避免血红素影响的方法

摘要

用于避免血红素影响的方法，其中影响是当用速率分析测试样品颜色反应的光谱吸收时在血红素的吸收波长由随时间的变化引起的，在本方法中包括在517-529nm或580-592nm波长测光谱吸收。

说明书

本发明涉及当用速率分析测颜色反应的光谱吸收时避免血红素影响(干扰)的方法。

在临床试验中进行的生化分析和生化测量中，有两种方法，一种是使用液体试剂的方法，另一种是使用干试剂(称为＂干分析元件＂)的方法。在两种方法中，反应体系的显色通过使用光反射观察以探测或确定。尤其速率分析(测量在两点或多点变化量的方法，从所得反应速率计算出浓度)是一种常用的用于使用干分析元件的光谱吸收测量的分析方法。

在这种方法中，从全血中分离并除去血红素，所得的血浆或血清作为样品用于试验。然而，当从在分离步骤前或期间发生了红血球溶血作用的全血制备样品时，血浆或血清样品有时被血红素污染。其后果是该分析所得的数据变得与实际数值差别很大，因为所需组分的数值与血红素重叠(也称为＂模糊＂)并且血红素的吸收随时间变化。

因此，需要避免血红素的吸收中随时间变化的影响。已经提出了一些用于该目的的方法，诸如测量空白样的方法、使血红素物理地或化学地变性以防止随时间变化的方法(例如JP-B-3-58467，此处所用＂JP-B-＂一词是＂已审查的日本专利公报＂之意)、在血红素吸收较少的650nm或更大的波长测量光谱吸收的方法(例如JP-A-62-209360，此处所用＂JP-A-＂一词是＂未审查的公开的日本专利申请＂之意)。

在这些方法中，测量空白样的方法需要额外的劳动，因为要测空白样和试样的光谱吸收。尤其当使用干分析元件时，空白样的测量很困难，因为所用的所有试剂结合成一体。

同样地，血红素变性的方法要求复杂的处理并可以使需要的组分变性而被分析(例如酶)，这样该方法对于具有处理简便的优点的干分析元件不适用。

在血红素吸收较少的650nm或更大的波长测量光谱吸收的方法在使用液体试剂时是有效的。即尽管血红素的吸收在波长650nm或更大可少量测到，当过分稀释的样品诸如液体体系在血红素吸收少的波长(例如680nm)测定时血红素的模糊不成问题。

然而，当样品在没有稀释的分析中诸如干分析元件的情况下使用时，甚至在600nm或更大的波长血红素的少量吸收对于测量值产生严重的成问题的影响。

因此，本发明的一个目的是提供一种新的用来避免血红素的影响的方法，其在血红素的吸收波长不随时间的变化而偏向并且不产生前述问题。

本发明的这个目的及其它目的已通过用于避免血红素影响的方法实现，在此方法中，其影响是当用速率分析测样品颜色反应的光谱吸收时，在血红素的吸收波长由随时间的变化引起的，其中方法包括在517-529nm或580-592nm波长测光谱吸收。

图1表示血红素的吸收波长。

图2表示血红素在吸收波长随时间的变化。

在本发明中，光谱吸收优选在520-526nm或583-589nm波长进行测量。

此外，在本发明中，被测样品优选是干分析元件。但是，如果样品是液体，也能获得足够的效果。既然在光谱吸收中污染的血红素随时间的变化可以避免，本发明的方法优选应用速率分析。速率分析是测定在两点或多点(反应速率)变化的量的方法。这个方法经常使用干分析元件。

同样，在本发明中，被测样品优选含有可见的着色剂。可见的着色剂可以是氧化着色剂或还原着色剂。

本发明中使用的氧化着色剂的例子包括3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMBZ)、N-(3-磺丙基)-3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMBZ·PS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、钠盐、二水合物(ADOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、钠盐、一水合物(ADPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、钠盐、一水合物(ALOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、钠盐(ALPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、钠盐(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、钠盐、一水合物(DAPS)、N-(3-磺丙基)苯胺、钠盐、一水合物(HALPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、钠盐(HDAOS)、N-  (3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、钠盐、一水合物(HDAPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺、钠盐、一水合物(MAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺、钠盐、一水合物(MAPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺、钠盐、二水合物(TOOS)和N-磺丙基苯胺(HALPS)。

本发明中使用的还原着色剂的例子包括四唑盐类，诸如2-(4-磺苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑盐酸盐(INT)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴酸盐(MTT)、3，3′-(1，1′-二苯基-4，4′二基)-双(2，5-二苯基-2H-四唑盐酸盐)(Neo-TB(Neo-四唑蓝))、3，3′-(3，3′-二甲氧基-(1，1′-二苯基)-4，4′二基)-双(2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑盐酸盐)(Nitro-TB)(硝基四唑蓝))、3，3′-(3，3′-二甲氧基-(1，1′-二苯基)-4，4′二基)-双(2，5-二苯基-2H-四唑盐酸盐)(TB-(四唑蓝))、2-(4-磺苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑一钠盐(WST-1)和2-(4-磺苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑一钠盐(WST-3)。

进一步，本发明的方法优选用于酶活性的测量。

用本发明的方法测量酶活性的酶的例子包括谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)、乳酸脱氢酶(LDH)、脂肪酶、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、γ-谷氨酰转氨酶(γGTP)、磷酸肌酸转移酶(CPK)和丙酮酸激酶(PK)。    

图1表示血红素的吸收波长(吸光度(OD)为纵坐标，波长(NM)为横坐标)。既然如图1所示血红素的吸收在600nm或更大的波长处很小，通常认为当在该波长测量时测量值无影响。但是，如前文所述，血红素的吸收随时间变化并导致在干分析系统条件下不可忽略的误差。

随时间变化的例子在图2中表示。图2表示在PH11测的血红素的吸收的变化(吸光度(OD)为纵坐标，波长(nm)为横坐标)。在一条线和其相邻线之间的空间表示1分钟的间隔。如图2所示，曲线随时间的推移变得平缓(接近水平)。随时间的推移色度增加的反应试剂导致在520-590nm波长所测值的负误差或在其它可见波长的正误差。另一方面，随时间的推移色度降低的反应试剂导致在520-590nm波长所测值的正误差或在其它可见波长的负误差。即使在温和条件下，也或多或少地发生这些变化并导致测量值正或负误差。在干分析元件情况下这种影响非常明显。本发明的重点是在不发生这些随时间变化的波长处进行测量。

不发生血红素吸收周期性变化的波长优选在520-526nm或583-589nm范围内。但是，范围可以根据测量条件，诸如温度多少有些变化。本发明的测量在20℃-45℃、优选在25℃-37℃进行。

本发明现用下述实施例的方式进行更详细的说明，但应认为本发明不能被其限定。    实施例1

用于GPT(谷氨酸丙酮酸转氨酶)测量的干分析元件(配方)L-丙氨酸                                            0.9gα-戊酮二酸                                         0.1g丙酮酸氧化酶                                        20k单位磷酸                                                0.05g过氧化物酶                                          10k单位4-氨基安替比林                                      0.05gN-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠盐    0.05g藻酸钠                                              2.0g蒸馏水                                              8.0g磷酸二氢钾                                          0.04g磷酸氢二钠                                          0.24g

上述组分混合以制备试剂涂敷溶液，将试剂涂敷溶液涂在不透明的聚对苯二甲酸乙二酯薄片上，湿的厚度是200μm，在40℃干燥30分钟，得到试剂层。显色层的制备：(配方)Triton X-100                                         0.10g蒸馏水                                               9.90g

一片厚度为0.25mm(Savina Minimax，Kanebo，LTD.商品名)的聚酯衣浸入上述组分混合物中得到显色层。加工成分析元件：

上述获得的湿显色层压在前面制备的试剂层上，在40℃干燥30分钟。如此得到的分层薄片被切成5mm×7mm尺寸，用压敏粘合剂双层涂敷小条后嵌入5mm×80mm尺寸的白色聚对苯二甲酸乙二酯薄片尖端，得到分析元件。测量：

从健康人采集的全血样品分为两部分：一部分进行人为溶血作用；另一部分不处理。从中制备的每份血清样品与30单位/1的GPT混合，将6μl所得混合物的部分供给分析元件并在37℃保温。此后，在保温开始之后的3-4分钟期间内在575、585和610nm监测每个反射来测定血红素对测量值的影响。用反射吸收测量仪(SPOTCHEM，Kyoto Daiichi Kagaku CO.，Ltd.商品名)测量和确定血红素的浓度，发现溶血作用后的样品含有300mg/dl的血红素。

反射根据Kubelka-Munk公式被转化为K/S值以计算其不同(ΔK/S值)。结果见表1。

                          表1

波长          血红素浓度         误差

        0mg/dl        300mg/dl  575nm    Δ0.025        Δ0.021          -14％  585nm    Δ0.027        Δ0.027          ±0％  610nm    Δ0.025        Δ0.026          +4％实施例2

用于GPT测量的使用其它成色试剂的干分析元件(配方)L-丙氨酸                                            0.9gα-戊酮二酸                                         0.1g丙酮酸氧化酶                                        20k单位磷酸                                                0.05g过氧化物酶                                          10k单位4-氨基安替比林                                      0.05gN-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠盐    0.05g藻酸钠                                              2.0g蒸馏水                                              8.0g磷酸二氢钾                                          0.04g磷酸氢二钠                                          0.24g

上述组分混合以制备试剂涂敷溶液，将试剂涂敷溶液涂在不透明的聚对苯二甲酸乙二酯薄片上，湿的厚度是200μm，在40℃干燥30分钟，得到试剂层。

制备显色层、加工成分析元件和测量用与实施例1中所述方法进行。  结果见表2。

                         表2  波长             血红素浓度             误差

          0mg/dl         300mg/dl  500nm      Δ0.015         Δ0.018       ＋20％  525nm      Δ0.016         Δ0.016       ±0％  610nm      Δ0.017         Δ0.014       －17％

表1和2中的结果表明通过设定测量波长为525或585nm可降低测量误差至0％。

这样，如前文所述，本发明的方法不要求空白试验，故不需要额外的工作；不使血红素变性，故分析可以简便地进行而不导致所需成分变性。另外，发明的方法比在650nm或更大波长测吸光度的在先技术方法准确而且不破坏干分析元件的简便和易操作。

在已详细并参照其特例描述本发明的同时，本领域技术人员应清楚在不离开其精神和范围条件下可以进行不同的变化和修改。