公开/公告号CN1078262A
专利类型发明专利
公开/公告日1993-11-10
原文格式PDF
申请/专利权人 中国预防医学科学院病毒研究所;
申请/专利号CN93102498.6
申请日1993-03-11
分类号C12N15/63;C12N15/51;C12N15/85;
代理机构三高专利事务所;
代理人李富英
地址 500052 北京市宣武区迎新街100号
入库时间 2023-12-17 12:23:13
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2004-05-19
专利权的终止未缴年费专利权终止
专利权的终止未缴年费专利权终止
2000-11-15
授权
授权
1993-11-10
公开
公开
1993-10-20
实质审查请求的生效
实质审查请求的生效
本发明涉及一种含有编码乙肝病毒表面抗原中蛋白(Pre-S2+S)的DNA的表达质粒,用所说表达质粒转化的哺乳动物细胞系以及培养所说的转化体高效表达乙肝表面抗原中蛋白。
乙型肝炎病毒(HBV)是引起遍及世界的慢性肝病和肝癌的常见病因,我国是乙型肝炎高发区,有50-70%的人群感染过HBV,8-10%的人群(约1亿人)为带毒者,目前还没有治疗乙肝的有效方法,接种乙肝疫苗是预防肝炎的有效措施。
血源疫苗国内外已投入生产使用,但不能满足普遍的预防接种,由于血源疫苗存在着一些问题,如血源有限,带有肯定的潜在性危险(如丙肝,艾滋病毒等,)为此需要急切研制乙肝基因工程疫苗,国内外对乙肝基因工程疫苗的研究得到较快的发展,美国的MSD公司应用酵母系统生产乙肝基因工程疫苗已获准生产许可证,我国用哺乳动物细胞生产的乙肝基因工程疫苗也获准生产,它们和血源疫苗一样,是由乙肝表面抗原的主蛋白组成。
近来的研究表明,HBV的Pre-S2(前S2)区域中蛋白特异性决定簇比S区更为丰富,中蛋白免疫能激刺T细胞的功能,Pre-S2抗体出现早于S抗体,并具有保护野毒攻击的作用,这进一步表明中蛋白在免疫中有着重要作用。
1984年M.L.Michel报导[1],用ay亚型的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)大蛋白构建重组质粒(PSVSdhfr9.1kb)。
其特点是:乙肝表面抗原大蛋白受SV40早期启动子的调控,而dhfr(二氢叶酸还原酶)基因受MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)启动子的调控。
表达系统,他们采用二氢叶酸还原酶阴性的中国地鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-),作为其表达系统经SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳显出22>
用AUSRIA 11试剂盒测细胞培液中蛋白表达量=1ug/106细胞/每天。
T.Lee等人[2]用HBV(adr亚型)2.8kb的Bg1 Ⅱ片段插到PSV2-dhfr载体质粒的Bg1 Ⅱ-BamH1位点构建质粒,其中HBsAg基因的转录方向与SV40早期启动子方向相反,用构建的重组质转化CHO细胞,其表达产物HBsAg表达量一平均为1μg/107Cell/每天。
蛋白印迹实验:用pre-S1及PreS2单克隆抗体时分别测出40kD的Pre-s1及33kd,36kd的PreS2带。
1989yasuaki Itoh and yukio Fujisaua等人[3]
质粒构建:用adr型乙肝表面抗原中蛋白(此中蛋白是经修饰即去掉第Ser44-Thr496个氨基酸,同时在氨基端增加了人工合成的三个氨基酸残基)构建成10.8kb的pGLDP31-RC重组质粒。
该质粒是由GLD启动子(甘油醛-3-磷酸-脱氢酶启动子)下游连接乙肝表面抗原修饰后的中蛋白,PBR322片段(含氨苄抗性基因及复制起点),酵母菌的arsl(自主复制系列)、LEU2(亮氨酸基因)及LR(反向重复序列)所构成。
表达系统:酵母
表达产物的检测:
1)经SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳显示出34kd,37kd的中蛋白条带。
2)镜下观察到20nm颗粒。
1986年P.Dehoux et al等报导[4]
质粒构建:将ayw亚型HBV大蛋白1312bp的Bgl Ⅱ-Bgl Ⅱ片段插到含有PH05启动子的酵母载体质粒PPV2的Hind Ⅲ位点,其下游有URA3基因(转录终止信号)构成PPV2/S55重组质粒。
该质粒的特点是:乙肝表面抗原大蛋白基因在PH05(强的酵母启动子)调控下。
表达系统:酵母。
表达的蛋白产物,免疫沉淀后,经聚丙烯酰氨凝胶电泳电显出39kD的带条。蛋白分泌量为25ug/L(0.1-0.2ug/ml总蛋白)。
T.Yoneyama et al等报导[5]
1.质粒构建:用HBV(adr亚型)表面抗原2.8kb Bg1 Ⅱ片段(含Pre-S1,S2+S基因)插到PdBpv-MMT neo的BamHⅠ的位点。
该质粒含有:BPV DNA(牛乳头瘤病毒)载体,PML2 DNA.SV40剪接位点及多聚腺苷位点,小鼠摄金蛋白启动子和新霉素磷酸转移酶基因(neo)。
2.表达系统:小鼠C127细胞
3.表达产物检测:
1)电镜下观察到22-27nm颗粒。
2)SDS-PAGE电泳:显示22Kd 26kd和35Kd的蛋白带,无大蛋白带。
3)细胞的免疫荧光:用HBsAg的免血清及Pre-S2单克隆抗体分别测出HBsAg及Pre-S2抗原,用Pre-S1单抗未测出Pre-S1抗原。
L.Kutinova等人报导[6]的质粒构建:包括用完整的前S2+S基因,插到含有痘苗TK的PGS20载体质粒P1.4HEP,该质粒特点是HBsAg抗原PreS2+S基因在痘苗病毒7.5K启动子调控下。
蛋白分泌量的检测:
HBsAg Elisa滴度为HBsAg 24-34;Pre-S2 161。
M.W.Yu et al[7]报导用表面抗原Pre-S2+S基因插到大肠杆菌表达载体pTrpLE质粒,构成PLEPre-S2质粒。
表达产物是融合蛋白蛋白。
上述所介绍的含乙肝病毒表面抗原前S基因的重组DNA质粒的构建及其表达产物的生物学活性的研究中,或因表达载体的构建不佳或因表达系统的选择不利,因而都不能高效生产出免疫原性好的抗原,其中表达系统选择的局限表现为:用大肠杆菌为表达系统其得到表达往往是融合蛋白,由于表达水平低,产物不稳定,而未获成功;以痘苗为载体表达乙肝表面抗原,最初是用此载体研制亚单位疫苗,虽然有成功的报导,但由于不适于大规模的生产,给广泛使用前景带来困难,现进一步用此载体来研制含乙肝表面抗原的重组病毒活疫苗;酵母是一个较好的表达系,但有其不足之处。
1)酵母表达的乙肝表面抗原不能分泌,给分离纯化带带来许多困难。
2)HBsAg中蛋白在酵母系统中过度糖基化而且稳定性差,影响其免疫原性;用哺乳动物细胞C127,小鼠LTK-及小鼠3T3细胞用为表达系统,虽有获得乙肝表面抗原的表达的报导,但上述细胞不是世界卫生组织认可的用于基因工程疫苗生产的哺乳动物细胞。
要想获得更好的基因工程苗需从二方面考虑,一是高效表达质粒的构建,二是表达系统的选择,为此我们构建了含乙肝表面抗原Pre-S2+S中蛋白质粒pSV2DHBWS2S,本质粒的结构明显地不同于现有报导的Pre-S的质粒,并选用哺乳动物细胞作为表达系统,目的是为进一步研制免疫性好,表达量高的乙肝基因工程疫苗奠定基础。
在本发明的实施方案中,我们采用的是乙肝表面抗原完整的中蛋白结构(2.0kb的Saul-Bg1 Ⅱ片段),乙肝表面抗原中蛋白是具有丰富的抗原决定簇,免疫原性好,能与人多聚白蛋白结合,又能分泌的区域,采用的HBV亚型,这是我国南方流行的重要亚型,南方又是乙型肝炎的高发区,所采用的启动子也与上述文献报道不同,即我们采用二个SV40早期启动子,SV40早期启动子是较强的启动子,SV40的DAN复制起点和早期启动子区域中含有72个核苷酸的重复序列能强化邻近的基因的表达[8、9]。
质粒结构中的dhfr基因在前,乙肝表面抗原基因在后,而且我们构建的与Michel等所构成的质粒正好相反。
其优点是:dhfr基因是一个扩增基因,由于它的扩增而带动下游的HBsAg基因扩增,从而增强基因HBsAg的表达。
此外用哺乳动物细胞即缺失二氢叶酸还原酶基因的中国地鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-),为表达系统是较理想的细胞系,哺乳动物胞表达的外源基因产物较原核及酵母系统更接近于天然,哺乳动物细胞系具有更适于大规模连续培养的优势。
图1说明本发明的重组质粒pSV2DHBWS2S的构建方法。
下面将对本发明进行详细说明。
(一).含乙肝表面抗原中蛋白重组质粒
质粒构建:
PSVDHBW-1质粒(adw亚型)经Hind Ⅲ及Saul酶切后回收大片段,Klenow酶补平,T4DNA酶连接构成中间质粒PSVHBWS2S再用Bg1 Ⅱ及PVU Ⅱ酶切后制取小片段,载体质粒PSV2dhfr(美国梁伟材教授赠)的Bg1 Ⅱ位点处构成PSV2DHBWS2S,该重组质粒的特点是HBV PreS2+S基因及二氢叶酸还原酶(dhfr)酶基因分别置于二个SV40早期启动子调控下,图1。
(二).转基因细胞系MX(X:1-15):
MX细胞系的筛选:将重组质粒DNA 15ug和等量的鲑鱼精子DNA按常规沉淀技术[10,11]加到约80%成片的CHO-dhfr-细胞(该细胞是美国哥伦比亚大学Chasin教授惠赠)瓶中,8小时后第一次换生长液(含次黄嘌呤和胸苷),2天后消化稀释(此时生长液不再加次黄嘌呤和胸苷),于CO2孵箱中培养约2周,待单个细胞集落出现时,挑单细胞集落于96孔板,增殖后依次逐渐转到24孔板及方瓶,逐渐加MTX(氨甲喋呤)其浓度由1X10-7到5X10-6M以此筛出高效分泌HBsAg阳性的克隆细胞系。
(三).表达产物检测:
1.HBsAg的表达量:反相血凝滴度为64-128;放射免疫(RIA)为2248-2558ng/ml。
Pre-S2表达量:反相血凝为:128-192
酶联免疫试验:(Elisa)为160-320。
2.初纯品经SDS-PAGE电泳,显出24KD,27KD的主蛋白带及33KD,36KD中蛋白带,经蛋白印迹试验证明,中蛋白是特异性条带。
3.免疫电镜观察到:22nm大小的颗粒。
4.动物实验:免疫小鼠及家兔后Elisa可测出1∶8 Pre-S2抗体,Pre-S2抗体产生比S抗体产生早,而S抗体产生较高持续时间较长(1∶10稀释的血清其RIA的P/N值为104-190)。
表2
M6细胞分泌乙肝疫苗免疫小鼠后前S2抗体的反应
Elisa检测前S2抗体的P/N值
鼠种
血清稀释
1:1 1:2 1:8
CBA 5.1 6.2 2.4
C57 5.9 5.0 2.2
C3H 5.4 7.0 2.0
615 5.0 5.3 2.2
NIH 3.8 2.8 2.1
Balb/c 4.0 2.1 未做
ICR - 未做
DBA/C - 未做
1.M.L.Michel et al.
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7708-7712,1984)
2.T.Lee,et al
Arch virol 106:151-158,1989.
3.Yasuaki Itoh and yukio Fujisawa
Biochemical and Biophysical Research Communications 141(3):942-948,1986
4.P.Dehoux et al
Gene 48:155-163,1986
5.T.Yoneyama et al
J.gen Virol 69:1931-1939.1988
6.L.Kutinova et al.
Arch Virol.112:181-193.1990.
7.M.W.Yu et al
J.of Medical virology 30:7-13,1990
8.Fiers.W.R.et al.
Nature 273:113,1978.
9.Banerji J.et al.Cell 27:299.1981
10.Wigler M.et al
Proc.Natl.Acid.Sei USA 76:1373.1979
11.Wigler M.et al.Cell 16:777,1979.
机译: 用稳定,高水平的转基因蛋白表达构建转基因哺乳动物细胞系的方法
机译: 具有生物活性的神经母蛋白多肽的生产方法,核酸,表达载体,药物组合物,细胞,致密细胞系,转基因非人类哺乳动物,可植入细胞培养装置,载体用途,治疗神经系统疾病的方法和神经母蛋白多肽
机译: 菌毛蛋白基因启动子序列及其在矢量,转化的哺乳动物细胞系,转基因动物和源自动物的细胞系中的应用