L-肉毒碱的微生物学制备方法

摘要

以三甲铵丁烯内酯及/或γ-三甲铵丁内酯为原料，用微生物学方法制造L-肉毒碱。

说明书

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人们已知，用r-三甲铵丁内酯（r-Butyrobotaine）作原料可以制造L-肉毒碱（L-Betain）。有一种工艺方法是，在有2-氧代戊二酸钠（Natrium-2-oxoglutarat）、还原剂、铁离子源及作为羟基供给体的空气氧存在下，使r-三甲铵丁内酯与由粗糙链孢霉孢子（Sporen von Neurospora crassa）释放出来的羟化酶相接触（美国专利说明书第43 71 618号）。这种工艺方法的缺点是需要很多辅助因素。于是乎在反应中要使化学计算量的2-氧代戊酸盐（2-Oxoglutarat）用氧化法脱去羧基、生成丁二酸盐（Succinat）。作为O₂的活化剂，需用Fe²⁺;为使铁离子保持还原态，需用抗坏血酸;为分解有害的痕迹量H₂O₂，需用过氧化氢酶（Katalase）。

林特施泰特（Lindstedt）等（Biochemistry 6，1262-1270（1967）“The Formation and Degradation of Carnitine in Pseudomonas”）分离出一种以r-三甲铵丁内酯为碳、氮来源而生长成的假单胞菌属微生物。降解过程的第一步反应是将r-三甲铵丁内酯经羟基化反应生成L-肉毒碱，并将中间存在的L-肉毒碱进一步完全分解代谢成CO₂、H₂O及NH₃。

即使利用这种由细菌制得的羟化酶（Hydroxylase）来制造L-肉毒碱，也仍存在上述需要辅助因素的缺点（Lindstedt    et    al，Biochemistry    16，2181-2188（1977）”Purificat-iom    and    Properties    of    r-Butyrobetaine    Hydrox-ylase    from    Pseudomonas    sp.AK    1”）。

本发明所赖以为基础的任务是找出一种新的微生物，这种微生物不具有上述已知工艺方法的缺点，并使人们有可能使用简单的方法以三甲铵丁烯内酯（Crotonobetain）、三甲铵丁内酯或其混合物为原料不制造外消旋盐，而制造有拮抗选择性的L-肉毒碱。

本发明的微生物不同于现有技术中已知系统的是，使用H₂O作为羟基供给体，而不使用O₂作为羟基供给体。这可以使用H¹⁸₂O及¹⁸O₂进行仔细的试验来证实。

本发明所发现的微生物有能力以三甲铵丁烯内酯及/或r-三甲铵丁内酯为原料来生产L-肉毒碱，而且不会将其分解代谢。

对取自四大洲的土壤样品进行了对比试验，正如试验结果所表明的那样，到处都存在将三甲铵丁内酯和三甲铵丁烯内酯经由L-肉毒碱进行行分解代谢的微生物。从废水处理设备的加菌淤渣中也可以成功分离出这类微生物。如果将这类微生物按照下面所述的本发明原理进行诱变，则有可能将所有这类菌种用来生产L-肉毒碱。

这种诱变种可以通过下列选择方法而得到：1）将以三甲铵乙内酯（Betain）、r-三甲铵丁内酯、三甲铵丁烯酯及L-肉毒碱为碳、氮来源生长的微生物用常规的方法进行诱变。2）从通过培养得到的已诱变的微生物培养物中选择出那些不分解代谢L-肉毒碱而且不依靠L-肉毒碱、三甲铵丁烯内酯、r-三甲铵丁内酯而仅依靠三甲铵乙内酯生长的稳定微生物。

最好在接着的选择步骤2）之后选择出那些分泌L-肉毒碱又不依靠L-肉毒碱、三甲铵丁烯内酯、r-三甲铵丁内酯而仅依靠三甲铵乙内酯生长的微生物。

相应地将那些已诱变过的微生物在三甲铵乙内酯培养基中继续培养并在进行选择步骤2）之前，将这些已继续培养过的微生物最好在L-肉毒碱培养基中继续培养。培养以三甲铵乙内酯、r-三甲铵丁内酯、三甲铵丁烯内酯及L-肉毒碱为碳、氮来源生长的菌种相宜地应这样进行，即通过三甲铵丁烯内酯营养液接种使混合培养物由细菌混合物产生出来、然后藉助传统的微生物学技术再用该混合培养物作原料对那些能降解三甲铵丁烯内酯的微生物进行纯培养。

这样一种以三甲铵乙内酯、r-三甲铵丁内酯、三甲铵丁烯内酯及L-肉毒碱作为碳、氮来源生长的培养物之诱变，可以按照已知的方法来进行〔J.H.Miller，Experiments    in    Molecular    Genetics，Cold    Spring    Harbor    Laboratory，1972〕。

制备稳定诱变种的那些合宜方法为移码法、缺失法或者转座子嵌入法。

然后，将这些经上述方法诱变过的微生物在三甲铵乙内酯培养基中进一步培养并在转移到L-肉毒碱培养基之后进行选择步骤2），在选择步骤2）中，藉助已知的“反选择剂”〔P.Gerhardtet    al（ads.），Manual    af    Methods    for    General    Bacterio-logy，Am.SOc.for    Microbiology，1981〕来选择那些始终不分解代谢L-肉毒碱且不依靠L-肉毒碱、三甲铵丁烯内酯、r-三甲铵丁内酯而依靠三甲铵乙内酯生长的微生物。

一种以三甲铵乙内酯、r-三甲铵丁内酯、三甲铵丁烯内酯、L-肉毒碱为碳、氮来源生长的较佳微生物是HK4菌种（DSM    Nr.2938）及其后代与诱变种。

这种菌种已於1984年3月3日以保藏号Nr.DSM    2938保藏在德意志联邦共和国4300    Goettingen市Griesebach街8号生物技术研究有限公司德意志微生物保藏所。

HK4（DSM    Nr.2938）菌种的科学描述

细胞形态    芽胞杆菌，Z测验多型

长度μm    1-2

宽度μm    0.5-0.8

成活力    +

鞭毛    周生

革兰氏反应    -

子    -

聚β-羟基丁酸酯的形成    -

氧化酶    +

催化酶    +

生长

厌氧菌    -

37℃    +

41℃    -

PH5.6    -

Mac-Conkey氏胆盐琼脂    +

SS-琼脂    -

Cetrimid氏琼脂    -

色素形成作用

不扩散    -

扩散    -

发萤光    -

成酸作用（OF测验）由：

葡萄糖需氧菌    -

厌氧菌    -

果糖需氧菌    -

ASS葡萄糖    +

木糖    +

海藻糖    +

乙醇    -

自葡萄糖的成气作用    -

ONPG    +

精氨酸双氢酶    -

赖氨酸脱羧酶    -

苯基丙氨酸脱氨酶    -

鸟氨酸脱羧酶    -

H₂S>

Voges-Proskauer氏反应    -

吲哚    -

硝酸盐变成亚硝酸盐    +

脱氮    +

左聚糖的形成    -

卵磷酯酶    -

脲酶    +

降解

淀粉    -

明胶    -

酪蛋白    -

酪氨酸    -

吐温80    -

脱氧核糖核酸（DNA）    +

七叶    +

基质的使用

醋酸盐    -

柠檬酸盐    -

丙酸盐    -

甘氨酸    -

己氨酸    -

木糖    +

果糖    +

葡萄糖    +

以H₂自养生物的生长>

3-内缩糖（3-Ketolactose）    -

生长

三甲铵乙内酯    +

L-肉毒碱    +

r-三甲铵丁内酯    +

三甲铵丁烯内酯    +

由上述微生物经诱变及选择后得一种较佳的微生物，它具有稳定性，不但不分解代谢L-肉毒碱反应分泌L-肉毒碱，不依靠L-肉毒碱、三甲铵丁烯内酯及r-三甲铵丁内酯而依靠三甲铵乙内酯生长，这就是HK    13。

这种菌种已於1984年1月23日以保藏号Nr。DMS    2903保藏在德意志联邦共和国4300    Goettingen市Griesebach街8号生物技术研究有限公司德意志微生物保藏所。

HK    13（DSM    Nr.2093）菌种的科学描述

细胞形态    芽胞杆菌，Z测验多型

长度μm    1-2

宽度μm    0.5-0.8

成活力    +

鞭毛    周生

革兰氏反应    -

孢子

聚β-羟基丁酸酯的形成    -

氧化酶    +

催化酶    +

生长

厌氧菌    -

37℃    +

41℃    -

PH    5.6    -

Mac-Conkey氏琼脂    +

SS-琼脂    -

Cetrimid-琼脂    -

色素形成作用

不扩散    -

扩散    -

发萤光    -

成酸作用（OF测验）由：

葡萄糖需氧菌    -

厌氧菌    -

果糖需氧菌    -

ASS葡萄糖    +

木糖    +

海藻糖    +

乙醇    -

自葡萄糖的成气作用    -

ONPG    -

精氨酸双氢酶    -

赖氨酸脱羧酶    -

苯基丙氨酸脱氨酶    -

鸟氨酸脱羧酶    -

H₂S>

Voges-Proskauer氏反应    -

吲哚    -

硝酸盐生成的亚硝酸盐    +

脱氮作用    +

左聚糖的形成    -

卵磷酯酶    -

脲酶    +

降解

淀粉    -

明胶    -

酪蛋白    -

酪氨酸    -

吐温80    -

DNA    +

七叶苷    +

基质的使用

醋酸盐    -

柠檬酸盐    -

丙酸盐    -

甘氨酸    -

己氨酸    -

木糖    +

果糖    +

葡萄糖    +

以H₂自养生物生长>

3-内缩糖    -

生长

三甲铵乙内酯    +

L-肉毒碱    -

r-三甲铵丁内酯    -

三甲铵丁烯内酯    -

L-谷氨酸盐与三甲

铵丁烯内酯    ±

L-谷氨酸盐与三甲

铵丁内酯    ±

L-谷氨酸盐与

L-肉毒碱    ±

作为HK    13微生物后代中的一个例子是HK    1331b菌种，该菌种具有稳定性，它不但不分解代谢L-肉毒碱反而分泌L-肉毒碱，它不依靠L-肉毒碱、三甲铵丁烯内酯及r-三甲铵丁内酯而依靠三甲铵乙内酯、L-谷氨酸盐与三甲铵丁烯内酯、L-谷氨酸盐与三甲铵丁内酯、L-谷氨酸盐与L-肉毒碱生长。

它作为在含有L-谷氨酸盐与r-三甲铵丁内酯、用琼脂凝固的一种营养基表面上自发的而且生长良好的诱变种菌落被分离出来的。

HK    1331（DSM    Nr.）菌种的科学描述

细胞形态    芽胞杆菌，Z测验多型

长度μm    1-2

宽度μm    0.5-0.8

成活力    +

鞭毛    周生

革兰氏反应    -

孢子    -

聚β-羟基丁酸酯的形成    -

氧化酶    +

催化酶    +

生长

厌氧菌    -

37℃    +

41℃    -

PH5.6    -

MaO-Conkey氏琼脂    +

SS-琼脂    -

Cetrimid氏琼脂    -

色素形成作用

不扩散    -

扩散    -

发萤光    -

成酸作用（OF测验）由：

葡萄糖需氧菌    -

厌氧菌    -

果糖需氧菌    -

ASS葡萄糖    +

木糖    +

海藻糖    +

乙醇    -

自葡萄糖形成气体    -

ONPG    +

精氨酸双氢酶    -

赖氨酸脱羧酶    -

苯基丙氨酸脱氨酶    -

鸟氨酸脱羧酶    -

H₂S>

Voges-Proskauer氏反应    -

吲哚    -

硝酸盐生成的亚硝酸盐    +

脱氮作用    +

左聚糖的形成    -

卵磷酯酶    -

脲酶    +

降解

淀粉    -

明胶    -

酪蛋白    -

酪氨酸    -

吐温80    -

DNA    +

七叶苷    +

基质的使用

醋酸盐    -

柠檬酸盐    -

丙酸盐    -

甘氨酸    -

木糖    +

果糖    +

葡萄糖    +

H₂的自养生物生长>

3-内缩糖    -

生长

三甲铵乙内酯    +

L-肉毒碱    -

r-三甲铵丁内酯    -

三甲铵丁烯内酯    -

L-谷氨酸盐与三甲

铵丁烯内酯    +

L-谷氨酸盐与三甲

铵丁酯    +

L-谷氨酸盐与L-肉

毒碱    +

制备L-肉毒碱的工艺以这样进行为宜，即将一种微生物（以名称为HK    13的微生物为佳）的预培养物在消毒过的最好含有维生素的矿物质培养基中〔Kulla    et    al，Arch    Microbiol    135，1（1983）〕於20°至40℃（30℃为佳）、合宜的PH6-8（7为佳）培养20-50小时（以30-40小时为好）。这种预培养物以含有0.1-10%（重量）（0.5-5%更好）的胆碱、谷氨酸盐、醋酸盐、二甲基甘氨酸或三甲铵乙内酯作为生长质为宜。使用0.5-5%（重量）三甲铵乙内酯尤佳。

然后，向预培养物中添加所要进行反应的原始化合物r-三甲铵丁内酯、三甲铵丁烯内酯或其混合物，添加量为反应介质的0.1-10%（重量比），以0.5-5%（重量比）为佳，这些都是微生物学技术上通常的做法。r-三甲铵丁内酯或三甲铵丁烯内酯可以是它们的盐酸盐、游离内盐及其衍生物。

用按上述工艺方法所制得的预培养物可以进一步接种培养物。这些进一步的培养物以具有与预培养相同组成为宜。

所要进行转化的三甲铵丁烯内酯、r-三甲铵丁内酯或其混合物之浓度为0.1-10%（重量比），0.5-5%（重量比）更好。

生长基质胆碱、谷氨酸盐、醋酸盐、三甲基甘氨酸及三甲铵乙内酯乙内酯的浓度也以预培养时所使用的浓度为宜。

进一步培养的培养条件与预培养的培养条件相同是有好处的。

因此，温度以在20℃及40℃之间变动为宜，最好在30℃，而且PH值一般保在6与8之间，最好为7。

用该方法进行的L-肉毒碱生产在20-30小时之后停止下来。L-肉毒碱的浓度则一般与所使用的r-三甲铵丁内酯或三甲铵丁烯内酯的量相当。

可以将细胞离心分离出来或过滤分离出来，并可将其用作重新培养的接种材料。

用本身已知的方法〔J.P.Vandecasteele，Appl    Envir-on    Microbiol    39，327（1980）〕，可以藉助阳离子交换剂色层分离法从吸附物中获得L-肉毒碱，并用重结晶方法将之提纯。

该制备L-肉毒碱的工艺方法也可以用连续生产法来实施。此时，使用细胞在恒化器中以0.04-0.2h^-1的适用稀释比在与分批培养时相似的条件下生长，较佳稀释比为0.06-0.08h^-1。

实施例1

分解代谢三甲铵丁烯内酯的微生物之分离

将微生物用中性磷酸盐溶液经搅拌从土壤中萃取出来，随后将较大颗粒的成分用滤纸分离掉，并用所得到的细菌混合物给三甲铵丁烯内酯进行接种，直到出现轻度混浊为止。九天以后，表示细菌浓度的混浊度增长九倍。溶液中的三甲铵丁烯内酯完全消失，并且可以检测出分解代谢的产物是氨。

由该混合培养物藉助传统的微生物学技术（凝固的琼脂培养基）继而进行分解三甲铵丁烯内酯之微生物的纯培养。为进行进一步处理而选择出来的一种培养物被命名为HK₄。

这种菌种也是依靠r-三甲铵丁内酯、L-肉毒碱及三甲铵乙内酯来生长的。

实施例2

对稳定的肉毒碱脱氢酶呈阴性的诱变种之分离

这样的诱变种应该不能进一步分解代谢由r-三甲铵丁内酯或三甲铵丁烯内酯所形成的L-肉毒碱，而在理想的情况下则能分泌出L-肉毒碱。

将HK4的一种培养物用“啶诱变剂ICR    191”（每毫升5微克）在丁二酸酯培养基中按照规定〔J.H.Miller，Experiments    inMolecular    Genetios，Cold    Spring    Harbor    Laborat-ory，1972〕进行稳定的诱变处理。然后，让细胞根据标准在“营养肉汁”中生长到表现出诱变为止。接着，转移到三甲铵乙内酯培养剂中。将一种L-肉毒碱培养基用充分生长的培养物接种。

在数小时后，该培养物以对数速度生长。此时，添加青霉素G（15毫克/毫升）及D-环丝氨酸（0.5毫克/毫升）〔Ornston    et    nl，Biochim    Biophys    Res.Commun36，179（1969）〕。这些“反选择”剂只杀死生长着的细菌。不能再依靠L-肉毒碱生长并令我们感兴趣的那些诱变种就活了下来，并因此而相对地浓集起来。在30小时后，活细胞数降低到百分之一，洗涤除去抗生素并将培养物转移到三甲铵乙内酯培养基中。在生长之后，将培养物的相应稀释物分散到凝固了的营养琼脂上。这些如此零星分散的细胞生长起来成为菌落，并被逐一检验。将HK13诱变种选择出来，它稳定地不再有肉毒碱脱氢酶，并因此不再依靠L-肉毒碱、r-三甲铵丁内酯或三甲铵丁烯内酯而依靠三甲铵乙内酯来生长。在依靠三甲铵乙内酯、二甲基甘氨酸、胆碱、谷氨酸盐或醋酸盐生长时，该菌种将三甲铵丁烯内酯或r-三甲铵丁内酯转变成L-肉毒碱并将分泌出来。

实施例3

将5升HK13的预培养物在含有维生素及1%（重量）三甲铵乙内酯与5%（重量）氯化三甲铵丁烯内酯的矿物质培养基中〔Kulla el al，Arch Microbiol 135，1（1983）〕，在温度为30℃、PH为7.0的情况下进行培养，时间在32小时之内。用此方法将15升相同组成的培养物接种，并与预培养（30℃、PH7.0、PO₂＝3ppm）一样培养24小时。当生产停止下来时，用离心法分离出细胞，分离出来的细胞可用作后一批培养的接种材料。上清液（19.8升）中的L-肉毒碱浓度用酶僱分析法来测定。

上清液含有4.26毫克/毫升的L-肉毒碱。以所用的氯化三甲铵丁烯内酯汁，这相当于产率为95.0%。用核磁共振谱可以证明不存在离析物或其它杂质。

如前所述〔J.P.Vandecasteele，Appl    Environ    Mic-robiol    39，327（1980）〕，可藉阳离子交换色层分离法从上清液中分离出L-肉毒碱并用重结晶法予以提纯。

实施例4

将5升HK13预培养物在含有1%胆碱及0.6%r-氯化三甲铵丁内酯并会有维生素的矿物质培养基（同实施例1）在PH    7.0及30℃时培养32小时。用该予培物对15升相同组成培养基的培养物接种并在与实施例相同的条件下进行培养。

当在约30小时以后生产停止下来时，用微量过滤法（Amicon空心纤维滤芯）将细胞分离出来。这种细胞质可以用于进一步生产L-肉毒碱。用酶僱法测定滤液（19.6升）中的L-肉毒碱浓度。该滤液含有L-肉毒碱5.3毫克/升。以所用的氯化r-三甲铵丁内酯汁，这相当于97.6%的产率。

根据核磁共振（NMR）分析，滤液中检测不到任何离析物或其它异质有机副产物。因此，可以用已知的方法，例如用共沸蒸馏法（第2300492号联邦德国专利说明书）将L-肉毒碱从溶液中分离出来。

实施例5

将连续培养所必需的发酵桶用150毫升相同培养基的HK    13预培养物接种，该发酵桶容有1.5升含维生素的矿物质培养基（同实施例1）及1.5%三甲铵乙内酯与1.0%氯化r-三甲铵丁内酯。经在30℃及PH    7.0时的20小时需氧培养后，培养物生长充分，然后可以0.1升/小时的流量开始连续运转。将从发酵桶中流出的培养液接收在冷却到4℃的容器中。用离心法分离出细胞。

根据酶僱法分析，每升培养物中，上清液含有8.8克L-肉毒碱。

以所用的氯化r-三甲铵丁内酯浓度计，这相当于分析检测的产率为99.2%。

藉离子色层法及脱水法可以从溶液中分离出固态的L-肉毒碱氯化物。