-250染色蛋白质来测定分子量。用以相同方式进行的包括磷酸化酶B，牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白，碳酸酐酶和大豆胰蛋白酶抑制剂的标准蛋白质的电泳制备的校准曲线估测分子量。SDS-PAGE揭示了纯化的酶亚基分子量是大约48,700(48.7KDa)(见图5)。
纯化酶的紫外吸收光谱在图6中显示它表明该酶是一种黄素酶。
而且实施例1中制备的FAOD显示出与上面所述的酶活性、pH和湿度稳定性、金属和抑制剂影响等相联系的相同值或物理化学特征。
实施例2糖基化血红蛋白的测定：
1)样品的制备
按下面方法制备作为FAOD底物的样品溶液。向溶于100μl蒸馏水的0至15mg糖基化血红蛋白对照E(Sigma)的溶液中加入1ml盐酸丙酮溶液(1NHCl/丙酮为1∶100)。将混合物在12000rpm下离心10分钟，用500μl乙醚洗涤沉淀并在真空条件下浓缩至干燥。向残余物中加入100μl8M的尿素。在沸水中加热所得的混合物20分钟，冷却，与300μl 5.4U/ml胰酶混合，在37℃保温3小时，在沸水中加热5分钟获得样品溶液。
2)活性的测定
3mMN-(羧基甲基氨基羰基)-4，4-双(二甲基氨基)二苯基胺溶液 30μl
过氧化物酶溶液(60单位/m；) 30μl
0.1M tris-HCl缓冲液(pH8.0) 300μl
FAOD溶液(25单位/ml) 5μl
经过用0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)稀释实施例1中获得的纯化的FAOD制备FAOD溶液(25单位/ml)。混合上面所列的全部试剂后，用蒸馏水将总体积调到1ml以产生FAOD反应混合物。向FAOD反应混合物中加入上面1)中获得的作为底物的样品溶液(150μl)。混合物在30℃保温30分钟后，在727nm下测吸光度以评价糖基化血红蛋白与吸光度之间的关系。
3)结果
结果在图7中显示，其中纵座标表示与产生的过氧化氢总量相对应的727nm处的吸光度，横坐标表示糖基化血红蛋白总量。图7表明糖基化血红蛋白总量与过氧化氢总量相关。
实施例3糖基化血红蛋白的测定
1)样品的制备
按下面方法制备作为FAOD底物的样品溶液。向溶于200μl蒸馏水的30mg糖基化血红蛋白对照E(Sigma)的溶液中加入1ml含8M尿素、0.2％EDTA二钠和40μl2-巯基乙醇的570mM Tris-HCl缓冲液(pH8.8)，在氮气中将混合物静置2小时。加入400μl1M的碘乙酸钠后，混合物静置30分钟，接着再加入40μl的乙-巯基乙醇。混合物在0.1M碳酸氢铵中透析，与10μl10mg/ml的TPCK-胰酶混合，37℃下培养3小时，在沸水中加热5分钟以获得样品溶液。
2)活性测定
3mM N-(羧基甲基氨基羰基)-4，4-二(二甲基氨基)二苯基胺溶液 30μl
过氧化物酶溶液(60单位/ml) 30μl
0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0) 300μl
FAOD溶液(25单位/ml) 10μl
样品 0到13.2mg
经过用0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)稀释实施例1中获得的纯化的FAOD制备FAOD溶液(25单位/ml)。将上述全部试剂混合后，用蒸馏水将总体积调到900μl以获得FAOD反应混合物。将FAOD反应混合物在30℃下保温，30分钟后在727mM下测吸光率以评价糖基化血红蛋白与吸光率之间的关系。
3)结果：
结果如图8所示，其中纵座标表示与产生的过氧化氢总量相对应的727nm处的吸光度，横坐标表示糖基化的血红蛋白总量。图8表明糖基化血红蛋白总量与过氧化氢总量相关。
实施例4血红蛋白Alc水平的测量
1)样品的制备
按如下方法制备作为底物的样品溶液。将血红蛋白AO试剂(sigma Co.)溶于蒸馏水以产生2.3mM的溶液，使用自动糖基化血红蛋白测量装置(Kyoto DaiichiKagaku Co.Ltd.)分离该溶液。收集含纯化的血红蛋白Alc和血红蛋白AO的各馏分。经过以不同比率混合这些馏分来制备具有0％至52.0％范围的不同血红蛋白Alc水平的作为底物的样品溶液。
2)样品的预处理：
250μg上面1)获得的样品溶液，5μl500U/ml的氨基肽酶和15μl1.0M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)加蒸馏水至200μl的混合物在30℃保温30分钟。加入200μl10％的三氯乙酸后，搅拌混合物，0℃静置20分钟，在12000rpm下离心10分钟。用大约40μl 5N NaOH中和所得的上清液。
3)活性测定：
3mM N-(羧基甲基氨基羰基)-4，4-二(二甲基氨基)二苯基胺溶液 100μl
过氧化物酶溶液(60单位/ml) 100μl
0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0) 1000μl
FAOD溶液(25单位/ml) 15μl
样品 0到13.2mg
经过用0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)稀释实施例1中获得的纯化的FAOD来制备FAOD溶液(16单位/ml)。混合上述全部试剂后，用蒸馏水将总体积调到2.6ml以获得FAOD反应混合物。将FAOD反应混合物在30℃保温2分钟。加入400μl上面2)中获得的预先处理的底物后，将混合物再保温30分钟并用于727nm处测吸光度以评价底物血红蛋白Alc水平和吸光率之间的关系。
4)结果
结果如图9所示，其中纵坐标表示与产生的过氧化氢总量相对应的727nm处的吸光率，横坐标表示血红蛋白Alc水平。图9表明血红蛋白Alc水平与过氧化氢总量相关。
机译： 果糖基氨基酸氧化酶及其生产方法
机译： 果糖基氨基酸氧化酶及其生产方法
机译： 果糖基氨基酸氧化酶，其生产方法以及使用该酶测定阿马多里化合物的方法
